Optogenetica bioluminescente 2.0: sfruttare la bioluminescenza per attivare proteine fotosensoriali in vitro e in vivo
4 agosto 2021
La bioluminescenza - la luce emessa da un enzima luciferasi che ossida un substrato di piccole molecole, una luciferina - può essere sfruttata per attivare le proteine fotosensoriali, aggiungendo così un'altra dimensione alla stimolazione della luce e consentendo la manipolazione di una moltitudine di funzioni mediate dalla luce nelle cellule attraverso scale temporali e spaziali.
1 (toni elettronici) L'optogenetica bioluminescente è una tecnologia di piattaforma in cui le sorgenti luminose geneticamente codificate possono visualizzare e controllare le funzioni e le reti biologiche all'interno e tra le cellule. La bioluminescenza raggiunge ogni dominio di rilevamento della luce espresso nella popolazione cellulare bersaglio senza alcun danno tissutale e cellulare da fibre ottiche e un'esposizione prolungata alla luce fisica. Per iniziare, inizia a preparare lo stock di Luciferina sciogliendo cinque milligrammi di CTZ liofilizzato in 250 microlitri del rispettivo solvente.
Garantire la dissoluzione del CTZ lungo le pareti mediante pipettaggio. Mentre si protegge il flaconcino dalla luce diretta, preparare aliquote da 50 microlitri in tubi microcentrifuga neri da 0,5 millilitri e conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Eseguire tutte le ulteriori manipolazioni in una stanza a tenuta di luce in una cappa a flusso laminare illuminata da luce rossa.
Per eseguire una singola stimolazione luminosa a bioluminescenza, preparare una soluzione di lavoro di Luciferina in un terreno di coltura cellulare, poco prima di aggiungere alle cellule ad una concentrazione finale di 100 micromolari. Aggiungere il mezzo contenente Luciferina alle cellule e incubare per la durata desiderata della stimolazione luminosa. Spegnere la luce rossa.
Dopo aver atteso alcuni secondi fino a quando gli occhi non si sono adattati alla completa oscurità, monitorare l'emissione luminosa a occhio. Documentare l'emissione luminosa scattando una fotografia. Terminare la stimolazione luminosa sostituendo il mezzo contenente Luciferina con il mezzo di coltura, quindi lavare le cellule con il terreno di coltura una o due volte per eliminare tutta la Luciferina a seconda della sensibilità dell'esperimento.
Per evitare la perdita cellulare, placcare le cellule su piatti rivestiti di PDL e incubare le cellule. Per eseguire ripetute stimolazioni luminose a bioluminescenza, impostare la camera di imaging delle cellule vive creando un compartimento a tenuta di luce attorno al microscopio di imaging a cellule vive utilizzando una scatola e fogli neri. Assicurarsi di coprire tutte le sorgenti luminose presenti all'interno della stanza.
Impostare il sistema di perfusione con la soluzione desiderata per l'aspirazione e l'uscita della camera che porta a un contenitore per i rifiuti. A seconda del numero di stimolazioni ripetute, aliquotare la soluzione di imaging luciferina funzionante preparata nei tubi microcentrifuga. Posizionare un coverslip con cellule trasfettate nella camera.
Mantenendo la pompa in funzione, rimuovere il tubo di ingresso della pompa dal becher di aspirazione. Immergere rapidamente il tubo di ingresso nella soluzione di Luciferina, mantenendo il tempo di transizione breve per evitare qualsiasi vuoto d'aria nel tubo. Non appena la soluzione di Luciferina è stata ripresa, riposizionare il tubo di ingresso nel becher di aspirazione.
Ripetere la rimozione e l'immersione del tubo di ingresso in Luciferina tutte le volte che è necessario ad intervalli di diversi minuti o ore a seconda del modello fisiologico a cui le cellule dovrebbero essere esposte. Quindi mantenere le cellule in un ambiente protetto dalla luce per 16-24 ore per la trascrizione o la durata fino a quando non viene valutato l'effetto della stimolazione luminosa. Per eseguire l'attivazione della bioluminescenza in vivo, preparare Luciferina prelevando una fiala CTZ da meno 80 gradi Celsius, quindi lasciarla riscaldare a temperatura ambiente nell'area protetta dalla luce.
Per ogni flaconcino contenente 500 microgrammi di CTZ, aggiungere 250 microlitri di acqua sterile usando una pipetta e rimettere il tappo di gomma sul flaconcino. Incubare il flaconcino di vetro ricostituito a bagnomaria temperato a 55 gradi Celsius per alcuni minuti per sciogliere completamente la polvere. Trasferire la soluzione in un tubo microcentrifuga nero e risciacquare le pareti per recuperare tutto il CTZ.
Dopo aver rimosso la quantità di soluzione necessaria, conservare la soluzione rimanente a quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato, ricostituito e aliquotato il veicolo in modo simile, preformare la stimolazione della luce a bioluminescenza rimuovendo il volume di Luciferina o veicolo necessario per le dimensioni dell'animale e il percorso di applicazione scelto. Iniettare l'animale con Luciferina o veicolo come progettato.
Per l'attivazione desiderata della ricombinasi durante uno specifico paradigma comportamentale, iniettare l'animale appena prima del test comportamentale. Per la trascrizione fasica, iniettare l'animale ripetutamente per giorni e raccogliere i dati dall'animale stimolato dalla bioluminescenza come progettato. Il sistema di espressione veloce regolato dalla luce e dall'attività ha permesso la trascrizione del gene reporter con un aumento degli ioni calcio intracellulari e della luce.
Il LED blu ha portato a una robusta fluorescenza reporter e l'espressione FLuc è stata determinata da misurazioni di luminescenza dopo l'aggiunta di Luciferina. In un sistema di imaging in vivo, sia LED che CTZ hanno aumentato in modo robusto l'espressione FLuc, mentre la presenza della sola componente del fattore di trascrizione ha provocato un notevole segnale di fondo, probabilmente a causa della proteolisi spontanea. NanoLuc è stato impiegato per la regolazione optogenica attraverso la dimerizzazione CRY/CIB e il fattore di trascrizione fotosensibile EL222.
La bioluminescenza indotta dall'aggiunta di hCTZ alle cellule HEK-293 e la sua rimozione dopo 15 minuti è stata più efficiente di 20 minuti di esposizione ai LED per CRY/CIB e EL222. Non sono state osservate differenze significative nell'efficacia della trascrizione tra i due sistemi quando co-trasfettati con hCTZ, sebbene le proteine di fusione di CRY/CIB fossero più efficienti di EL222. CRY/CIB ha mostrato livelli di fondo costantemente più elevati rispetto a EL222 indipendentemente dalla concentrazione di hCTZ.
È stata testata la bioluminescenza di una Cre ricombinasi split fotosensibile basata sulla proteina VVD LOV iCreV. I risultati dell'applicazione CTZ hanno rivelato che la presenza di CTZ ha aumentato in modo robusto l'espressione sullo sfondo ed è simile all'applicazione LED. L'uso della bioluminescenza per attivare non solo i fotorecettori in movimento di ferro, ma qualsiasi dominio fotosensoriale aggiunge un'altra dimensione alla stimolazione della luce espandendo la manipolazione delle funzioni cellulari su scale temporali e spaziali.
L'optogenetica bioluminescente è stata applicata in cellule e organismi modello. Questi protocolli possono essere personalizzati per testare una vasta gamma di ipotesi dirette in vitro e in vivo.
Panoramica
L'optogenetica bioluminescente utilizza sorgenti luminose codificate geneticamente per controllare funzioni biologiche senza danneggiare i tessuti. Questo metodo consente una manipolazione precisa delle attività cellulari su diverse scale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Bioluminescenza
- Optogenetica
- Manipolazione cellulare
Sfondo
- La bioluminescenza è prodotta da enzimi luciferasi che ossidano la luciferina.
- Questa tecnologia consente la stimolazione luminosa delle cellule senza esposizione fisica alla luce.
- Può essere applicata sia in contesti in vitro che in vivo.
- La stimolazione luminosa può attivare diverse funzioni cellulari e vie di segnalazione.
Scopo dello studio
- Esplorare l'uso della bioluminescenza per il controllo di funzioni cellulari.
- Sviluppare protocolli per la stimolazione luminosa in diversi allestimenti sperimentali.
- Valutare l'efficienza della bioluminescenza rispetto ai metodi optogenetici tradizionali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione delle soluzioni stock e di lavoro della luciferina.
- Protocolli di stimolazione luminosa bioluminescente singola e ripetuta.
- Tecniche di attivazione bioluminescente in vivo.
- Misurazione della luminescenza e della fluorescenza in cellule trasfettate.
Risultati principali
- La stimolazione della bioluminescenza attiva efficacemente le funzioni cellulari.
- L'aggiunta di luciferina ha determinato un'espressione robusta del gene reporter.
- La bioluminescenza si è rivelata più efficiente dell'esposizione a LED per alcune applicazioni.
- Le proteine di fusione CRY/CIB hanno mostrato livelli di fondo più elevati rispetto a EL222.
Conclusioni
- La optogenetica bioluminescente amplia le capacità della stimolazione luminosa.
- Questo metodo può essere personalizzato per diverse ipotesi sperimentali.
- Fornisce un approccio non invasivo per manipolare le attività cellulari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'optogenetica bioluminescente consente un'attivazione precisa e non invasiva di proteine fotosensibili sia in sistemi in vitro che in vivo, ampliando gli strumenti disponibili per l'analisi funzionale delle vie cellulari. Questa piattaforma permette di manipolare in modo guidato da ipotesi i processi cellulari mediati dalla luce, superando i limiti associati alla somministrazione di luce esterna, aumentando così la fiducia predittiva negli studi di scoperta precoce e di caratterizzazione meccanicistica. La sua modularità e compatibilità con diversi domini fotosensibili ne fanno una capacità riutilizzabile per la riduzione del rischio biologico su tutta la linea di prodotti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi diretta di vie sensibili alla luce e delle funzioni proteiche in contesti cellulari nativi.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistico permettendo l'attivazione controllata di segnalazioni, localizzazioni ed eventi trascrizionali.
- Semplifica la validazione funzionale delle proteine bersaglio mediante il controllo chemogenetico di proteine fotosensibili.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una somministrazione di luce standardizzata e riproducibile mediante sistemi luciferasi-luciferina per lo sviluppo di saggi.
- Consente letture quantitative dell'espressione del gene reporter e dell'attivazione del percorso.
- Permette lo screening su scala ampliabile di composti o perturbazioni genetiche in sistemi sensibili alla luce.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette la manipolazione in vivo delle funzioni cellulari in organismi modello per studi rilevanti per le malattie.
- Facilita l'allineamento tra risultati in vitro e in vivo attraverso protocolli di attivazione bioluminescente costanti.
- Supporta un avanzamento basato sulla valutazione del rischio, consentendo studi funzionali robusti e non invasivi su diversi modelli biologici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa tecnologia si integra dalla fase iniziale della scoperta fino alla ricerca preclinica, consentendo la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi metabolici e la validazione funzionale sia in modelli cellulari che animali.
- Biologia della scoperta: Supporta l'attivazione mirata e la misurazione della funzione di proteine fotosensibili per l'elucidazione di vie metaboliche.
- Screening: Fornisce output riproducibili e quantitativi per la standardizzazione dei saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni di luminescenza e fluorescenza per confrontare condizioni di attivazione e relativi output.
- Ricerca traslazionale: Collega studi in vitro e in vivo mediante strategie di attivazione coerenti per l'allineamento di biomarcatori e funzionalità.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare adattabile a diversi paradigmi sperimentali e domande biologiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi mediati dalla luce.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo studi funzionali robusti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione corretta rispetto al rischio in diversi programmi di scoperta.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare, optogenetica e gestione di cellule vive o animali.
- Necessita dell'accesso a sistemi di imaging a luminescenza e a ambienti luminosi controllati.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella scelta della coppia luciferasi-luciferina e nei protocolli di attivazione.
- Adattabile a diversi tipi cellulari e organismi modello mediante personalizzazione del protocollo.
- È necessaria un'attenta valutazione del segnale di fondo e dell'efficienza di fusione proteica per una progettazione ottimale del saggio.
