Colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata di quattro tipi di cellule immunitarie endometriali in aborto spontaneo ricorrente
4 agosto 2021
Nonostante i progressi nell'immunoistochimica multiplex e nell'imaging multispettrale, caratterizzare la densità e il raggruppamento delle principali cellule immunitarie contemporaneamente nell'endometrio rimane una sfida. Questo documento descrive un protocollo dettagliato di colorazione multiplex e l'imaging per la localizzazione simultanea di quattro tipi di cellule immunitarie nell'endometrio.
L'attuale tecnologia consente l'uso di anticorpi allevati nella stessa specie per rilevare fino a sette marcatori. A dimostrare la procedura sarà Loucia Chan, un tecnico del laboratorio. Iniziare preparando i vetrini di vetro incorporati in paraffina fissata alla formalina montati con il campione di tessuto, posizionando i vetrini piatti in un forno, per cuocere a 60 gradi Celsius con il tessuto rivolto verso l'alto.
Dopo un'ora, scerare e reidratare i vetrini per 10 minuti ciascuno con la serie di sostanze chimiche, come descritto nel manoscritto. Immergere i vetrini in soluzione salina tris-buffered, e poi in una scatola di plastica riempita con una miscela di formaldeide diluita in metanolo, per fissare i campioni. Quindi, lavare le diapositive due volte in acqua deionizzata per due minuti.
Procedere al recupero dell'epitopo, posizionando il rack di vetrini in una scatola di resistenza al calore riempita con tampone di acido citrico a pH 6,0. E poi posizionando la scatola nel microonde, per riscaldare prima i vetrini al 100% di potenza per 50 secondi, seguiti da 20 minuti al 20% di potenza, per mantenere la stessa temperatura. Dopo aver risciacquato i vetrini in acqua distillata e lavato con TBST, immergere il vetrino in un barattolo contenente una soluzione che blocca la perossidazione per 10 minuti.
Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini in acqua distillata e lavare con TBST, quindi utilizzare una penna barriera idrofoba per segnare un confine attorno alla sezione del tessuto sul vetrino. Quindi risciacquare il vetrino in TBST, coprire le sezioni di tessuto con il tampone bloccante e incubare i vetrini in una camera umidificata per 15 minuti. Per rimuovere i reagenti bloccanti, prima incubare i vetrini con l'anticorpo primario di interesse, quindi rimuovere l'anticorpo primario lavando i vetrini tre volte con TBST, prima dell'incubazione con il polimero perossidasi di rafano etichettato, anticorpo secondario.
Dopo l'incubazione, lavare i vetrini prima di applicare la flora opalina per la soluzione di lavoro TSA, quindi risciacquare il vetrino con il tampone di recupero dell'antigene. Eseguire lo stripping a base di microonde riscaldando i vetrini nel tampone di recupero dell'antigene in un forno a microonde con una potenza del 100%, per 50 secondi, seguita da una potenza del 20% per 20 minuti nei contenitori sicuri per microonde. Dopo aver raffreddato i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti, sciacquare i vetrini in acqua distillata e TBST e successivamente incubare con soluzione dappy per cinque minuti.
Quindi asciugare all'aria la slitta prima del montaggio con il mezzo di montaggio appropriato. Prima dell'imaging delle diapositive preimpostare gli appositi filtri nella postazione di lavoro. Cattura un minimo di 10 campi per l'analisi con un ingrandimento inferiore a 200 volte.
Per contare le celle, fare clic sul pulsante Conta oggetti nella barra dei passaggi, per visualizzare il pannello delle impostazioni di conteggio degli oggetti. Se il tessuto è stato segmentato, selezionare la categoria di tessuto in cui si trovano gli oggetti. Quindi selezionare il ridimensionamento del segnale desiderato dalla scala automatica o dalla scala fissa.
Per la segmentazione degli oggetti, selezionare il componente principale dall'elenco a discesa. Per rilevare oggetti che toccano altri oggetti come oggetti singoli e non combinati, selezionare la casella dimensioni massime e pixel e quindi optare per la divisione raffinata. Quindi, contare tutte le cellule stromali nelle cellule immunitarie separatamente, per esprimere i dati come percentuali delle cellule immunitarie rispetto al numero totale di cellule stromali per ogni immagine catturata.
Successivamente, riportare il conteggio finale delle celle come media di tutti i campi. Utilizzando l'editor di viste, esaminare le tabelle di dati risultanti dopo l'elaborazione e quindi esportare la tabella dei dati di conteggio. Nell'analisi rappresentativa, quattro tipi di cellule immunitarie nel campione di endometrio siamo differenziati.
L'immagine elaborata mostra la segmentazione dei tessuti come compartimenti epiteliali e stromali. L'immunocolorazione multiplex è stata eseguita sulle biopsie endometriali da una donna di controllo fertile e una donna con aborto spontaneo ricorrente inspiegabile, piano singolo per noi che rappresenta CD3, CD56, CD68 e CD20 sono stati rivelati nell'immunocolorazione. Una volta identificato il suono immunitario, un'ulteriore colorazione sotto la citochina può aiutare ad affrontare la loro interazione e il meccanismo per il successo dell'impianto.
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Panoramica
Questo studio affronta le sfide legate alla caratterizzazione simultanea della densità e dell'aggregazione dei principali linfociti immunitari nell'endometrio mediante immunoenzimologia a moltipliche e imaging multispettrale. Viene descritto un protocollo di colorazione dettagliato per la localizzazione simultanea di quattro tipi di cellule immunitarie nell'endometrio.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Immunologia
- Biologia endometriale
- Tecniche di imaging multiplex
Sfondo
- Importanza della caratterizzazione delle cellule immunitarie nella biologia della riproduzione.
- Sfide legate ai metodi tradizionali di colorazione.
- Progressi nella tecnologia di imaging.
Metodi Utilizzati
- Immunohistochemica multiplex
- Campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina
- Immagini multispettrali
Risultati principali
- Differenziato con successo quattro tipi di cellule immunitarie (CD3, CD56, CD68, CD20) nell'endometrio.
- Visualizzata la distribuzione e l'aggregazione delle cellule immunitarie.
- Forniti miglioramenti del protocollo per studi futuri.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo affidabile per l'analisi delle cellule immunitarie nell'endometrio.
- Questo ha implicazioni per la comprensione della salute riproduttiva e del successo dell'impianto.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La colorazione immunohistochimica fluorescente multiplex consente la quantificazione simultanea di diverse popolazioni di cellule immunitarie all'interno di una singola sezione di tessuto, colmando una lacuna fondamentale nella ricerca di immunologia riproduttiva. Questo approccio supporta l'analisi meccanicistica e la riduzione del rischio delle ipotesi riguardanti il microambiente endometriale, fornendo dati di profilazione immunitaria multiplex con risoluzione spaziale direttamente da campioni derivati da pazienti. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva negli sforzi di validazione degli obiettivi legati al fallimento dell’impianto e alle perdite gestazionali ricorrenti, permettendo il confronto diretto della densità e dell’aggregazione delle cellule immunitarie tra stati fertili e patologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative alle interazioni tra cellule immunitarie nell'endometrio mediante la rilevazione simultanea dei marcatori CD3, CD56, CD68 e CD20.
- Valore operativo: Riduce la necessità di sezionamento e colorazione in serie, preservando campioni clinici preziosi e aumentando la densità di dati per ogni sezione tissutale.
- Conferma predittiva: Fornisce parametri quantitativi e risolti dal punto di vista spaziale sulle cellule immunitarie, che supportano la riduzione del rischio biologico dei bersagli coinvolti nella comunicazione tra endometrio e sistema immunitario durante l’impianto.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Genera letture fluorescenti standardizzate e riproducibili, adatte a piattaforme di imaging ad alto contenuto e flussi di lavoro di analisi automatica delle immagini.
- Scalabilità: Compatibile con biobanche di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE), consentendo l'analisi retrospettiva di ampie coorti ai fini della scoperta di biomarcatori.
- Ottimizzazione della moltiplicazione: Affronta l'interferenza tra fluorocromi mediante cicli sequenziali di colorazione e rimozione, garantendo la specificità del segnale per ciascun marcatore cellulare immunitario.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Sistema Rilevante per la Patologia: Direttamente applicabile a biopsie endometriali umane, fornendo un modello clinicamente rilevante per lo studio della disregolazione immunitaria nell'abortività ricorrente.
- Continuità Translazionale: Collega il profilo immunitario nella fase di scoperta con la validazione preclinica, consentendo un fenotipaggio immunitario coerente tra diversi tipi di campioni.
- Riduzione del Rischio Meccanicistico: Permette di indagare le interazioni tra cellule immunitarie mediate da citochine a seguito dell'identificazione iniziale dei tipi cellulari, facilitando la validazione di bersagli a livello di percorsi molecolari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase di biologia della scoperta, supportando in particolare la validazione degli bersagli immunitari e gli screening fenotipici nei programmi di immunologia riproduttiva.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi riguardo alla composizione delle cellule immunitarie e all'organizzazione spaziale nell'endometrio durante la finestra di impianto.
- Screening: Produce dati quantitativi di immunofluorescenza che permettono il confronto tra densità cellulari immunitarie e modelli di aggregazione in diverse condizioni sperimentali.
- Analisi: Fornisce dati multiplex sull'intensità della fluorescenza e sulla co-localizzazione, utili per la fenotipizzazione delle cellule immunitarie e l'inferenza del loro stato funzionale.
- Ricerca traslazionale: Favorisce il passaggio dall'analisi di campioni umani a studi meccanicistici successivi, fornendo marcatori validati di cellule immunitarie per saggi funzionali successivi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di immunomarcatura riutilizzabile, applicabile a diversi studi di profilazione immunitaria nell'endometrio e in altri tessuti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi consentendo un confronto diretto e multiplex delle popolazioni di cellule immunitarie nei tessuti malati rispetto ai tessuti di controllo.
- Valore operativo: Migliora l'efficienza dei reagenti e riduce la variabilità grazie a protocolli ottimizzati di colorazione e decolorazione sequenziali su singoli vetrini.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di terapie riproduttive chiarendo il contributo del microambiente immunitario al successo o al fallimento dell'impianto.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, sulla base della densità delle cellule immunitarie, del loro raggruppamento e della correlazione spaziale con i compartimenti epiteliali o stromali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immunohistochemia, nella microscopia a fluorescenza e nell'analisi multispettrale delle immagini per una corretta rilevazione e quantificazione del segnale.
- È subordinato all'accesso a sistemi di recupero dell'antigene basati su microonde, scanner per vetrini con capacità di fluorescenza e kit di fluorocromi Opal validati per il ciclo multiplo.
- Necessita della standardizzazione delle condizioni di bloccaggio, incubazione con gli anticorpi e rimozione degli anticorpi tra diversi laboratori, al fine di garantire la riproducibilità dei risultati multiplex.
- Richiede l'adattamento dei pannelli di anticorpi e delle fasi di validazione quando il metodo viene applicato a diversi tipi di tessuto o a marcatori cellulari immunitari diversi da CD3, CD56, CD68 e CD20.
- Le limitazioni pratiche includono il possibile passaggio incrociato tra fluorocromi e la necessità di una accurata separazione spettrale durante l'acquisizione delle immagini, risolta mediante rimozione sequenziale degli anticorpi e impostazioni di filtro validate.
