Name: Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Impara a determinare la localizzazione submitocondriale delle proteine mitocondriali nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo consente di studiare la funzione delle proteine mitocondriali in vivo.

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Ringraziamo il Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) per aver fornito anticorpi sollevati contro le proteine marcatori submitocondriali Cyt. b2, αKGD e Sco1. Ringraziamo anche il Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) per l'utile discussione e commenti durante l'istituzione di questo protocollo.
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (sovvenzione 2013/07937-8).
Fernando Gomes e Helena Turano sono supportati anche da FAPESP, sovvenzioni 2017/09443-3 e 2017/23839-7, rispettivamente. Angélica Ramos è anche supportata da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

1. Crescita delle cellule di lievito
<ol><li>Isolare singole colonie del ceppo di interesse strisciando una piccola porzione delle cellule da uno stock di glicerolo a -80 °C su una piastra di agar YPD (1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% glucosio). Incubare la piastra a 30 °C per 2-3 giorni. NOTA: Il ceppo S. cerevisiae utilizzato in questo protocollo è derivato da BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Ad eccezione dei geni marcatori auxotrofici, questo ceppo non contiene alcun gene cancellato e non trasporta alcun plasmide. Pertanto, può essere coltivato con successo in un mezzo ricco, stimolando la crescita cellulare vigorosa. Quando si lavora con ceppi trasformati con plasmidi, utilizzare il mezzo minimo appropriato per la selezione del plasmide.</li>
	<li>Preparare una coltura iniziale inoculando 2-3 singole colonie dalla piastra di agar YPD in 10-20 ml di mezzo YPGal (1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% galattosio) in un matraccio Erlenmeyer da 100 ml. Incubare a 30 °C per 24 ore con agitazione vigorosa. NOTA: La scelta del mezzo di coltura dipende dal ceppo di lievito utilizzato nel protocollo. Sia YPD che YPGal contengono fonti di carbonio fermentabile, che consentono la crescita di ceppi che non eseguono la respirazione mitocondriale. Tuttavia, poiché il glucosio reprime l'espressione di molti geni mitocondriali, non è consigliabile utilizzare questa fonte di carbonio poiché produrrà quantità inferiori di mitocondri. Quando si lavora con ceppi respiratori competenti che possono respirare, è anche possibile utilizzare fonti di carbonio come glicerolo ed etanolo nel tentativo di ottenere una maggiore resa dei mitocondri.</li>
	<li>Diluire la coltura iniziale in 1 L di mezzo YPGal fresco a un OD600 inferiore a 0,1. Coltivare le cellule a 30 °C con un vigoroso scuotimento fino a quando OD600 raggiunge 1-1,5. NOTA: Determinare il tasso di crescita (tempo di raddoppio) per ogni ceppo di lievito prima di eseguire l'esperimento. Ciò fornirà una stima accurata del tempo di incubazione necessario affinché la coltura raggiunga un OD600 di 1-1,5.</li>
</ol>2. Isolamento di mitocondri altamente purificati
NOTA: questo protocollo è adattato da17, con piccole modifiche.
<ol><li>Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le celle con acqua distillata e raccoglierle per centrifugazione a 3.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Determinare il peso umido delle cellule. NOTA: Il modo più semplice per misurare il peso del pellet di cella dal passaggio 2.2 è determinare il peso del tubo della centrifuga vuoto poco prima della raccolta delle celle. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e misurare il peso dello stesso tubo con le cellule. Il peso delle celle è la differenza tra le due misurazioni.</li>
	<li>Risospesciare le celle nel tampone DTT (2 mL per 1 g di celle) utilizzando una pipetta Pasteur o una punta P5000. Vedere la Tabella 1 per la composizione del buffer DDT.</li>
	<li>Incubare le celle a 30 °C per 20 minuti con un leggero scuotimento (~70 rpm).</li>
	<li>Centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettizzare le celle.</li>
	<li>Lavare le cellule con tampone di zipoliasi senza l'enzima (circa 7 ml per 1 g di cellule). Vedere Tabella 1 per la composizione del tampone di zymolyase.</li>
	<li>Centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettizzare le celle.</li>
	<li>Risospendare le cellule nel tampone senza zymolyase (7 mL per 1 g di cellule).</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL e aggiungere Zymolyase-20T (3 mg per g di peso umido).</li>
	<li>Incubare le celle a 30 °C per 30-40 minuti con un leggero scuotimento (~70 rpm). Controllare l'efficienza di questo processo confrontando la torbidità della sospensione cellulare prima e dopo il trattamento con zymolyase. NOTA: In questa fase, le cellule saranno convertite in sferoplasti a causa della digestione della parete cellulare da parte della zipoliasi.<ol>
<li>Per questo, aggiungere 50 μL di ciascuna sospensione cellulare a tubi di vetro separati contenenti 2 ml di acqua. Dopo aver miscelato vigorosamente, la torbidità della sospensione cellulare trattata con Zymolyase dovrebbe diminuire rapidamente a causa della rottura osmotica degli sferoplasti. D'altra parte, la torbidità della sospensione cellulare non trattata dovrebbe rimanere invariata. NOTA: Gli effetti della torbidità possono anche essere monitorati con una semplice ispezione visiva o misurando l'OD600 di entrambi i campioni. Nel secondo caso, l'OD600 del campione trattato con zipoliasi deve essere pari al 10%-20% del campione non trattato. Un metodo alternativo prevede il conteggio delle cellule in entrambi i campioni utilizzando la microscopia ottica.</li>
		<li>Se la resa della formazione di sferoplasti è bassa, aggiungere più zymolyase e incubare per un ulteriore intervallo di 15 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogliere gli sferoplasti per centrifugazione a 2500 x g per 5 min a 4 °C. NOTA: Tutte le ulteriori fasi devono essere eseguite rapidamente e su ghiaccio o a 4 °C per evitare la degradazione delle proteine da parte degli enzimi idrolitici.</li>
	<li>Lavare due volte gli sferoplasti con tampone di omogeneizzazione ghiacciato (circa 6,5 mL per 1 g di celle) e pellet centrifugando a 2.500 x g per 5 min a 4 °C. Vedere la Tabella 1 per la composizione del buffer di omogeneizzazione.</li>
	<li>Risospese gli sferoplasti in un tampone di omogeneizzazione ghiacciato (6,5 ml per 1 g di cellule) e trasferirlo in un omogeneizzatore Dounce in vetro pre-refrigerato. Utilizzare un grande omogeneizzatore di vetro di circa 30 ml.</li>
	<li>Omogeneizzare gli sferoplasti con 15 colpi usando un pestello. NOTA: il numero di colpi deve essere regolato in base al raccordo del pestello. Per il pestello stretto, sono sufficienti 15 colpi. D'altra parte, se si utilizza un pestello sciolto, si consiglia di eseguire fino a 25 colpi.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato in un tubo centrifugo da 50 ml e aggiungere 1 volume di tampone di omogeneizzazione ghiacciato.</li>
	<li>Centrifugare l'omogeneizzato a bassa velocità, 1.500 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare nuclei, detriti cellulari e celle ininterrotte.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in un nuovo tubo di centrifuga da 50 ml utilizzando una pipetta Pasteur o una punta P5000 avendo cura di evitare di interrompere il pellet.</li>
	<li>Centrifugare a 4.000 x g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in un tubo centrifugo ad alta velocità e centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C per pellettizzare la frazione dei mitocondri grezzi.</li>
	<li>Scartare il surnatante e lavare delicatamente il pellet mitocondriale grezzo in 20-30 ml di tampone di omogeneizzazione ghiacciato mediante un delicato pipettaggio utilizzando una punta P5000.</li>
	<li>Trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 50 mL e centrifugare a 4.000 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettizzare i detriti cellulari rimanenti.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in un tubo centrifugo ad alta velocità e centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C per pellettizzare la frazione dei mitocondri grezzi.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospescere delicatamente il pellet mitocondriale grezzo in un piccolo volume (tipicamente 1000 μL) di tampone SEM ghiacciato mediante un delicato pipettaggio utilizzando una punta P1000. Vedere la Tabella 1 per la composizione del buffer SEM. NOTA: Sebbene questa frazione mitocondriale grezza possa essere utilizzata direttamente in alcune applicazioni come nei saggi di importazione di proteine organello , contiene quantità sostanziali di altri componenti cellulari. Queste contaminazioni potrebbero portare a interpretazioni errate dei risultati nel determinare la localizzazione sottocondriale di una proteina. Pertanto, sono necessarie ulteriori fasi di purificazione per ottenere una preparazione mitocondriale altamente purificata, come descritto di seguito.</li>
	<li>Preparare soluzioni di saccarosio nel tampone EM a concentrazioni del 60%, 32%, 23% e 15% (p/v). Queste soluzioni sono stabili fino a 1 mese a 4 °C. Vedere la Tabella 1 per la composizione del buffer EM.</li>
	<li>Preparare un gradiente di saccarosio in 4 fasi in un tubo ultracentrifuga come segue: Posizionare 1,5 mL di saccarosio al 60% (p/v) sul fondo del tubo della centrifuga. Successivamente, pipettare accuratamente gradualmente: 4 mL del 32%, 1,5 mL del 23% e 1,5 mL del 15% di saccarosio (p / v). Fare attenzione ad evitare di interrompere le fasi.</li>
	<li>Caricare con attenzione la frazione mitocondriale grezza sopra il gradiente di saccarosio.</li>
	<li>Centrifuga per 1 ora a 134.000 x g a 4 °C in un rotore a benna oscillante.</li>
	<li>Continuare con cautela a rimuovere la soluzione di saccarosio fino a raggiungere la frazione mitocondriale altamente purificata che è rappresentata da una banda marrone all'interfaccia del 60%/32% di saccarosio.</li>
	<li>Recuperare i mitocondri purificati utilizzando una punta tagliata P1000 e metterlo in un tubo centrifugo ad alta velocità pre-refrigerato.</li>
	<li>Diluire i mitocondri recuperati con 5-10 volumi di tampone SEM ghiacciato.</li>
	<li>Centrifuga per 30 min a 12.000 x g a 4 °C.</li>
	<li>Risospesciare i mitocondri puri in 500 μL di tampone SEM ghiacciato mediante un pipettaggio delicato utilizzando una punta tagliata P1000.</li>
	<li>Determinare la concentrazione proteica del preparato mitocondriale altamente purificato utilizzando la procedura Bradford seguendo le istruzioni del produttore. Regolare la concentrazione proteica a 10 mg di proteine/mL con tampone SEM ghiacciato. NOTA: Per il protocollo di frazionamento submitocondriale descritto di seguito, si consiglia di utilizzare mitocondri preparati al momento. Tuttavia, Vögtle e collaboratori hanno eseguito un'analisi dettagliata del controllo di qualità dell'integrità mitocondriale e hanno dimostrato che gli organelli congelati possono essere utilizzati anche in questo protocollo13. Per questo, fare aliquote di 40 μL e congelarle in azoto liquido. Conservare a -80 °C.</li>
</ol>3. Protocollo di frazionamento submitocondriale
NOTA: Questo protocollo è adattato dal riferimento18 ed è composto da due fasi: (1) gonfiore ipotonico in presenza o assenza di proteinasi K e (2) sonicazione seguita da estrazione carbonatica. Eseguire tutti i passaggi di entrambi i protocolli su ghiaccio o a 4 °C per evitare la degradazione delle proteine.
<ol><li>Gonfiore ipotonico in presenza di proteinasi K
	<ol>
<li>Trasferire 40 μL di mitocondri altamente purificati a 10 mg/mL (400 μg) in quattro tubi microcentrifuga marcati pre-refrigerati da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 360 μL di tampone SEM nei tubi 1 e 2.</li>
		<li>Aggiungere 360 μL di tampone EM nei tubi 3 e 4.</li>
		<li>Aggiungere 4 μL di proteinasi K (10 mg/mL) nelle provette 2 e 4. Utilizzare lo schema di pipettaggio elencato nella Tabella 2 per evitare errori. NOTA: Preparare una soluzione da 10 mg/mL di proteinasi K in acqua immediatamente prima dell'uso. La concentrazione finale di proteinasi K nell'esperimento dovrebbe essere di circa 50-100 μg/mL. Si prega di consultare la sezione Discussione per ulteriori dettagli.</li>
		<li>Mescolare delicatamente tutti i tubi e incubare su ghiaccio per 30 minuti con miscelazione occasionale.</li>
		<li>Aggiungere 4 μL di PMSF 200 mM a tutti e quattro i tubi per fermare l'attività della proteinasi K. ATTENZIONE: PMSF è altamente tossico. Indossare guanti quando si lavora con soluzioni contenenti PMSF.</li>
		<li>Centrifugare a 20.000 x g per 30 min a 4 °C.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo microcentrifuga etichettato pre-refrigerato da 1,5 ml. Fare attenzione ad evitare di interrompere il pellet. NOTA: il pellet può essere risospeso direttamente nel buffer del campione per ulteriori analisi SDS-PAGE e western blot. Tuttavia, tracce di proteinasi K possono rimanere attive anche dopo il trattamento con PMSF e alla fine possono digerire alcune proteine dopo che il pellet è stato sciolto nel tampone campione contenente SDS. Per evitare questo problema, la proteinasi K potrebbe essere completamente inattivata dal trattamento dei campioni con acido tricloroacetico (TCA) come descritto di seguito. ATTENZIONE: il TCA è altamente tossico. Indossare guanti quando si lavora con soluzioni contenenti TCA.</li>
		<li>Risospesare il pellet dal punto 3.1.8 in 400 μL di tampone SEM ghiacciato.</li>
		<li>Precipitare il surnatante (dal passo 3.1.8) e il pellet risospeso (dal passo 3.1.9) con TCA ad una concentrazione finale del 10% (p/v).</li>
		<li>Incubare tutti i tubi sul ghiaccio per 10 minuti.</li>
		<li>Centrifugare i campioni trattati con TCA per 10 minuti a 12.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet in 200 μL di tampone campione. NOTA: È possibile che l'indicatore di pH blu bromofenolo diventi giallo a causa del trattamento acido. Se ciò accade, aggiungere piccole aliquote (1-5 μL) di 1 M Tris base fino a quando non diventa blu.</li>
		<li>Aggiungere 4 μL di PMSF da 200 mM a tutti i tubi.</li>
		<li>Conservare tutti i campioni a -80 °C fino a ulteriori analisi da parte di SDS-PAGE e western blot.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonicazione ed estrazione carbonatica NOTA: In questo protocollo, non è necessario utilizzare mitocondri appena preparati una volta che la sonicazione provoca la rottura delle membrane mitocondriali.<ol>
<li>Trasferire 200 μL di mitocondri altamente purificati a 10 mg/mL (2 mg di proteine) in un tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 mL.</li>
		<li>Mitocondri diluiti di una volta con tampone SEM ghiacciato.</li>
		<li>Mitocondri sonicati per 3 x 30 s su ghiaccio. Utilizzare un sonicatore compatibile per piccoli volumi.</li>
		<li>Centrifugare il campione per 30 minuti a 100.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 mL. Tienilo sul ghiaccio. Questo campione sarà denominato frazione proteica solubile (S).</li>
		<li>Risospesciare il pellet dal punto 3.2.4 in 400 μL di tampone SEM ghiacciato.</li>
		<li>Prelevare 100 μL del pellet risospeso dal punto 3.2.6 e trasferirlo in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 mL. Tienilo sul ghiaccio. Questo campione sarà denominato frazione di particelle submitocondriali (SMP).</li>
		<li>Diluire i restanti 300 μL dal punto 3.2.6 di una volta con carbonato di sodio da 200 mM appena preparato.</li>
		<li>Incubare il campione dal passaggio 3.2.8 sul ghiaccio per 30 minuti.</li>
		<li>Centrifugare il campione per 30 minuti a 100.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante e trasferirlo in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 mL. Tienilo sul ghiaccio. Questo campione sarà chiamato frazione surnatante carbonatica (CS).</li>
		<li>Risospesciare il pellet dal punto 3.2.10 in 400 μL di tampone SEM ghiacciato. Questo campione sarà denominato frazione precipitata carbonatica (CP).</li>
		<li>Precipitare tutti i campioni (S, SMP, CS e CP) con TCA ad una concentrazione finale del 10% (p/v).</li>
		<li>Incubare tutti i tubi sul ghiaccio per 10 minuti.</li>
		<li>Centrifugare i campioni trattati con TCA per 10 minuti a 12.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e risospesare ogni pellet nel tampone del campione. Se il tampone del campione diventa giallo, aggiungere piccole aliquote (1-5 μL) di 1 M Tris base fino a quando non diventa blu.</li>
		<li>Aggiungere 1 μL di PMSF da 200 mM a tutti i tubi.</li>
		<li>Conservare tutti i campioni a -80 °C fino a ulteriori analisi da parte di SDS-PAGE e western blot.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il protocollo qui presentato è stato utilizzato con successo e continuamente ottimizzato per un lungo periodo di tempo per determinare la localizzazione delle proteine nei compartimenti sottocondriali13,14,18,21,22,23. L'affidabilità e la riproducibilità di questo protocollo dipendono fortemente dalla purezza e dall'integrità...

I mitocondri sono organelli essenziali delle cellule eucariotiche che svolgono ruoli cruciali nella bioenergetica, nel metabolismo cellulare e nelle vie di segnalazione1. Per eseguire correttamente questi compiti, i mitocondri si basano su un insieme unico di proteine e lipidi responsabili della loro struttura e funzione. Il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente utilizzato come sistema modello per le indagini sui processi mitocondriali, così come per altri organelli2. Il genoma mitocondriale codifica solo per otto proteine nel lievito; la stragrande maggioranza delle proteine mitocondriali (~99%) sono codificate da geni nucleari, che vengono tradotti su ribosomi citosolici e successivamente importati nei loro corretti compartimenti sottocondriali da sofisticati macchinari per l'importazione di proteine3,4,5. Pertanto, la biogenesi mitocondriale dipende dall'espressione coordinata sia del genoma nucleare che di quello mitocondriale6,7. Le mutazioni genetiche che causano difetti nella biogenesi mitocondriale sono associate a malattie umane8,9,10.
Negli ultimi due decenni, studi proteomici ad alto rendimento mirati a mitocondri altamente purificati hanno portato a una caratterizzazione completa del proteoma mitocondriale del lievito, che è stato stimato essere composto da almeno 900 proteine11,12,13,14. Sebbene questi studi abbiano fornito informazioni preziose, la localizzazione suborganellare di ciascuna proteina nei quattro sottocompartimenti mitocondriali, vale a dire la membrana esterna (OM), lo spazio intermembrana (IMS), la membrana interna (IM) e la matrice, è ancora necessaria. Questa domanda è stata parzialmente affrontata con studi proteomici dei due sottocompartimenti mitocondriali più piccoli (OM e IMS)15,16. Più recentemente, Vögtle e collaboratori hanno fatto un importante passo avanti generando una mappa globale di alta qualità della distribuzione delle proteine submitocondriali nel lievito. Utilizzando un approccio integrato che combina la spettrometria di massa quantitativa basata su SILAC, diversi protocolli di frazionamento submitocondriale e il set di dati dei proteomi OM e IMS, gli autori hanno assegnato 818 proteine nei quattro sottocompartimenti mitocondriali13.
Nonostante i progressi raggiunti da questi studi proteomici ad alto rendimento, la nostra conoscenza della composizione del proteoma submitocondriale è lungi dall'essere completa. Infatti, tra le 986 proteine segnalate da Vögtle e collaboratori come localizzate nei mitocondri del lievito, 168 non potevano essere assegnate in nessuno dei quattro compartimenti sottocondriali13. Inoltre, gli autori non hanno fornito informazioni sulla topologia di membrana delle proteine che si prevedeva fossero attaccate perifericamente alla periferia delle membrane mitocondriali. Ad esempio, non è possibile sapere se una proteina che è stata assegnata come attaccata perifericamente alla membrana interna è rivolta verso la matrice o lo spazio intermembrana. Oltre a questi dati mancanti dagli studi a livello di proteoma, ci sono informazioni contrastanti sulla localizzazione suborganellare di un numero significativo di proteine mitocondriali. Un esempio è la proteasi Prd1, che è stata assegnata come proteina dello spazio intermembrana nei database comuni come Saccharomyces Genome Database (SGD) e Uniprot. Sorprendentemente, utilizzando un protocollo di sottofrazionazione simile a quello qui descritto, Vögtle e collaboratori hanno mostrato chiaramente che Prd1 è una vera e propria proteina della matrice13. Come accennato in precedenza, la localizzazione sottocondriale di molte proteine mitocondriali deve essere chiarita o rivalutata. Qui, forniamo un protocollo semplice e affidabile per determinare la localizzazione suborganellare delle proteine mitocondriali del lievito. Questo protocollo è stato sviluppato e ottimizzato da vari gruppi di ricerca ed è stato regolarmente utilizzato per determinare la localizzazione sottocondriale, nonché la topologia di membrana di molte proteine mitocondriali.

<table><tbody><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Estratto di lievito</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga ultratrasparenti Beckman, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (senza acidi grassi BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Componente del tampone di omogeneizzazione</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td>Componente del tampone DDT</td></tr><tr><td>D-sorbitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Galattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonile fluoruro (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>Utilizzato per inattivare la proteinasi K</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico (TCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase-20T da Arthrobacter luteus</td><td>MP Biomedicals, Irvine, CA 320921</td><td></td><td>Utilizzato per lisare le pareti cellulari del lievito vivente per produrre sferoplasti</td></tr></tbody></table>

valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Nonostante i recenti progressi nella caratterizzazione del proteoma mitocondriale del lievito, la localizzazione sottocondriale di un numero significativo di proteine rimane sfuggente. Qui, descriviamo un metodo robusto ed efficace per determinare la localizzazione suborganellare delle proteine mitocondriali del lievito, che è considerato un passo fondamentale durante la delucidazione della funzione proteica mitocondriale. Questo metodo prevede un primo passo che consiste nell'ottenere mitocondri intatti altamente puri. Questi preparati mitocondriali vengono poi sottoposti ad un protocollo di subfrazionamento costituito da shock ipotonico (gonfiore) e incubazione con proteinasi K (proteasi). Durante il gonfiore, la membrana mitocondriale esterna viene interrotta selettivamente, consentendo alla proteinasi K di digerire le proteine del compartimento spaziale intermembrana. Parallelamente, per ottenere informazioni sulla topologia delle proteine di membrana, i preparati mitocondriali vengono inizialmente sonicati e quindi sottoposti ad estrazione alcalina con carbonato di sodio. Infine, dopo la centrifugazione, le frazioni di pellet e surnatante di questi diversi trattamenti vengono analizzate da SDS-PAGE e western blot. La localizzazione submitocondriale e la topologia di membrana della proteina di interesse si ottengono confrontando il suo profilo western blot con standard noti.

Il successo del protocollo di frazionamento submitocondriale dipende dall'ottenimento di mitocondri intatti altamente purificati. Per questo, è essenziale che durante la lisi cellulare del lievito, l'integrità degli organelli rimanga quasi totalmente preservata. Ciò si ottiene utilizzando un protocollo di lisi cellulare che combina la digestione enzimatica della parete cellulare seguita da un'interruzione fisica della membrana plasmatica utilizzando un omogeneizzatore Dounce. I contenuti mitocondriali vengono quindi racc...

Nonostante i recenti progressi, molte proteine mitocondriali del lievito rimangono ancora con le loro funzioni completamente sconosciute. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine, che è stato fondamentale per la delucidazione delle loro funzioni molecolari.

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Questo protocollo è progettato per determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine mitocondriali del lievito, che è considerata un passo fondamentale durante la delucidazione della funzione proteica mitocondriale. Il protocollo è adatto per i nostri ceppi di lievito mantenuti in diverse condizioni di crescita. Rappresentare un potente strumento per la ricerca come lo studio dei mitocondri.Per cominciare, le cellule di striscia dal brodo di glicerolo immagazzinato a 80 C, su una piastra di agar YPD per isolare singole colonie dal ceppo di interesse. E incubare la piastra a 30 C per 2 o 3 giorni. Preparare una coltura iniziale inoculando da 2 a 3 colonie individuali dalla piastra di agar YPD in un matraccio Erlenmeyer da 100 ml contenente da 10 a 30 ml di mezzo YPGal.Incubare il matraccio a 30 C per 24 ore con agitazione vigorosa a 180-200 giri/min. Diluire la coltura iniziale in 1 L di mezzo YPGal fresco a una densità ottica inferiore a 0,1 a 600 nm. Coltivare le cellule a 30 C con agitazione vigorosa a 180-200 giri/min per circa 12 ore, fino a raggiungere la densità ottica da 1 a 1,5.Eseguire l'isolamento di mitocondri altamente purificati come descritto nel testo. E determinare la concentrazione proteica del preparato mitocondriale altamente purificato, utilizzando il test Bradford, seguendo le istruzioni del produttore. Regolare la concentrazione proteica a 10 mg/ml con tampone SEM ghiacciato.Trasferire 40 l di mitocondri altamente purificati in quattro tubi di microcentrifuga pre-refrigerati ed etichettati da 1,5 ml. Aggiungere 360 l di buffer SEM nel primo e nel secondo tubo. E 360 l di buffer EM nel terzo e quarto tubo.Utilizzando lo schema di pipettaggio, come da testo, aggiungere 4 L di proteinasi K appena preparata nel secondo e quarto tubo. Dopo aver mescolato delicatamente tutti i tubi, incubare su ghiaccio per 30 minuti con miscelazione occasionale. Per fermare l'attività della proteinasi K aggiungere 4 L di 200 mM PMSF a tutti e quattro i tubi.Centrifugare i tubi a 20.000 x g per 30 minuti a 4 C.E raccogliere il surnatante, senza disturbare il pellet, in un nuovo tubo microcentrifuga etichettato pre-refrigerato da 1,5 ml. Quindi, risospesciare il pellet in 400 l di tampone SEM ghiacciato. Per inattivare le possibili tracce di proteinasi K, precipitare il surnatante raccolto e risospesere il pellet con acido tricloroacetico ad una concentrazione finale del 10%Incubare i tubi su ghiaccio per 10 minuti.Centrifugare i campioni trattati con acido tricloroacetico per 10 minuti a 12.000 x g a 4 C.E dopo aver rimosso il surnatante, risospesere il pellet in 200 l di tampone campione. Se il blu bromofenolo diventa giallo, aggiungere da 1 a 5 l di base Tris 1 M, fino a quando non diventa blu. Aggiungere 4 l di PMSF da 200 mM a tutti i tubi.Conservare i campioni a 80 C fino a ulteriori analisi da parte di SDS-PAGE e western blot. Trasferire 200 l di mitocondri altamente purificati in un tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 ml. Mitocondri diluiti di una volta con tampone SEM ghiacciato.Utilizzando un sonicatore compatibile con piccoli volumi, sonicare i mitocondri 3 volte per 30 secondi sul ghiaccio. Centrifugare il campione per 30 minuti a 100.000 x g a 4 C.E raccogliere il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 ml. Dopo aver etichettato il tubo come S"per la frazione proteica solubile, tenere il tubo sul ghiaccio.Risospesciare il pellet della fase precedente in 400 l di tampone SEM ghiacciato. Trasferire 100 l del pellet risospeso in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 ml. Etichettare il tubo come SMP" per la frazione di particelle submitocondriali e mantenere il tubo sul ghiaccio.Diluire i restanti 300 l di pellet risospeso una volta con carbonato di sodio da 200 mM appena preparato. E incubare il campione diluito sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi, centrifugare il campione per 30 minuti a 100.000 x g a 4 C.Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 ml.Etichettare il campione come CS" per la frazione surnatante carbonatica e mantenere il tubo sul ghiaccio. Risospesciare il pellet della fase precedente in 400 l di tampone SEM ghiacciato. E nominare il campione come CP"per la frazione precipitata carbonatica.Precipitare tutti i campioni con acido tricloroacetico ad una concentrazione finale del 10% e incubare le provette sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi, centrifugare i campioni per 10 minuti a 12.000 x g a 4 C.Dopo aver rimosso il surnatante, risospesare ogni pellet nel tampone del campione. Se il buffer del campione diventa giallo, aggiungere da 1 a 5 l di base Tris da 1 M fino a quando non diventa blu.Aggiungere 1 l di PMSF da 200 mM a tutti i tubi e conservare a 80 C fino a ulteriori analisi da parte di SDS-PAGE e western blot. La frazione mitocondriale grezza è stata purificata mediante centrifugazione con gradiente di densità di saccarosio ed è stata osservata una riduzione di altri contaminanti cellulari. La conversione da mitocondri a mitoplasto è stata monitorata dalla scomparsa della proteina spaziale intermembrana citocromo b2 nel pellet.Con la comparsa concomitante nel surnatante. La degradazione mediata dalla proteinasi K della proteina intermembrana Sco1 è stata osservata a causa della rottura della membrana esterna da shock osmotico. L'integrità della membrana mitocondriale esterna è stata confermata dalla protezione del citocromo b2 e sco1 contro la degradazione della proteinasi K nella frazione del pellet.Allo stesso modo, la protezione della proteina solubile della matrice KGD ha confermato l'integrità della membrana mitocondriale interna. Il profilo Western blot di Prx1 ha suggerito una doppia localizzazione mitocondriale nello spazio intermembrana e nella matrice. I mitocondri sono stati sottoposti a sonicazione ed estrazione di carbonato per studiare la topologia delle proteine di membrana.Il versamento della proteina di membrana integrale è rimasto nelle frazioni del pellet. Il KGD è stato rilevato nella frazione surnatante. Il rilevamento della proteina KGD nel pellet era dovuto alle variazioni dei parametri di sonicazione che influenzavano la formazione di SMP.Dopo il trattamento con carbonato di sodio, la frazione KGD e SMP è stata solubilizzata e trovata nella frazione surnatante. Il profilo western blot di Prx1 suggeriva un'associazione con la periferia della membrana. Per il successo del protocollo di frazionamento sottocondria, è importante interrompere l'attività della proteinasi K dopo gonfiore ipotonico aggiungendo PMSF ai campioni.I siti forniscono informazioni sulla localizzazione della proteina submitocondriale. Questo protocollo può anche essere utilizzato per verificare l'integrità dei preparati mitocondriali, che è fondamentale durante gli studi proteomici dei sottocompartimenti mitocondriali.

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Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

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