Modello di sanguinamento della traslazione della vena della coda in topi di emofilia A completamente anestetizzati

I modelli di sanguinamento della coda possono essere strumenti importanti per valutare gli effetti farmacologici dei composti emostatici in vivo per garantire la riproducibilità tra gli esperimenti. Rispetto ad altri modelli di sanguinamento sensibili, il nostro modello utilizza la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento come endpoint invece della sopravvivenza. Inoltre, il modello viene eseguito in anestesia, riducendo così il dolore e l'angoscia per gli animali.

Questa tecnica è particolarmente utile per lo studio preclinico dell'emofilia e di altri disturbi della coagulazione, poiché misura la capacità del sangue di coagulare e fermare un sanguinamento dopo un infortunio. Abbiamo usato ampiamente questo modello, testando composti procoagulanti nel nostro lavoro per sviluppare nuove terapie per l'emofilia usando topi emofilia A. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri ceppi di topi emofili, o topi in cui l'emofilia è indotta con un anticorpo anti-fattore VIII.

A dimostrare l'esperimento saranno Sarah e Dennis, che sono tecnici esperti nel mio laboratorio. Dopo aver anestetizzato il mouse, posizionarlo su una piastra riscaldante e assicurarsi che il naso sia nel cono del naso. Applicare un unguento per gli occhi adatto per prevenire la secchezza durante l'anestesia.

Contrassegnare la coda ad un diametro di 2,5 millimetri utilizzando il blocco del segno di coda, facendo attenzione a non forzare la coda nella fessura e assicurandosi che si adatti perfettamente. Quindi, posizionare la coda nel tubo salino per almeno cinque minuti per garantire una vena della coda calda che sia ottimale per il dosaggio endovenoso. Se necessario, il dosaggio endovenoso può essere eseguito dopo cinque minuti.

Quindi, posizionare un coperchio di plastica sul mouse per ridurre la perdita di calore. Lasciare le code immerse per cinque minuti dopo il dosaggio della soluzione di prova, quindi eseguire la traslazione della vena della coda posizionando la coda nel blocco di taglio e ruotandola di 90 gradi per esporre la vena. Effettuare il taglio sul lato opposto rispetto a dove è stata dosata la soluzione di prova.

Disegna la lama del bisturi numero 11 attraverso la fessura del blocco di taglio, tenendo la coda, per creare sanguinamento. Quindi, riportare immediatamente la coda alla soluzione salina e ripristinare il cronometro. Il sanguinamento deve essere visibile immediatamente.

Immergere la coda in soluzione salina è importante per un sanguinamento costante, poiché si fermerebbe rapidamente in aria libera. Osservare l'emorragia e annotare l'inizio e l'arresto dell'emorragia per 40 minuti sulla carta di notazione del flusso sanguigno. Squalificare e sostituire il topo se il sanguinamento primario non si ferma entro tre minuti dopo il taglio, il che può indicare che il taglio è troppo profondo o che il topo è carente di emostasi primaria.

Sfida il taglio della coda se non c'è sanguinamento, 10, 20 e 30 minuti dopo l'infortunio. Usando un tampone di garza imbevuto e soluzione salina calda, sollevare la coda dalla soluzione salina e asciugarla delicatamente ma saldamente due volte con la garza bagnata in direzione distale sopra il taglio della coda. Riinvio immediatamente la coda nel tubo salino dopo ogni sfida.

Quando l'esperimento è finito, rimuovere la coda dalla soluzione salina, raccogliere campioni di sangue se lo si desidera e eutanasizzare i topi mentre sono ancora in anestesia completa. Centrifugare le provette di raccolta del sangue da 15 millilitri con soluzione salina a 4.000 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante dai tubi.

Risospesso il pellet in due millilitri di soluzione di lisatura degli eritrociti. Quindi, diluirlo con un massimo di 12 millilitri aggiuntivi di soluzione lisante fino a raggiungere un colore di caffè chiaro. Notare il volume totale e trasferire due millilitri della diluizione in un tubo di emoglobina.

Conservarlo in frigorifero fino all'analisi dell'emoglobina. Una significativa riduzione della perdita di sangue per i gruppi di trattamento con fattore VIII della coagulazione ricombinante è stata osservata utilizzando il protocollo ottimizzato. Una dose di 20 unità internazionali per chilogrammo ha completamente normalizzato l'emorragia e 10 UI per chilogrammo hanno causato un effetto significativo, riducendo la perdita di sangue quasi al limite superiore della gamma wild-type.

Risultati simili sono stati osservati per il tempo di sanguinamento. Una riduzione è stata osservata in gruppi da 5, 10 e 20 UI per chilogrammo, essendo completamente normalizzata nel gruppo di 20 UI per chilogrammo. Nei topi wild-type, la perdita totale di sangue variava da 200 a 840 nanomoli di emoglobina e nei topi veicolari, da 5.300 a 7.100 nanomoli di emoglobina.

Il sanguinamento medio è stato di 5.200 nanomole nei topi trattati con veicoli e 720 nanomoli nel gruppo di 20 UI per chilogrammo. Il tempo di sanguinamento dei topi wild-type variava da uno a nove minuti e i livelli di dose di 10 e 20 UI per chilogrammo riducevano il tempo di sanguinamento all'interno di questo intervallo. Una forte correlazione tra perdita di sangue e tempo di sanguinamento è stata osservata nei dati combinati.

Tutti gli episodi di sanguinamento registrati sono stati tracciati per fornire una visualizzazione della lunghezza e del numero di sanguinamenti sperimentati per ogni singolo topo. Si noti che nel gruppo di veicoli, dopo la seconda sfida, la maggior parte degli animali continua a sanguinare fino alla fine dell'esperimento. La misurazione della concentrazione plasmatica di fattore VIII ha confermato che l'effetto osservato nel ridurre la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento era dipendente dalla concentrazione del fattore VIII ricombinante.

La conta piastrinica non è stata influenzata in modo evidente e i livelli di ematocrito erano all'interno del range normale negli animali che ricevevano dosi moderate e più elevate di fattore VIII ricombinante, ma significativamente più bassi negli animali che sanguinavano ampiamente, come nel veicolo e in gruppi di una UI per chilogrammo. Negli animali che soffrono di sanguinamento pesante, può verificarsi un impatto minore sull'emocromo, in particolare l'emoglobina totale o l'ematocrito. Per valutare l'effetto del genere in questo modello ottimizzato, sia la perdita di sangue che i risultati del tempo di sanguinamento sono stati sottoposti all'analisi ANOVA bidirezionale, con genere e dose come fattori.

Questi risultati hanno indicato che la risposta al trattamento non differiva tra i sessi. La corretta marcatura della coda e la creazione del taglio sono passaggi essenziali per garantire affidabilità e riproducibilità nella tecnica, così come la sfida se non c'è sanguinamento. Inoltre, una buona induzione in anestesia e il mantenimento della temperatura corporea animale è particolarmente rilevante.

Abbiamo anche usato questo modello per studiare l'arresto delle emorragie accertate in un ambiente più on-demand trattando con fattore VIIA 10 minuti dopo aver indotto sanguinamento.