Name: Preparazione e impianto di elettrodi per laccensione elettrica di topi VGAT-Cre per generare un modello per lepilessia del lobo temporale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri come generare un modello di epilessia del lobo temporale in topi VGAT-Cre mediante kindling elettrico. Questo metodo consente crisi spontanee ricorrenti con minima degenerazione ippocampale, utile per studiare meccanismi epilettogeni e valutare nuove terapie.

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Gli autori ringraziano John Williamson per le utili discussioni su questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH/NINDS NS112549.

L'uso degli animali ha seguito le linee guida ARRIVE12 ed è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia.
1. Realizzazione di cuffie con due elettrodi bipolari (Figura 1)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62929/62929fig01.jpg"> Figura 1: Passaggi chiave nella fabbricazione delle cuffie EEG. (A) Aspetto degli elettrodi nelle varie fasi del protocollo (numeri nella fase di corrispondenza sinistra). (B) Un'immagine del prodotto finale montata in un supporto fatto in casa che si adatta al telaio stereotassico. Nota, il supporto termina con un gruppo di perni del collare che si inserisce nel piedistallo dell'auricolare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62929/62929fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<ol><li>Tagliare 3,5 cm di filo di acciaio inossidabile rivestito in politetrafluoroetilene.</li>
	<li>Rimuovere circa 1 mm del rivestimento isolante dal filo su entrambe le estremità. Non avere troppo filo sverniciato.</li>
	<li>Metti due perni su un portamorsa con la parte inferiore del perno che ha una fessura più lunga rivolta verso il basso.</li>
	<li>Applicare il flusso sulle estremità spogliate del filo e sulla parte superiore dei perni.</li>
	<li>Tappare la parte spogliata del filo con una saldatura sufficiente per rivestirla.</li>
	<li>Aggiungere una quantità minima di saldatura alla parte superiore del perno senza traboccare sui lati.</li>
	<li>Posizionare un'estremità delle estremità spogliate del filo nel perno il più profondo possibile mentre la saldatura viene fusa. NOTA: C'è un foro laterale dove il filo può uscire - non lasciare che il filo esca dal perno. Tutto il filo strappato deve rimanere all'interno del perno.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.6-1.7 per il secondo perno, ora con le altre estremità spogliate del filo.</li>
	<li>Lasciare riposare i perni per 30 secondi per impostarli, rimuoverli dal supporto della morsa, quindi tirarli per assicurarsi che la connessione tra il filo e i perni sia forte e tiene.</li>
	<li>Risciacquare i perni in acqua fredda e quindi asciugare.</li>
	<li>Verificare la conduttanza tra il pin 1 e il pin 2 utilizzando un ohmmetro.</li>
	<li>Portare i perni alle estremità del filo insieme; Tienili paralleli e vicini. Morsetti un emostatico al centro del filo. Quindi, ruotare l'emostato, in modo che il filo si attorcigli su se stesso abbastanza stretto. Rimuovere l'emostato.</li>
	<li>Bloccare una pinza sul filo intrecciato 2 mm sotto i perni e piegare il filo a 90°.</li>
	<li>Spingere nuovamente lo stesso filo di 90° indietro sopra la pinza creando un'altra curva a 1 mm dalla prima.</li>
	<li>Tagliare il filo intrecciato con un angolo di 45° sotto la curva a 3,5 mm con piccole forbici affilate.</li>
	<li>Preparare due di questi elettrodi bipolari (a doppio perno intrecciato) per ogni auricolare (opzionale, il secondo è il backup in caso di problemi elettrici con il primo).</li>
	<li>Preparare un singolo elettrodo di riferimento tagliando in due un filo con perni saldati su entrambe le estremità (passaggi 1.1-1.17, Figura 1A).</li>
	<li>Tagliare il filo a 7 mm.</li>
	<li>Piegare l'estremità 1 mm sotto la punta.</li>
	<li>Quindi, coprire la punta piegata di 1 mm del filo con una pinza e ruotare il filo stretto attorno alla pinza per creare un piccolo anello (1 mm di diametro).</li>
	<li>Piegare l'anello perpendicolarmente alla parte diritta del filo per far sì che la punta del filo riguardi verso l'esterno.</li>
	<li>Assemblare i due elettrodi bipolari e il singolo elettrodo di riferimento nel piedistallo a sei pin in modo che gli elettrodi bipolari siano affiancati con una distanza di 6 mm tra loro e che l'elettrodo di riferimento sia posizionato nel foro esterno centrale (Figura 1B). NOTA: Un metodo alternativo consiste nell'impiantare gli elettrodi, cementarli in posizione e quindi inserire i loro perni nel piedistallo.</li>
</ol>2. Impianto di elettrodi stereotassici
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e l'assemblaggio dell'elettrodo a sei pin mediante autoclave prima dell'intervento. Durante l'intervento chirurgico deve essere mantenuto un campo chirurgico sterile e devono essere utilizzati guanti chirurgici sterili. Si raccomandano teli sterili (ad esempio, Press n' Seal) per coprire l'animale ad eccezione dell'area chirurgica.</li>
	<li>Utilizzare topi VGAT-Cre di 8 settimane (di età corrispondente, sia maschi che femmine) per interventi chirurgici 4 settimane dopo lo svezzamento. Registrare il peso dell'animale prima dell'intervento chirurgico per consentire la misurazione della perdita di peso post-chirurgica.</li>
	<li>Utilizza un vaporizzatore a isoflurano certificato o un sistema di anestesia a basso flusso dotato di una pompa a siringa di precisione, vaporizzatore digitale integrato e termoforo di feedback. NOTA: I sistemi a basso flusso sono in grado di erogare l'anestesia a basse portate proporzionate alle dimensioni dell'animale in una camera a induzione o attraverso un cono nasale sul telaio stereotassico (70 ml / min, la concentrazione di isoflurano nell'aria è del 4% per l'induzione e del 2% per la chirurgia). L'uso di meno anestesia non solo avvantaggia l'animale durante gli interventi chirurgici, ma riduce anche il rischio di esposizione del personale di laboratorio all'isoflurano.</li>
	<li>Posizionare l'animale anestetizzato su un tampone riscaldato a 37 °C per mantenerlo caldo durante l'intervento chirurgico. Se si utilizza un sistema di temperatura controllato da feedback, inserire la sonda di temperatura leggermente lubrificata nel retto dell'animale per il monitoraggio della temperatura durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Montare l'animale sul telaio stereotassico posizionando delicatamente le barre auricolari nelle orecchie e i denti superiori anteriori nella barra incisiva. Posizionare il cono del naso sopra il naso per una corretta erogazione dell'anestesia. Assicurarsi che la testa sia livellata e centrata e non possa essere spostata quando leggermente sondata.</li>
	<li>Iniettare per via sottocutanea 0,5 ml di normosol per l'idratazione.</li>
	<li>Applicare lubrificante oculare per prevenire l'essiccazione corneale.</li>
	<li>Monitorare la profondità dell'anestesia dall'assenza del riflesso di ritiro dopo aver pizzicato un dito posteriore, quindi ridurre l'isoflurano all'1,5% -2,0% durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Rimuovere i peli in corrispondenza e intorno all'area chirurgica strappando o utilizzando tagliacapelli (rasatura) o crema depilatoria e disinfettare la pelle con tre cicli di applicazione alternata di iodio ed etanolo, finendo con iodio. La rimozione dei peli dal sito chirurgico è raccomandata solo se ci sono mezzi per mantenere l'anestesia in quella posizione. Se necessario, utilizzare applicatori di punta di cotone imbevuti di alcol per rimuovere i peli dall'area circostante la testa. Iniettare 0,05 mL di bupivacaina analgesica locale (0,25%) per via sottocutanea.</li>
	<li>Fai un'incisione sul cranio usando un bisturi, quindi ritaglia una parte della pelle con forbici chirurgiche affilate, esponendo il cranio. Spingendo la pelle da parte, usando un batuffolo di cotone, pulire il cranio da tutti i muscoli e i tessuti sottostanti che ostruiscono la vista. NOTA: Per fermare l'emorragia accidentale, applicare pressione sul sito di sanguinamento con un batuffolo di cotone sterile fino a quando non si ferma.</li>
	<li>Pulire il cranio con perossido di idrogeno usando tamponi di cotone sterili per rendere visibili le suture del cranio e sia il bregma che la lambda.</li>
	<li>Asciugare accuratamente il cranio, quindi applicare una goccia di adesivo dentale autoincisivo utilizzando il suo applicatore. Spazzolarlo nel cranio, attendere 60 secondi e curare con una luce UV dentale per 40 secondi. Una superficie lucida indica che l'adesivo è stato efficacemente reticolato con il cranio. NOTA: questo passaggio è fondamentale per il fissaggio sicuro dell'auricolare.</li>
	<li>Utilizzare una punta da 0,031" (0,79 mm) per praticare bilateralmente due fori di bava per l'impianto di elettrodi di profondità dell'ippocampo (circa 5.000 giri/min). Praticare un foro di bava extra per l'elettrodo di riferimento sopra il cervelletto dietro la lambda. NOTA: Durante la perforazione, fare attenzione ad abbassare lentamente il trapano ed evitare di perforare il cervello.</li>
	<li>Le coordinate per gli elettrodi sono le seguenti (da bregma in mm): elettrodi ippocampali a 3 mm posterior, 3 mm lateralmente e 3 mm di profondità; ed elettrodo cerebellare di riferimento a 6 mm posteriormente, 0 mm lateralmente e 0 mm di profondità (subdurale).</li>
	<li>Per aumentare la precisione, utilizzare un trapano montato stereotassicamente, azzerare il manipolatore stereotassico dell'asse X / Y quando si tocca bregma - questo è il punto di riferimento per le coordinate.</li>
	<li>Assemblare una cuffia inserendo tutti gli elettrodi nel piedistallo a sei pin, assicurandosi che i perni siano spinti fino in fondo nel piedistallo. Montare il piedistallo nel supporto dell'elettrodo su un telaio stereotassico (Figura 1B).</li>
	<li>Allineare gli elettrodi sopra i fori di bava corrispondenti. Impiantare stereotassicamente elettrodi bipolari intrecciati in filo di acciaio inossidabile nell'ippocampo destro e sinistro e nell'elettrodo di riferimento nel cervelletto abbassando lentamente l'auricolare e guidando gli elettrodi nei fori di bava.</li>
	<li>Quando l'elettrodo di torsione ippocampale si trova proprio sopra il foro, azzerare l'asse Z e abbassarsi lentamente fino a -3,0 mm.</li>
	<li>Coprire la superficie del cranio e gli elettrodi con cemento dentale e riempire lo spazio tra la superficie del cranio e il fondo del piedistallo. I bordi della pelle saranno adiacenti al cemento dentale in modo tale che nessun tessuto sottostante rimanga esposto. Attendere che il cemento si asciughi e si indurisca. Quindi staccare il supporto dell'elettrodo dal braccio stereotassico e rimuovere il supporto dal piedistallo.</li>
	<li>Iniettare 0,1 mL di ketoprofene (1 mg/mL, SC) per l'analgesia e una seconda dose di 0,5 mL di normosol (SC) per l'idratazione e rimuovere l'animale dal telaio stereotassico.</li>
	<li>Posizionare un tampone isotermico preriscaldato a 37 °C all'interno di una gabbia vuota coperta da un tovagliolo di carta. Una volta che è completamente sveglio, metti l'animale in una gabbia pulita con lettiere e cibo morbido e restituiscilo al vivaio. Gli animali sono alloggiati singolarmente da questo punto in poi per evitare di masticare le cuffie l'uno dell'altro. Le tramogge della barra metallica non vengono utilizzate per evitare che le cuffie si blocchino e, invece, le bottiglie d'acqua sono legate alla parte inferiore delle cime della gabbia e il chow è presente nella biancheria da letto.</li>
	<li>Dai da mangiare all'animale del cibo morbido per 72 ore dopo l'intervento chirurgico e monitora la perdita di peso e il punteggio delle condizioni corporee. Agli animali disidratati possono essere somministrati 0,5 ml di normosol per via sottocutanea se disidratati (perdita di peso, aumento del turgore cutaneo, occhi infossati). Ketoprofene può essere somministrato per via sottocutanea una volta al giorno per altri 2 giorni dopo l'intervento chirurgico (seguire il regime di analgesia secondo le linee guida IACUC locali). Consentire agli animali di riprendersi completamente nelle loro gabbie per 4-7 giorni prima di essere trasferiti al sistema di registrazione EEG.</li>
</ol>3. Protocollo di accensione elettrica
<ol><li>Collegare i mouse al sistema di registrazione EEG utilizzando un cavo flessibile che si adatta alle prese sulla testa del mouse e sul commutatore (vedere l'elenco dei materiali ). Lasciare che gli animali si acclimatino per un giorno prima di procedere con il protocollo di stimolazione elettrica riportato di seguito. Monitorare la loro salute generale e l'acclimatazione su base giornaliera e rimuoverli dal sistema quando ci sono segni di malattia, angoscia e / o perdita di peso corporeo continua superiore al 25%</li>
	<li>Collegare entrambi i cavi dall'elettrodo stimolante all'uscita di uno stimolatore a corrente costante. NOTA: È molto utile avere un circuito stampato che commuta questi elettrodi lontano dal registratore EEG e allo stimolatore.</li>
	<li>Impostare lo stimolatore in modo da erogare impulsi di 1 ms a 50 Hz per una durata del treno di 2 s.</li>
	<li>Impostare l'uscita dello stimolatore a 20 microampere (μA) ed erogare il 1° impulso .</li>
	<li>Monitorare l'EEG per una caratteristica post-scarica di picchi ad alta frequenza che durano più a lungo dell'impulso di stimolazione elettrica.</li>
	<li>Se non si osserva alcuna scarica, aumentare la quantità di corrente iniettata con incrementi di 20 μA fino a quando non viene attivata una scarica post-scarica. La quantità di corrente richiesta è la soglia di post-scarica (ADT).</li>
	<li>Gli ADT tipici sono 20-50 μA. Se non si osserva alcuna scarica anche dopo l'aumento a 200 μA, è necessario risolvere i problemi dei collegamenti elettrici e del cablaggio delle cuffie con un ohmmetro ad alta sensibilità. Se il problema è nell'elettrodo stimolante, prova a stimolare con gli altri elettrodi di profondità.</li>
	<li>Gli animali vengono accesi stimolando 2 volte o 6 volte al giorno utilizzando una corrente che è 1,5 volte il valore ADT per quel mouse.</li>
	<li>Monitorare la risposta comportamentale alla stimolazione, che sale dal cambiamento di stato alle crisi tonico-cloniche bilaterali con caduta. Punteggio utilizzando un sistema di classi Racine modificato11. Per evitare convulsioni toniche fatali evocate, l'accensione dovrebbe essere interrotta se stimoli successivi portano a un aumento della gravità e della durata delle convulsioni fino al punteggio Racine modificato 6 (corsa e salto)</li>
</ol>

<ol><li>Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nationwide+trends+in+medical+expenditures+among+adults+with+epilepsy%3A+2003-2014%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014.</a> Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Questo rapporto descrive un protocollo in cui l'accensione elettrica dei topi porta all'epilessia. Poiché l'elettrodo stimolante è posizionato nell'ippocampo, questa è un'epilessia limbica focale che modella l'epilessia del lobo temporale (TLE) nei pazienti. Un passo fondamentale in questo protocollo è quello di utilizzare topi VGAT-Cre, che a causa dell'inserimento di una cassetta di ricombinasi IRES-Cre nel gene Vgat , mostra alterate correnti inibitorie GABA11. C57BL / 6 non sviluppano...

L'epilessia è un grave disturbo neurologico con significativi oneri economici e umani. NINDS stima che ci siano 3 milioni di americani con epilessia. Circa 0,6 milioni di questi pazienti sono affetti da epilessia del lobo temporale (TLE)1. Sfortunatamente, il trattamento medico del TLE fallisce in un terzo dei pazienti a causa dell'inefficacia, dello sviluppo di resistenza ai farmaci o dell'intolleranza agli effetti collaterali2. Chiaramente, c'è una significativa necessità di sviluppare nuove terapie per TLE, una conclusione condivisa dall'American Epilepsy Society Basic Science Committee, dall'International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery e dal National Advisory Neurological Disorders and Stroke Council 3,4.
Gli attuali modelli animali di epilessia del lobo temporale utilizzano chemioconvulsivanti (ad esempio, kainato, pilocarpina) o stimolazione elettrica prolungata per indurre uno stato epilettico di lunga durata 5,6,7. Molti animali muoiono durante la procedura (10% -30% nei ratti, fino al 90% nei topi8). Gli animali che sopravvivono e sviluppano l'epilessia mostrano una morte neuronale estesa in tutto il cervello 9,10. Questa morte innesca una cascata di risposte, a partire dall'attivazione di microglia, astrociti e monociti infiltranti. Le risposte neuronali includono la riorganizzazione dei circuiti (ad esempio, la germinazione delle fibre muschiose), la nascita di nuovi neuroni che non riescono a integrarsi correttamente nei circuiti (ad esempio, cellule granulari ectopiche) e cambiamenti intrinseci che portano all'ipereccitabilità (ad esempio, sovraregolazione dei canali Na+). Un modello di epilessia senza morte neuronale significativa faciliterà la ricerca di nuovi farmaci antiepilettici.
Durante il test dell'ipotesi GABA dell'epilessia, è stato scoperto che il trattamento dei topi VGAT-Cre con un lieve protocollo di accensione elettrica ha portato alle crisi motorie ed elettrografiche spontanee11. In generale, l'accensione elettrica dei roditori non porta a convulsioni spontanee che definiscono l'epilessia, sebbene possa, in caso di eccesso di accensione11. I topi VGAT-Cre esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del gene trasportatore vescicolare GABA (VGAT), che è specificamente espresso nei neuroni inibitori GABAergici. È stato riscontrato che l'inserimento di Cre ha interrotto l'espressione di VGAT a livello di mRNA e proteine, compromettendo così la trasmissione sinaptica GABAergica nell'ippocampo. Si è concluso che i topi VGAT-Cre accesi potrebbero essere utili per studiare i meccanismi coinvolti nell'epilettogenesi e per lo screening di nuove terapie11. Il presente rapporto fornisce in dettaglio i metodi utilizzati per generare il modello.

<table><tbody><tr><td>Amplificatore AC differenziale extracellulare a 16 canali (115V/60Hz)</td><td>AD Instruments</td><td>AM3500-115-60</td><td>Amplificatore EEG alternativo</td></tr><tr><td>363/CP PLUG COLLAR, MANICOTTO PIN</td><td>P1 Technologies</td><td>363SLEEVPIN0NL</td><td>Per portaelettrodo</td></tr><tr><td>Cavo, 363-363 5CM - 100CM W/MESH 6TCM</td><td>P1 Technologies</td><td>363363XXXXCM004</td><td>Cavo mouse-commutatore</td></tr><tr><td>Telecamere CCTV Qcwox HD Sony IR LED</td><td>Sony</td><td>QC-SP316</td><td></td></tr><tr><td>Commutatore SL6C/SB (spazzola singola)</td><td>P1 Technologies</td><td>8BSL6CSBC0MT</td><td>precedentemente Plastics One, Inc.</td></tr><tr><td>Amplificatore di corrente</td><td>A-M Systems</td><td>Modello 2100</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dentale</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Punte da trapano, #75, OD&nbsp; 0.310" LOC 130 PT</td><td>Kyocera</td><td>105-0210.310</td><td></td></tr><tr><td>E363/0 PRESA CONTATTO INCLINATO</td><td>P1 Technologies</td><td>8IE3630XXXXE</td><td>pin per connettore</td></tr><tr><td>iBond Self Etch colla</td><td>Kulzer</td><td>CE0197</td><td></td></tr><tr><td>MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN BIANCO</td><td>P1 Technologies</td><td>8K000229801F</td><td>Connettore per cuffie EEG</td></tr><tr><td>Ohmeter</td><td>Simpson</td><td>260</td><td>Alta sensibilità</td></tr><tr><td>PowerLab 16/35 e LabChart Pro</td><td>AD Instruments</td><td>PL3516/P</td><td>Software EEG alternativo</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific Corp.</td>Unità di anestesia <td>SS-01</td><td>& Kit</td></tr><tr><td>trapano stereotassico e micromotore</td><td>RightTemp Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modello 940</td><td></td></tr><tr><td>Filo rivestito in teflon per elettrodo di profondità, OD 0.008'A-M</td> <td>Systems</td><td>791400</td><td></td></tr><tr><td>Vgat-Cre topi su sfondo congenico C57BL/6J</td><td>Il Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e impianto di elettrodi per l'accensione elettrica di topi vgat-cre per generare un modello per l'epilessia del lobo temporale

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

È stato scoperto che l'accensione elettrica dei topi VGAT-Cre ha portato alle crisi motorie ed elettrografiche spontanee. Un recente articolo si è concentrato su come i topi VGAT-Cre unici sono stati utilizzati nello sviluppo di crisi ricorrenti spontanee (SRS) dopo l'accensione e un probabile meccanismo - l'inserimento di Cre nel gene VGAT - ha interrotto la sua espressione e ridotto il tono GABAergico. Il presente studio estende queste osservazioni a una coorte più ampia di topi, concentrandosi su questioni chiave come per quanto tempo l'SRS continua dopo l'accensione e l'effetto del sesso e dell'età dell'animale. Questo rapporto descrive i protocolli per i seguenti passaggi chiave: realizzazione di cuffie con elettrodi di profondità ippocampali per la stimolazione elettrica e per la lettura dell'elettroencefalogramma; intervento chirurgico per fissare saldamente l'auricolare sul cranio del topo in modo che non cada; e dettagli chiave del protocollo di accensione elettrica come la durata dell'impulso, la frequenza del treno, la durata del treno e la quantità di corrente iniettata. Il protocollo di accensione è robusto in quanto porta in modo affidabile all'epilessia nella maggior parte dei topi VGAT-Cre, fornendo un nuovo modello per testare nuovi farmaci antiepilettogeni.

Animali Il modello è stato originariamente sviluppato utilizzando topi VGAT-Cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 su sfondo misto. Tuttavia, è stato applicato anche al ceppo VGAT-Cre che è congenito con C57BL / 6J. Nessuna differenza è stata osservata nell'epilessia che si sviluppa tra i ceppi. Entrambi i ceppi esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore del trasportatore vescicolare GABA. Questi topi sono stati generati bussando in una cassetta IRES-Cre dopo ...

Questo rapporto descrive i metodi per generare un modello di epilessia del lobo temporale basato sull'accensione elettrica di topi transgenici VGAT-Cre. I topi Kindled VGAT-Cre possono essere utili per determinare ciò che causa l'epilessia e per lo screening di nuove terapie.

Preparazione e impianto di elettrodi per l'accensione elettrica di topi VGAT-Cre per generare un modello per l'epilessia del lobo temporale

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...

Questo protocollo genera un nuovo modello per l'epilessia del lobo temporale in cui i topi hanno sviluppato convulsioni spontanee, ed è stato molto utile per sondare i meccanismi dell'epilettogenesi e anche per lo screening di nuove terapie. Questa procedura nei topi VGAT-Cre porta in modo affidabile a crisi elettrografiche e composite motorie e motorie spontanee ricorrenti senza causare un'estesa morte delle cellule ippocampali che si osserva spesso dopo lo stato epilettico innescato con chemioconvulsivanti o stimolazione elettrica continua. Per iniziare a realizzare cuffie, tagliare un filo di acciaio inossidabile rivestito di politetrafluoroetilene lungo 3,5 centimetri e rimuovere circa un millimetro del rivestimento isolante da entrambe le estremità del filo.Metti due perni su un supporto per morsa, con la parte inferiore del perno con una fessura più lunga rivolta verso il basso. Quindi, applicare il flusso sulle estremità spogliate del filo e sulle parti superiori dei perni. Tappare la parte spogliata del filo e la parte superiore dei perni con una saldatura sufficiente a rivestirla senza traboccare sui lati.Posizionare una delle estremità spogliate del filo nel perno il più profondamente possibile mentre la saldatura si sta sciogliendo. Ripetete il processo per il secondo perno con l'altra estremità spogliata del filo. Dopo aver raffreddato i perni e saldato per 10 secondi, rimuovere i perni dal supporto della morsa e quindi tirare sui perni per assicurarsi che la connessione tra il filo e i perni sia forte e tieni.Risciacquare i perni in acqua fredda seguita da asciugatura. Successivamente, utilizzare un ohmmetro per verificare la conduttanza tra il pin uno e il pin due. Portare i perni all'estremità del filo insieme per tenerli paralleli e vicini.Morsetti un emostatico al centro del filo e ruota l'emostatico per torcere saldamente il filo su se stesso. Dopo aver rimosso l'emostato, bloccare le pinze sul filo intrecciato a due millimetri sotto i perni per piegare il filo a 90 gradi. Spingere il filo di 90 gradi indietro sopra la pinza, creando un'altra curva a un millimetro dalla prima.Usa piccole forbici affilate per tagliare il filo intrecciato a 45 gradi e 3,5 millimetri sotto la curva. Preparare due elettrodi intrecciati bipolari o a doppio pin per ciascuna cuffia. Per preparare un elettrodo di riferimento, tagliare un filo con perno saldato su entrambe le estremità in due.Quindi, tagliare il filo a sette millimetri e piegare l'estremità del filo a un millimetro sotto la punta. Coprire la punta piegata di un millimetro del filo con una pinza e ruotare il filo stretto attorno alla pinza per creare un piccolo anello con un millimetro di diametro. Quindi, piegare l'anello perpendicolarmente alla parte diritta del filo per far sì che la punta del filo punti di nuovo verso l'esterno.Assemblare tutti gli elettrodi nel piedistallo a sei pin fianco a fianco con una distanza di sei millimetri tra i due elettrodi bipolari. Posizionare l'elettrodo di riferimento nel foro esterno centrale. Prima di procedere con l'intervento chirurgico, registrare il peso dei topi VGAT-Cre di otto settimane.Quindi, posizionare l'animale in una camera di induzione per indurre l'anestesia. Posizionare il mouse anestetizzato su una piastra elettrica a 37 gradi Celsius. Se si utilizza un sistema di temperatura controllato da feedback, inserire la sonda di temperatura nel retto dell'animale per il monitoraggio della temperatura durante l'intervento chirurgico.Per iniziare l'intervento chirurgico, reindirizzare il flusso di anestesia inalante al cono del naso e montare l'animale nella cornice stereotassica posizionando delicatamente i denti superiori anteriori nella barra incisiva e spostare il cono sul naso. Quindi, posizionare le barre auricolari nelle orecchie e fissarle al telaio stereotassico. Assicurarsi che la testa dell'animale sia livellata e centrata e non possa essere spostata quando leggermente sondata.Una volta montato l'animale, iniettare 0,5 millilitri di Normosol sui topi per l'idratazione e applicare lubrificante oculare per prevenire l'essiccazione corneale. Monitorare la profondità dell'anestesia pizzicando una zampa dell'arto posteriore. Se il riflesso di astinenza è assente nell'animale, procedere alla rimozione dei peli del cuoio capelluto del topo intorno all'area chirurgica.Al termine, disinfettare tre volte l'area della pelle pulita con un'applicazione alternata di etanolo e iodio, finendo con iodio, e iniettare 0,05 millilitri di 0,25% di bupivacaina per via sottocutanea. Fai un'incisione sul cranio usando un bisturi e poi taglia una parte della pelle con le forbici chirurgiche, esponendo il cranio. Spingere la pelle da parte prima di pulire il cranio da tutti i tessuti sottostanti con un batuffolo di cotone.Pulire il cranio con perossido di idrogeno usando tamponi di cotone sterili e rendere visibili le suture del cranio, il bregma e la lambda. Con il trapano montato stereotassialmente, spostare la punta del trapano sul bregma in coordinate X, Y e Z zero. Quindi, sollevare e spostare il trapano su lambda per determinarne le coordinate per determinare se la testa è livellata.Dopo aver asciugato accuratamente il cranio, applicare una goccia di adesivo dentale autoincisivo con l'applicatore. Attendere 60 secondi prima di polimerizzare l'adesivo dentale con una luce UV dentale per 40 secondi. Una superficie lucida indica che l'adesivo è stato efficacemente reticolato con il cranio.Con l'aiuto di una punta da 0,031 pollici, praticare con cura due fori di bava bilateralmente nel cranio a 5.000 rotazioni al minuto, o RPM, evitando di perforare il cervello. Applicare una goccia di soluzione salina per migliorare la perforazione dei fori di bava. Per l'impianto di elettrodi di profondità dell'ippocampo, praticare tre millimetri posteriormente e tre millimetri lateralmente dal bregma.Praticare un foro di bava per l'elettrodo di riferimento sopra il cervelletto dietro la lambda a sei millimetri posteriormente e zero millimetri lateralmente dal bregma. Quindi, montare il piedistallo a sei pin con elettrodi assemblati nel supporto dell'elettrodo sul telaio stereotassico. Allineando gli elettrodi sopra i fori di bava corrispondenti, abbassa lentamente e naviga l'auricolare per individuare le due punte degli elettrodi bipolari proprio sopra i fori dell'ippocampo sinistro e destro e, se necessario, regolare l'elettrodo di riferimento per passare sopra il foro sopra il cervelletto.Quando gli elettrodi di torsione dell'ippocampo sono proprio sopra i fori, azzerare l'asse Z e abbassare lentamente l'elettrodo a meno tre millimetri nell'ippocampo destro e sinistro e guidare l'elettrodo di riferimento nel foro sopra il cervelletto. Preparare il cemento dentale mescolando la polvere e il liquido in una ciotola. Quindi, coprire la superficie del cranio, gli elettrodi e lo spazio tra la superficie del cranio e il fondo del piedistallo con cemento dentale.Una volta che il cemento si asciuga e si indurisce, staccare il supporto dell'elettrodo dal braccio stereotassico, sollevare il braccio e rimuovere il supporto dal piedistallo. Dopo aver somministrato il topo per via sottocutanea con ketoprofene e Normosol, rimuovere l'animale dal telaio stereotassico per spostare l'animale sul pad riscaldato nella gabbia del vivaio. Una volta completamente sveglio, riportare il singolo animale nella gabbia del vivaio, nutrirlo con cibo morbido e monitorare la perdita di peso ogni giorno fino a 72 ore dopo l'intervento.Nel grafico rappresentativo del violino, viene mostrato il numero di stimolazioni richieste dai topi al criterio dello stato acceso. I topi in genere hanno raggiunto lo stato acceso o sperimentano cinque crisi motorie tonico-cloniche bilaterali dopo 15 stimolazioni. La latenza alle crisi ricorrenti spontanee, o SRS, è risultata essere di 10,7 e la frequenza media delle crisi è stata di 1,3 crisi al giorno.L'affidabile distribuzione SRS ha mostrato che i topi erano epilettici per circa 23 giorni. Nelle immagini rappresentative, si può vedere il numero di neuroni anti-NeuN positivi o morti neuronali in vari sottocampi dell'ippocampo e della corteccia entorinale. È importante che i due elettrodi bipolari entrino uniformemente nei due fori di bava, quindi devono essere proprio sopra i fori di bava.Inoltre, è importante applicare con attenzione il cemento dentale e lasciarlo indurire completamente prima di rimuovere il supporto dell'elettrodo. Questa tecnica ci consente di generare topi epilettici e monitorarli continuamente con la registrazione EEG e anche la registrazione video, contemporaneamente. E con gli esperimenti che facciamo, possiamo quindi testare nuove strategie di trattamento come la terapia genica per ridurre la frequenza, la durata e la gravità delle crisi.

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Parzialmente isolato corteccia ("sottosquadro") è un modello animale efficiente epilettogenesi post-traumatico. Qui mostriamo come fare un nuovo dispositivo chirurgico e usarlo per fare le lesioni più precisi e concordanti per generare questo modello.

Preparazione del modello di sottosquadro epilettogenesi Post-Traumatico in roditori

La procedura è descritta per manipolare l'attività dei neuroni cerebrali corticali piramidali optogenetically mentre l'elettroencefalogramma, elettromiogramma, e cerebrale concentrazione di lattato sono monitorati. Registrazioni sperimentali vengono eseguite su cavo-frenati topi, mentre subiscono spontanee sonno / veglia cicli. Optogenetic apparecchiatura è assemblata nel nostro laboratorio, apparecchi registrazione è commercialmente disponibile.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Questo video mostra una tecnica per impiantare un gruppo di elettrodi nel cervello di un topo. L'assemblaggio contiene elettrodi bipolari per registrare l'attività dall'ippocampo e un elettrodo di riferimento per ottenere l'attività di base dal cervelletto. Un topo anestetizzato viene posizionato su un telaio stereotassico e il gruppo elettrodo viene impiantato nella regione del cervello bersaglio. L'animale viene quindi lasciato riprendersi prima di eseguire la registrazione elettrofisiologica.

Impianto di un gruppo di elettrodi in un cervello di topo per la registrazione elettrofisiologica

Gli studi hanno dimostrato che la stimolazione transcranica catodica a corrente continua può produrre effetti soppressivi sulle convulsioni resistenti ai farmaci. In questo studio, è stata ideata una configurazione sperimentale in vitro in cui la stimolazione a corrente continua e la registrazione di array multielettrodi dell'attività convulsiva sono state valutate nella preparazione di fette di cervello di topi. Sono stati valutati i parametri di stimolazione a corrente continua.

Stimolazione diretta correnti e multi-elettrodo Array registrazione di sequestro simile attività nei topi cervello fetta di preparazione

Questo articolo dimostra le prestazioni dell'agopuntura, dei modelli di epilessia e dell'analisi del sonno nei roditori. Vengono descritte la procedura di agopuntura e l'identificazione dei punti di agopuntura. La pilocarpina o pentilenetetrazolo (PTZ) è usata per indurre l'epilessia. Per l'analisi del sonno vengono utilizzati l'elettrocorticogramma (ECoG), l'elettromiogramma (EMG), la temperatura cerebrale e le registrazioni dell'attività locomotoria.

Manipolazione di epilettiforme Electrocorticograms (ECoGs) e sonno in ratti e topi con l&#39;agopuntura

Questo protocollo dettagliato descrive il posizionamento di elettrodo stimolazione transcranica su osso temporale al fine di studiare gli effetti a breve e a lungo termine della stimolazione elettrica transcranica in liberi di muoversi.

Stimolazione elettrica transcranica cronica e registrazione intracorticale in ratti

Questo manoscritto descrive un metodo di indurre il epilepticus di condizione di iniezione sistemica pilocarpina e di monitoraggio spontanei sequestri ricorrenti in animali vivi, utilizzando un sistema di elettroencefalogramma e telemetria wireless video. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi patofisiologici di epilessia cronica, nella epilettogenesi e grippaggi acuti.

Il modello di pilocarpina di epilessia del lobo temporale e monitoraggio EEG utilizzando il sistema di radiotelemetria in topi

Vi illustriamo come eseguire registrazione ed elettrica modulazione di attività epileptiform indotta da 4-aminopyridine in fettine di cervello del roditore utilizzando matrici microelettrodo. Una camera di registrazione personalizzata mantiene la vitalità del tessuto durante prolungate sessioni sperimentali. Live mapping di elettrodo e selezione di coppie stimolante sono eseguite da un'interfaccia di utente grafica personalizzata.

Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Modelli di sequestro acuta sono importanti per studiare i meccanismi alla base di eventi epileptiform. Inoltre, la capacità di generare eventi epileptiform su richiesta fornisce un metodo altamente efficiente per studiare l'esatta sequenza degli eventi alla base la loro iniziazione. Qui, descriviamo i modelli di sequestro corticale acuta 4-aminopiridina stabiliti nel tessuto umano e del mouse.

Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore

La sfida della ricerca sull'epilessia è sviluppare nuovi trattamenti per i pazienti in cui la terapia classica è inadeguata. Utilizzando un nuovo protocollo — con l'aiuto di un sistema di somministrazione di farmaci impiantabili — siamo in grado di controllare le convulsioni in topi anestetizzati dalla consegna elettroforetica di GABA nella messa a fuoco epilettica.

La somministrazione elettroforetica di acido γ-aminobutirrico (GABA) nella messa a fuoco epilettica previene le convulsioni nei topi

L'amigdala svolge un ruolo chiave nell'epilessia del lobo temporale, che ha origine e si propaga da questa struttura. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata della fabbricazione di elettrodi cerebrali profondi con funzioni sia di registrazione che di stimolazione. Introduce un modello di epilessia del lobo temporale mediale originato dall'amigdala.

Utilizzo di un elettrodo bipolare per creare un modello murino per l'epilessia del lobo temporale mediante accensione elettrica dell'amigdala

Scopri come generare un modello di epilessia del lobo temporale in topi VGAT-Cre mediante kindling elettrico. Questo metodo consente crisi spontanee ricorrenti con minima degenerazione ippocampale, utile per studiare meccanismi epilettogeni e valutare nuove terapie.

Preparazione e impianto di elettrodi per laccensione elettrica di topi VGAT-Cre per generare un modello per lepilessia del lobo temporale (Video) | JoVE Journal

Preparazione e impianto di elettrodi per l'accensione elettrica di topi VGAT-Cre per generare un modello per l'epilessia del lobo temporale

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