Name: Transizione di fase optogenetica di TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Scopri le transizioni di fase optogenetiche di TDP-43 nei motoneuroni spinali di Danio rerio. Questo metodo permette di visualizzare in vivo il comportamento dinamico della proteina e studiare i meccanismi di degenerazione neuronale nell'ALS.

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Questo lavoro è stato supportato da SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numeri JP19K06933 (KA) e JP20H05345 (KA).

Tutto il lavoro sui pesci è stato condotto in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (numero di identificazione di approvazione 24-2) dell'Istituto nazionale di genetica (Giappone), che ha una garanzia del benessere degli animali in archivio (numero di garanzia A5561-01) presso l'Ufficio per il benessere degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (NIH, STATI UNITI).
1. Costruzione di BAC per l'espressione del gene optogenetico TDP-43 dal promotore mnr2b
<ol><li>Preparazione BAC<ol>
<li>Acquista un clone BAC di zebrafish contenente il locus zebrafish mnr2b (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purificare il DNA BAC da una coltura LB notturna di 5 mL di DH10B Escherichia coli (E. coli) che ospita CH211-172N16 come descritto in Warming et al.18.</li>
		<li>Trasformare CH211-172N16 in celle SW102 E. coli mediante elettroporazione, come descritto in Warming et al.18. NOTA: La purificazione del DNA BAC dall'E. coli lo stesso giorno dell'elettroporazione di solito dà un tasso di successo più elevato della trasformazione BAC18. In caso contrario, il DNA BAC purificato viene mantenuto a -20 °C fino all'uso.</li>
		<li>Introdurre la cassetta iTol2-amp per la transgenesi BAC mediata da trasposone Tol219 nella spina dorsale di CH211-172N16 mediante elettroporazione, come descritto in Asakawa et al.20.<ol>
<li>Creare uno stock di glicerolo dei cloni cellulari di E. coli portatori di CH211-172N16 con l'integrazione della cassetta iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) dopo aver confermato l'integrazione omologa mediata dalla ricombinazione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) (Ex Taq) utilizzando la coppia di primer Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') e pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') e le seguenti condizioni: una fase di denaturazione a 98 °C per 1 min, seguita da 25 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s, ricottura del primer a 55 °C per 15 s ed estensione del primer a 72 °C per 1 min, amplificando un prodotto PCR di 354 paia di basi (bp).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:opTDP-43h costruzione<ol>
<li>Costruisci un plasmide che trasporta la cassetta di espressione per il wild-type umano TDP-43/TARDBP (TDP-43h) che è etichettato con mRFP1 e CRY2olig rispettivamente a N- e C-termini, (di seguito, opTDP-43h)14. NOTA: Il frammento opTDP-43h deve essere affiancato dalla sequenza del promotore del gene zebrafish hsp70l (650 bp) e dalla sequenza di segnale di poliadenilazione (polyA), seguita da un gene di resistenza alla kanamicina (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.</li>
		<li>Amplificare la cassetta hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan con primer che ricottura hsp70l e Kan e contengono sequenze 45 bp dei codoni iniziatori a monte e a valle del gene iniziatore del gene mnr2b mediante PCR (GXL DNA Polymerase) utilizzando la coppia di primer mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') e Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') con le seguenti condizioni: una fase di denaturazione a 98 °C per 1 min, seguita da 30 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s, ricottura del primer a 55 °C per 15 s ed estensione del primer a 68 °C per 30 s, amplificare un prodotto PCR di ~5,7 bp.</li>
		<li>Separare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio (100 V) e purificare la banda di DNA hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan con una colonna di DNA. Regolare la concentrazione della cassetta hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan purificata a 50 ng/μL nel tampone Tris-EDTA (TE) contenente 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM EDTA.</li>
		<li>Introdurre la cassetta hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan in CH211-172N16-iTol2A mediante elettroporazione come descritto in Warming et al.18 e selezionare i trasformatori resistenti all'ampicillina e alla kanamicina su piastre lb agar. CH211-172N16-iTol2A che trasporta la cassetta hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan è designata come mnr2b-hs:opTDP-43h.</li>
		<li>Purificare mnr2b-hs:opTDP-43h utilizzando un kit di purificazione BAC e scioglierlo a 250 ng/μL in TE dopo estrazione di fenolo/cloroformio.</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:Costruzione EGFP-TDP-43z<ol>
<li>Costruisci un altro plasmide che trasporta il tardbp di tipo zebrafish wild che è etichettato con una proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) al suo N-terminus (EGFP-TDP-43z) invece di opTDP-43h ma è altrimenti identico al costrutto hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Utilizzare EGFP-TDP-43z come controllo interno per la stimolazione luminosa di opTDP-43h.</li>
		<li>Costruire CH211-172N16-iTol2A che ospita la cassetta hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan nel locus mnr2b come descritto in 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A che trasporta la cassetta hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan è designata come mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transgenesi BAC mediata da trasposone Tol2 nel pesce zebra
<ol><li>Preparare la soluzione iniettabile contenente 40 mM KCl, rosso fenolo (10% v/v), 25 ng/μL del DNA mnr2b-hs:opTDP-43h e 25 ng/μL Tol2 trasposasi mRNA19.</li>
	<li>Iniettare 1 nL della soluzione iniettabile (una goccia con un diametro di circa 123 μm calibrata in olio minerale) nel citosol di embrioni di zebrafish selvatici allo stadio unicellulare. Esaminare il pesce iniettato per la formazione di aggregati positivi alla proteina fluorescente rossa (RFP) in vari tessuti embrionali, compresi i motoneuroni spinali, sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza a 2-3 giorni dopo la fecondazione (dpf). Allevare il pesce RFP-positivo all'età adulta.</li>
	<li>Iniettare il DNA mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z come descritto in 2.1 e 2.2. Allevare pesci positivi all'EGFP fino all'età adulta.</li>
	<li>Dopo alcuni mesi, mettere pesce iniettato sessualmente maturo e pesce selvatico in coppia in gabbie di accoppiamento standard da 2 L per ottenere prole F1. Pesce F1 a 3 dpf per la fluorescenza RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) nella colonna motoria spinale utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di una lente obiettivo Plan-Neofluar 5x / 0,15. In genere, un pesce fondatore viene identificato da 10-20 pesci iniettati (il tasso di trasmissione germinale è del 5% -10%).</li>
	<li>Isolare e confrontare più inserti Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] di diversi pesci fondatori, poiché l'intensità, ma non il modello, dell'espressione opTDP-43h o EGFP-TDP-43z può variare tra i pesci fondatori a causa degli effetti della posizione cromosomica.</li>
	<li>Incrociare le linee di pesce Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] per ottenere prole contenente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] pesce doppio-transgenico in un rapporto mendeliano.</li>
	<li>Allevare il pesce in un piatto di plastica contenente 30 mL di tampone E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% Blu di Metilene) e aggiungere lo 0,003% (p/v) di N-feniltiourea a 8-10 ore dopo la fecondazione (hpf) per inibire la melanogenesi.</li>
	<li>Coprire il piatto di plastica con un foglio di alluminio dopo 30 hpf.</li>
</ol>3. Preparazione del LED per l'illuminazione a luce blu
<ol><li>Accendere un pannello LED utilizzando l'applicazione associata installata su un tablet/telefono. Mettere la sonda di uno spettrometro in un pozzo vuoto di un piatto a 6 pozzetti e regolare la luce LED alla lunghezza d'onda che raggiunge il picco a ~ 456 nm attraverso l'applicazione. Posizionare il sensore ottico di un misuratore di potenza ottica nel pozzo vuoto e regolare la potenza della luce LED (~ 0,61 mW / cm2). L'impostazione della luce LED può essere salvata ed è recuperabile nell'applicazione.</li>
	<li>Introdurre l'impostazione del piatto/pannello LED nell'incubatore a 28 °C. Completa questo passaggio prima che l'imaging del pesce inizi a 48 hpf.</li>
</ol>4. Imaging di larve di zebrafish che esprimono TDP-43 optogenetico
<ol><li>Selezionare Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] pesce doppio transgenico almeno prima di 47 hpf, in base alla fluorescenza RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) nella colonna motoria spinale utilizzando il set-up del microscopio a epifluorescenza sopra descritto.</li>
	<li>Decoerniare il pesce doppio transgenico Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].</li>
	<li>Preriscaldare l'1% di agarosio a bassa temperatura di fusione contenente 250 μg/mL di sale di metanosolfonato di etile 3-amminobenzoato a 42 °C.</li>
	<li>Anestetizzare brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] pesce doppio transgenico a 48 hpf in tampone E3 contenente la stessa concentrazione di Tricano.</li>
	<li>Mettere una goccia dell'agarosio preriscaldato a bassa temperatura di fusione dell'1% sulla piastra di base in vetro a temperatura ambiente. Il diametro della goccia di agarosio a forma di cupola sul piatto di vetro è di 8-10 mm.</li>
	<li>Usando una pipetta Pasteur, aggiungere il pesce anestetizzato all'agarosio a bassa temperatura di fusione sulla piastra di base di vetro, quindi mescolare pipettando un paio di volte. Ridurre al minimo la quantità di tampone E3 aggiunto all'agarosio insieme al pesce.</li>
	<li>Mantenere il pesce su un fianco utilizzando un ago a siringa durante la solidificazione dell'agarosio (in genere ~ 1 min) per garantire che il midollo spinale sia in una posizione orizzontale appropriata. Dopo la solidificazione, metti un paio di gocce di tampone E3 sul pesce montato su agarose a forma di cupola.</li>
	<li>Acquisire sezioni z confocali seriali del midollo spinale eseguendo la scansione con un microscopio confocale dotato di una lente obiettivo ad immersione in acqua 20x con apertura numerica 1,00, utilizzando una velocità di scansione di 4,0 μs per pixel (12 bit per pixel), una dimensione del passo di 1,0 μm per fetta per l'obiettivo e una combinazione di lunghezze d'onda di eccitazione / emissione: Canale 1) 473/510 nm per EGFP e Canale 2) 559/583 nm per mRFP1. NOTA: La cloaca sul lato ventrale del pesce è inclusa nelle regioni di interesse (ROI) come riferimento, che aiuta a identificare e confrontare i segmenti spinali (livelli 16-17) attraverso i punti temporali.</li>
	<li>Rimuovere il pesce dall'agarosio rompendo con cura l'agarosio con un ago per siringa non appena l'imaging è completo. Mantenere la quantità di tempo in cui il pesce è incorporato nell'agarosio il più breve possibile, anche se l'incorporamento di agarosio per <30 minuti non influisce sulla vitalità del pesce.</li>
</ol>5. Stimolazione luminosa di pesci che esprimono opTDP-43h mediante illuminazione di campo di una luce a diodi a emissione di luce blu (LED)
<ol><li>Aggiungere 7,5 mL di buffer E3 al pozzo e posizionare il pesce doppio transgenico Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] nel pozzo. Posizionare la parabola a sei pozzetti sul pannello LED tenendo la parabola e il pannello LED a 5 mm di distanza con un distanziatore (ad esempio, con cinque vetri scorrevoli impilati).</li>
	<li>Accendi la luce LED blu. Tenere alcuni dei pesci Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] a doppio transgenico in un piatto separato a sei pozzetti coperto con un foglio di alluminio quando sono necessari pesci di controllo non illuminati (cioè in condizioni di oscurità)14.</li>
	<li>Dopo l'illuminazione (ad esempio, per 24 ore a 72 HPF nella Figura 3), visualizzare il midollo spinale del pesce illuminato ripetendo i passaggi 4.3 - 4.9.</li>
</ol>6. Visualizzazione del trasferimento citoplasmatico del TDP-43 optogenetico nei motoneuroni spinali
<ol><li>Apri il file immagine in ImageJ/Fiji21 (Versione: 2.1.0/1.53c), un programma di elaborazione delle immagini Java open source sviluppato da NIH Image, che può essere scaricato da https://imagej.net/Fiji/Downloads.</li>
	<li>Utilizzate la barra di scorrimento Z per spostarvi tra i piani focali. Creare una proiezione di intensità massima di più sezioni facendo clic su Immagine | Stack | | del progetto Z Intensità massima e impostazione Start slice e Stop slice che coprono gli emisegmenti della colonna motoria spinale.</li>
	<li>Dividere l'immagine multicanale in due immagini a canale singolo facendo clic su Immagine | | colore Canali divisi.</li>
	<li>Migliorare il segnale EGFP-TDP-43z per garantire che il citoplasmatico EGFP-TDP-43z sia chiaramente visibile facendo clic su Immagine | Regolare | Luminosità/Contrasto e regolazione minima
</li>
	<li>Aprire roi manager facendo clic su Analizza | Strumenti | Responsabile ROI. Trova le cellule identificabili in entrambe le immagini a 48 hpf e 72 hpf, in base alle posizioni relative dei corpi cellulari. Imposta il ROI delineando i contorni dei corpi cellulari dei singoli motoneuroni spinali visualizzati dal segnale EGFP-TDP-43z utilizzando le selezioni a mano libera, quindi facendo clic su Aggiungi[t] nel roi manager.</li>
	<li>Impostate un asse maggiore del soma disegnando una linea retta utilizzando Diritto (Straight ) e facendo clic su Analizza | Profilo del grafico per immagini EGFP-TDP-43z (C1) e opTDP-43h (C2) a 48 e 72 hpf.</li>
	<li>Normalizzare il profilo di plottaggio dividendo i valori per il valore massimo per ogni segnale EGFP-TDP-43z e opTDP-43h. Traccia i valori normalizzati con coordinate x-y, dove x e y rappresentano rispettivamente l'asse maggiore del soma e le relative intensità fluorescenti, utilizzando il grafico XY in un software statistico.</li>
</ol>7. Confronto raziometrico tra segnali opTDP-43h e EGFP-TDP-43z utilizzando ImageJ/Fiji
<ol><li>Aprire il file immagine in ImageJ/Fiji e impostare i ROI per le singole celle mnr2b-positive utilizzando un'immagine di proiezione di intensità massima di EGFP-TDP-43z come in 6.1-6.5. Aggiungi un ROI al di fuori del midollo spinale ventrale (ad esempio, notocorda) per rappresentare il segnale di sfondo (ROI di sfondo).</li>
	<li>Per ogni immagine EGFP-TDP-43z e opTDP-43, create una proiezione di più sezioni facendo clic su Immagine | Stack | | del progetto Z Sommare le sezioni e impostare la sezione Start e la sezione Stop che coprono la colonna del motore emispinale.</li>
	<li>Apri il ROI manager creato con l'immagine di proiezione di massima intensità. Visualizzare il ROI nell'immagine Sum Slices selezionando la finestra dell'immagine per EGFP-TDP-43z e quindi facendo clic su Mostra tutto nel ROI manager. Fare clic su Misura nel roi manager per ottenere i valori medi per ogni ROI.</li>
	<li>Acquisire valori medi per opTDP-43h seguendo la stessa procedura prevista al punto 7.3.</li>
	<li>Per ogni ROI, dopo aver sottratto la media per il ROI di fondo, dividere la media sottratta per opTDP-43h per la media sottratta per EGFP-TDP-43z per ottenere il valore raziometrico. I valori raziometrici possono essere confrontati tra diversi punti temporali e presentati utilizzando il grafico a colonne nel software Prism.</li>
</ol>

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<li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925(2014).</li>
<li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li>
<li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605(2020).</li>
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KA e KK sono gli inventori della proprietà intellettuale descritta in questo manoscritto e brevetti provvisori sono stati presentati dall'Istituto Nazionale di Genetica.

L'espressione mediata da mnr2b-BAC di opTDP-43h e EGFP-TDP-43z nel pesce zebra offre un'opportunità unica per l'imaging dal vivo della transizione di fase TDP-43 nei motoneuroni spinali. La trasparenza ottica dei tessuti corporei delle larve di zebrafish consente la stimolazione optogenetica semplice e non invasiva di opTDP-43h. I confronti tra i singoli motoneuroni spinali nel tempo hanno dimostrato che l'oligomerizzazione dipendente dalla luce di opTDP-43h causa il suo clustering citoplasmatico, che ricorda la...

I granuli di ribonucleoproteine (RNP) controllano una miriade di attività cellulari nel nucleo e nel citoplasma assemblando partizioni senza membrana tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS), un fenomeno in cui un fluido omogeneo demixes in due fasi liquide distinte1,2. Il LLPS disregolato delle proteine leganti l'RNA che normalmente funzionano come componenti del granulo RNP promuove una transizione di fase anormale, portando all'aggregazione proteica. Questo processo è stato implicato nelle malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative3,4,5. La valutazione precisa di una relazione causale tra LLPS aberrante di proteine leganti l'RNA e patogenesi della malattia è cruciale per determinare se e come LLPS può essere sfruttato come bersaglio terapeutico efficace. LLPS delle proteine leganti l'RNA è relativamente facile da studiare in vitro e in modelli unicellulari, ma è difficile negli organismi multicellulari, specialmente nei vertebrati. Un requisito critico per l'analisi di tale LLPS in singole cellule all'interno di un ambiente tissutale è quello di esprimere stabilmente una sonda per l'imaging e la manipolazione di LLPS in un tipo di cellula vulnerabile alla malattia di interesse.
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è un disturbo neurologico in definitiva fatale in cui i motoneuroni del cervello e del midollo spinale vengono persi selettivamente e progressivamente a causa della degenerazione. Ad oggi, mutazioni in più di 25 geni sono state associate alla forma ereditaria (o familiare) della SLA, che rappresenta il 5%-10% dei casi totali di SLA, e alcuni di questi geni che causano la SLA codificano per proteine leganti l'RNA costituite da RNP, come hnRNPA1, TDP-43 e FUS6,7. Inoltre, la forma sporadica di SLA, che rappresenta il 90%-95% dei casi totali di SLA, è caratterizzata dall'aggregazione citoplasmatica di TDP-43 depositato in motoneuroni degeneranti. Una delle principali caratteristiche di queste proteine leganti l'RNA associate alla SLA sono le loro regioni intrinsecamente disordinate (IDR) o domini a bassa complessità che mancano di strutture tridimensionali ordinate e mediano deboli interazioni proteina-proteina con molte proteine diverse che guidano LLPS7,8. Il fatto che le mutazioni che causano la SLA si verifichino spesso negli esami approfonditi ha portato all'idea che la LLPS aberrante e la transizione di fase di queste proteine correlate alla SLA possano essere alla base della patogenesi della SLA9,10.
Recentemente, il metodo optoDroplet, una tecnica optogenetica basata su Cryptochrome 2 che consente la modulazione delle interazioni proteina-proteina da parte della luce, è stato sviluppato per indurre la transizione di fase delle proteine con IDR11. Poiché questa tecnica è stata estesa con successo a TDP-43, ha iniziato a scoprire i meccanismi alla base della transizione di fase patologica di TDP-43 e la sua citotossicità associata12,13,14,15. In questo protocollo, delineiamo un metodo genetico per fornire un TDP-43 optogenetico a tipi di cellule vulnerabili alla SLA, vale a dire, motoneuroni spinali nel pesce zebra utilizzando il BAC per il gene mnr2b / mnx2b che codifica per una proteina omeodominio per la specifica del motoneurone16,17. L'elevata traslucenza delle larve di zebrafish consente una stimolazione luminosa semplice e non invasiva del TDP-43 optogenetico che innesca la sua transizione di fase nei motoneuroni spinali. Presentiamo anche un flusso di lavoro di base per l'imaging dal vivo dei motoneuroni spinali zebrafish e l'analisi delle immagini utilizzando il software Fiji / ImageJ disponibile gratuitamente per caratterizzare le risposte del TDP-43 optogenetico alla stimolazione della luce. Questi metodi consentono un'indagine sulla transizione di fase del TDP-43 in un ambiente cellulare vulnerabile alla SLA e dovrebbero aiutare a esplorare le sue conseguenze patologiche a livello cellulare e comportamentale.

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza</td><td>ZEISS</td><td>Axioimager Z1</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Piatto base in vetro</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>MEE</td><td>CN-25C</td><td></td></tr><tr><td>Pannello LED</td><td>Nanoleaf Limited</td><td>Nanoleaf AURORA smarter kit</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus</td><td>TAKARA</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond BAC100</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>LONZA</td><td>50181</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFL N 20&times;/1.00</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>ZEISS</td><td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di potenza ottica</td><td>HIOKI</td><td>3664</td><td></td></tr><tr><td>Sensore ottico</td><td>HIOKI</td><td>9742-10</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di rosso fenolo 0,5%</td><td>Merck</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polimerasi</td><td>TAKARA</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Piatto a sei pozzetti</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Sonda spettrometrica BLUE-Wave</td><td>StellerNet Inc.</td><td>VIS-50</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa</td><td>TERUMO</td><td>NN-2725R</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TAKARA</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Tricane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish BAC clone CH211-172N16</td><td>BACPAC Genomics</td><td>CH211-172N16</td><td></td></tr></tbody></table>

transizione di fase optogenetica di tdp-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

L'aggregazione proteica anormale e la vulnerabilità neuronale selettiva sono due dei principali tratti distintivi delle malattie neurodegenerative. Le relazioni causali tra queste caratteristiche possono essere interrogate controllando la transizione di fase di una proteina associata alla malattia in un tipo di cellula vulnerabile, sebbene questo approccio sperimentale sia stato finora limitato. Qui, descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina legante l'RNA / DNA TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish per modellare l'aggregazione citoplasmatica di TDP-43 che si verifica nei motoneuroni degenerativi nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Descriviamo un metodo genetico basato sul cromosoma artificiale batterico (BAC) per fornire una variante optogenetica TDP-43 in modo selettivo ai motoneuroni spinali del pesce zebra. L'elevata traslucenza delle larve di zebrafish consente la transizione di fase dell'optogenetico TDP-43 nei motoneuroni spinali mediante una semplice illuminazione esterna utilizzando un diodo a emissione luminosa (LED) contro pesci sfrenati. Presentiamo anche un flusso di lavoro di base di imaging dal vivo dei motoneuroni spinali zebrafish e analisi delle immagini con il software Fiji / ImageJ disponibile gratuitamente per caratterizzare le risposte optogenetiche TDP-43 all'illuminazione della luce. Questo protocollo consente la caratterizzazione della transizione di fase TDP-43 e della formazione di aggregati in un ambiente cellulare vulnerabile alla SLA, che dovrebbe facilitare un'indagine delle sue conseguenze cellulari e comportamentali.

Imaging dal vivo di proteine TDP-43 optogenetiche e non optogenetiche nei motoneuroni spinali mnr2b+ delle larve di zebrafish Per indurre la transizione di fase TDP-43 nei motoneuroni spinali nel pesce zebra, è stato costruito un TDP-43h umano che è taggato con mRFP1 e CRY2olig22 ai termini N- e C, rispettivamente, e designato come opTDP-43h14 (Figura 1A). Il frammento del gene opTD...

Descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina 43 legante il DNA TAR (TDP-43) dalla luce nei motoneuroni spinali usando zebrafish come modello.

Transizione di fase optogenetica di TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Quindi questo protocollo ci consente di indurre transizioni di fase patologiche di TDP-43 e affrontare le loro conseguenze cellulari nei motoneuroni spinali in vivo, il che è rilevante per capire perché i motoneuroni degenerano nella SLA. A causa dell'elevata trasparenza delle larve di zebrafish, i motoneuroni nel midollo spinale sono direttamente visibili. Quindi si può visualizzare il comportamento dinamico di TDP-43 in fase di transizioni in singoli motoneuroni spinali.Questo metodo offre un nuovo modello animale di SLA. Riteniamo che qualsiasi metodo in grado di prevenire la transizione di fase e l'aggregazione di TDP-43 indotta dalla luce in questo modello di SLA possa essere un potenziale candidato per la terapia della SLA. Altre proteine correlate alla SLA con regioni intrinsecamente disordinate possono essere espresse per esplorare la neurotossicità associata alle transizioni di fase anormali.La chiave del successo in questo approccio è esprimere il TDP-43 optogenetico nei motoneuroni spinali a livello non tossico. La transgenesi BAC è un passo che richiede tempo, ma una volta creato un pesce transgenico adeguato, i seguenti passaggi sono relativamente più facili e diretti. Per iniziare, accendere il diodo a emissione luminosa o il pannello LED utilizzando l'applicazione associata installata su un tablet o un telefono.Quindi, posizionare la sonda dello spettrometro in un pozzo vuoto di un piatto a 6 pozzetti. Quindi, utilizzando l'applicazione, regolare la luce LED su una lunghezza d'onda con un picco di 456 nm. Posizionare il sensore ottico di un misuratore di potenza ottica nel pozzo vuoto e regolare la potenza della luce LED.Quindi posizionare il piatto con l'impostazione del pannello LED in un incubatore a 28 C.Per l'imaging delle larve di pesce zebra che esprimono TDP-43 optogenetico, decoerniare il pesce doppio transgenico e anestetizzarli in un tampone E3 contenente 250 g / mL di Tricane. Quindi, preriscaldare l'1% di agarosio a bassa temperatura di fusione contenente 250 g / mL di etil 3-aminobenzoato metanosolfonato a 42 C.Quindi mettere una goccia di agarosio sulla piastra di base di vetro. Il diametro della goccia di agarosio a forma di cupola sul piatto di vetro dovrebbe essere compreso tra 8 e 10 mm.Quindi, usando una pipetta Pasteur, aggiungere il pesce anestetizzato all'agarosio sul piatto a base di vetro. Ridurre al minimo la quantità di tampone E3 aggiunto all'agarosio insieme al pesce. Quindi, mescolare pipettando un paio di volte.Durante la solidificazione dell'agarosio, mantenere il pesce su un fianco usando un ago a siringa, in modo tale che il midollo spinale sia in una posizione orizzontale appropriata. Dopo che l'agarosio si è solidificato, aggiungi un paio di gocce di tampone E3 sul pesce montato sull'agarosio a forma di cupola. Utilizzando un microscopio confocale dotato di una lente obiettivo ad immersione in acqua 20 volte, acquisire sezioni z confocali seriali del midollo spinale.Includere la cloaca sul lato ventrale del pesce nelle regioni di interesse come riferimento per identificare e confrontare i segmenti spinali attraverso i punti temporali. Non appena l'imaging è completo, utilizzare un ago a siringa per rompere con cura l'agarosio e rimuovere il pesce dall'agarosio. Mantenere la quantità di tempo in cui il pesce è incorporato nell'agarosio il più breve possibile, anche se l'incorporamento di agarosio per meno di 30 minuti non influisce sulla vitalità del pesce.Aggiungere 7,5 ml di tampone E3 a un pozzetto di un piatto a 6 pozzetti e posizionare il pesce doppio transgenico ripreso in quel pozzo. Quindi, posizionare il piatto sul pannello LED, mantenendo il piatto e il pannello LED a 5 mm di distanza con un distanziatore e accendere la luce LED blu. Tenere alcuni pesci a doppio transgenico in un piatto separato a 6 pozzetti coperto con un foglio di alluminio per pesci di controllo non illuminati.Dopo il tempo di illuminazione desiderato, ha ripreso il midollo spinale del pesce illuminato come dimostrato in precedenza. Il trasferimento citoplasmatico dell'opTDP-43h in singoli motoneuroni spinali è stato visualizzato separando le immagini della serie z acquisite a 48 anni. e 72 ore dopo la fecondazione in ciascun canale EGFP-TDP-43z e opTDP-43h.Dalle immagini di proiezione di massima intensità di EGFP-TDP-43z, un singolo neurone spinale isolato identificabile a entrambi i 48. e sono state selezionate 72 ore dopo la fecondazione. Le regioni di interesse che coprono i somi dei motoneuroni sono state impostate tracciando il bordo del segnale EGFP a 48.e 72 ore dopo la fecondazione. L'intensità fluorescente normalizzata lungo l'asse maggiore del soma è stata tracciata. E a 48 ore dopo la fecondazione, i modelli di entrambi i segnali si sovrapponevano in gran parte l'un l'altro.Al contrario, a 72 ore, il picco per il segnale opTDP-43h è stato trovato nella regione in cui il segnale EGFP-TDP-43z era basso, indicando il trasferimento citoplasmatico di opTDP-43h. Per quantificare i segnali opTDP-43h e EGFP-TDP-43z prima e dopo la stimolazione della luce blu, sono state prodotte a 48 alcune immagini di proiezione slice per ciascun canale delle stesse immagini della serie z. e 72 ore dopo la fecondazione.Delle quattro celle mnr2b+ che sono state studiate, la cella 1, in particolare, ha mostrato un segnale EGFP-TDP-43z saturo. Le quantità relative di opTDP-43h a EGFP-TDP-43z sono state calcolate dividendo il valore RFP per il valore GFP. Le celle da 2 a 4 mostravano livelli di opTDP-43h decrescenti dopo l'illuminazione a luce blu.È importante ridurre al minimo il tempo in cui i pesci sono incorporati nell'agarosio per mantenerli sani. Regolando l'intensità e la durata dell'illuminazione a LED, controlliamo la transizione di fase TDP-43 in modo regolato temporaneamente, che può aiutare a sezionare la progressione della transizione di fase patologica TDP-43 nel motoneurone.

optogenetic-phase-transition-tdp-43-spinal-motor-neurons-zebrafish

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Questo video descrive le tecniche optogenetiche attivando neuroni somatosensoriali geneticamente modificati e registrando la risposta comportamentale suscitata con una videocamera ad alta velocità.

Optogenetica del pesce zebra: attivazione di neuroni somatosensoriali geneticamente modificati per studiare le risposte comportamentali larvali

In questo video, descriviamo un saggio di separazione di fase, in cui le proteine intracellulari che comprendono regioni intrinsecamente disordinate fuse a un dominio di oligomerizzazione fotosensibile sono indotte tramite l'esposizione alla luce blu ad autoassociarsi in condensati liquidi senza membrana.

Saggio di separazione di fase proteica: un metodo optogenetico per la separazione di fase proteica legante l'RNA mutante nei motoneuroni spinali di larve di zebrafish

Questo video dimostra un test non invasivo per studiare l'elettrofisiologia dei motoneuroni negli embrioni di zebrafish. Dopo aver misurato l'avvolgimento della coda negli embrioni a seguito della depolarizzazione spontanea dei motoneuroni del midollo spinale, viene applicato un bloccante del canale del sodio per ridurre la frequenza di avvolgimento. Successivamente, gli embrioni vengono immobilizzati in agarosio e posti sotto un microscopio a fluorescenza. I motoneuroni geneticamente...

Un approccio non invasivo per studiare l'elettrofisiologia dei motoneuroni negli embrioni di zebrafish

Optogenetic tecniche hanno permesso di studiare il contributo dei neuroni specifici comportamenti. Descriviamo un metodo in zebrafish larvale per l'attivazione di singoli neuroni somatosensoriali che esprimono una variante channelrhodopsin (Chef) con un diodo-pompato allo stato solido (DPSS) laser e registrare i comportamenti suscitate con una telecamera ad alta velocità video.

Attivazione Optogenetic di zebrafish neuroni somatosensoriali con Chef-tdTomato

I protocolli qui descritti consentono lo studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili nelle condizioni fisiologiche più non invasive impiegando embrioni di zebrafish in un sistema in vivo insieme a un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) espresso selettivamente nel tipo di cellula di interesse.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Qui, presentiamo un protocollo per mostrare come cella fotoconversione è raggiunto attraverso l'esposizione di UV ad aree specifiche che esprimono la proteina fluorescente, Eos, in animali vivi.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

L'optogenetica è uno strumento potente con applicazioni ad ampio raggio. Questo protocollo dimostra come ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu.

Espressione GFP indotta dalla luce in embrioni di zebrafish utilizzando il sistema optogenetico TAEL/C120

La manipolazione optogenetica delle vie di segnalazione può essere una potente strategia per studiare come la segnalazione viene decodificata nello sviluppo, nella rigenerazione, nell'omeostasi e nella malattia. Questo protocollo fornisce linee guida pratiche per l'utilizzo di attivatori di segnalazione della proteina morfogenica (BMP) nodale e della proteina morfogenica ossea (BMP) basati sul dominio di rilevamento della luce-ossigeno-voltaggio nell'embrione precoce di zebrafish.

Attivazione della segnalazione optogenetica negli embrioni di zebrafish

Questo protocollo stabilisce un paradigma di fenotipizzazione comportamentale nelle larve di pesce zebra trattate con MPTP per valutare i deficit motori e non motori simili alla malattia di Parkinson.

Profilazione fenotipica dei fenotipi comportamentali simili a Parkinson indotti da MPTP nelle larve di pesce zebra, basata su un esperimento comportamentale

Scopri le transizioni di fase optogenetiche di TDP-43 nei motoneuroni spinali di Danio rerio. Questo metodo permette di visualizzare in vivo il comportamento dinamico della proteina e studiare i meccanismi di degenerazione neuronale nell'ALS.

Transizione di fase optogenetica di TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish

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