Approccio genetico inverso per identificare i regolatori della pigmentazione usando il pesce zebra
1 marzo 2022
I regolatori delle funzioni dei melanociti governano le differenze visibili nel risultato della pigmentazione. Decifrare la funzione molecolare del gene candidato della pigmentazione rappresenta una sfida. Qui, dimostriamo l'uso di un sistema modello di zebrafish per identificare i candidati e classificarli in regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.
Questo protocollo è una fusione di varie tecniche che consentirebbero ai ricercatori di delineare il ruolo del gene candidato nella biologia dei melanociti. È un approccio olistico verso il raggiungimento di un'inferenza logica. Combinando vari metodi, i fattori confondenti possono essere evitati e possono aiutare i ricercatori a ottenere un risultato sostanziale.
Per iniziare l'analisi, immobilizzare i 48 embrioni HPF con 0,016% tricaina. Montare gli embrioni usando pochi millilitri di 1,5-2% di metilcellulosa in una capsula di Petri. Prelevare gli embrioni con una pipetta Pasteur e metterli in metilcellulosa per limitare il movimento durante l'imaging.
Per un'imaging laterale o dorsale ottimale, regolare la loro posizione con un ingrandimento superiore a 5X. Posizionare la capsula di Petri al microscopio. Utilizzando un manipolatore, regolare il pesce in modo che tutte e cinque le strisce embrionali dei melanociti siano visibili contemporaneamente.
Utilizzando il software di acquisizione, catturare le immagini. Se il pesce si risveglia, mettilo in acqua tricaina fino a quando non si stabilizza. Utilizzando lo strumento aperto del software ImageJ, aprire l'immagine da quantificare.
Selezionate lo strumento forma a mano libera per delineare l'area da analizzare. Selezionare l'opzione imposta misure, fare clic sul valore medio del grigio e quindi sull'area. Per calcolare il valore medio di grigio per l'area selezionata, fare clic su M o andare su analizzare e selezionare misura.
In base allo stadio di interesse, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri contenente 0,6 milligrammi per millilitro di Pronase. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire gli embrioni dechorionati in una capsula di Petri contenente acqua embrionale semplice dopo cinque-10 minuti. Con una pipetta Pasteur in vetro, raccogliere e trasferire circa 100 embrioni in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.
Scartare il mezzo e aggiungere 200 microlitri di soluzione Ringers deyolking ghiacciata. Posizionare il tubo sul ghiaccio e mescolare il contenuto circa 20 volte con una pipetta per sciogliere il giogo. Centrifugare i tubi a 100 G per un minuto a quattro gradi Celsius due volte e scartare il surnatante.
Trasferire gli embrioni deyolked utilizzando una pipetta da un millilitro in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di soluzione di tripsina. Mescolare la soluzione una o due volte utilizzando una pipetta da un millilitro per ridurre l'aggregazione. Far passare la sospensione tripsinzzata attraverso un filtro da 70 micrometri posto su un tubo conico da 50 millilitri per raccogliere una sospensione a cella singola.
Lavare le piastre di Petri con la sospensione tripsinizzata per rimuovere le cellule aderenti dalla superficie. Per contare le celle marcate con fluorescenza utilizzando un citometro a flusso, dopo aver creato una nuova cartella dell'esperimento, disegnare un grafico a dispersione laterale rispetto a un grafico a dispersione laterale. Fai un istogramma per l'intensità dell'isotiocianato di fluoresceina.
Caricare prima le celle di tipo wild per impostare i gate di dispersione anteriore e laterale e la soglia FITC. Successivamente, caricare le cellule isolate dagli embrioni transgenici della linea FTYRP GFP per contare i melanociti. Montare gli embrioni in 1,5-2% di metilcellulosa in una capsula di Petri.
Posizionarlo sotto il microscopio e regolarlo nell'orientamento desiderato utilizzando una punta per pipetta. Utilizzando il software di acquisizione, acquisire le immagini. Per gli embrioni inferiori a 24 HPF, utilizzando un ingrandimento 10X, catturare l'intera immagine, mentre per gli embrioni più di 24 HPF, acquisire più campi di scansione e successivamente assemblarli.
Dopo aver eseguito il test, l'imaging Brightfield dopo 48 ore ha rivelato la presenza di tutte e cinque le strisce melanofore pigmentate. Allo stadio 48 HPF, è stato calcolato il numero di melanofori laterali ed è stato riscontrato che i morfani h2afv della variante istonica hanno dimostrato un numero ridotto di melanofori rispetto al controllo. Il valore medio del grigio è stato misurato per i morfalanti CA14 e h2afv, che hanno rivelato che i valori erano più alti per le varianti rispetto ai morfi di controllo.
Utilizzando un metodo di assorbimento spettrofotometrico basato sull'idrossido di sodio, il contenuto di melanina è stato quantificato dove i morfanti CA14 mostravano un contenuto inferiore rispetto ai morfani di controllo. L'imaging a fluorescenza è stato eseguito per valutare l'alterazione a base di morfolino per diversi stadi dello sviluppo del melanoforo zebrafish. Il numero di melanofori nei morfalanti CA14 e h2afv è stato analizzato utilizzando FACS.
È stato osservato che il numero di melanofori in CA14 è rimasto invariato, mentre sono stati significativamente ridotti in h2afv rispetto al morphant di controllo. È stata calcolata anche l'intensità media di fluorescenza per area, dimostrando che i morfalanti h2afv mostrano una notevole diminuzione del valore relativo ai morfalanti di controllo. Mentre regoli il pesce prima dell'imaging, assicurati di poter visualizzare tutte e cinque le strisce melanofore.
È necessario inclinare leggermente il pesce per distinguere tra le due strisce laterali. Dopo aver stabilito il ruolo di un gene candidato nello sviluppo dei melanociti, possiamo eliminare il gene in modo tessuto-specifico utilizzando la tecnologia CRISPR. Sarà un approccio più mirato.
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Panoramica
Questo studio analizza il ruolo dei geni candidati per la pigmentazione nella biologia dei melanociti, utilizzando un sistema modello di pesce zebra. Impiegando diverse tecniche di imaging e saggi, la ricerca identifica i principali regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Sviluppo dei melanociti
- Genetica della pigmentazione
- Il pesce zebra come organismo modello
Sfondo
- Comprendere la funzione molecolare dei geni della pigmentazione è essenziale per decifrare le variazioni del colore della pelle.
- I fattori di confondimento nella ricerca possono ostacolare una valutazione accurata delle funzioni geniche.
- I blastocisti di zebrafish costituiscono un modello efficace per lo studio dei processi dello sviluppo precoce nella pigmentazione.
Metodi Utilizzati
- Immobilizzazione degli embrioni e tecniche di imaging
- Il pesce zebra come modello biologico
- Citometria a flusso per il conteggio dei melanociti e saggi spettrofotometrici per il contenuto di melanina
Risultati principali
- Un numero ridotto di melanofori è stato osservato negli morphanti h2afv rispetto ai controlli.
- Gli morphanti CA14 mostravano un contenuto di melanina inferiore rispetto agli morphanti di controllo.
- L'analisi mediante imaging a fluorescenza ha confermato le differenze nello sviluppo dei melanofori.
Conclusioni
- I risultati illustrano l'importanza di specifici geni della pigmentazione nello sviluppo dei melanociti.
- Questa ricerca ha implicazioni più ampie per la comprensione degli effetti genetici sulla pigmentazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo protocollo consente un'analisi sistematica dei regolatori genetici nello sviluppo dei melanociti, supportando la validazione degli obiettivi in disturbi correlati al pigmento. Combinando imaging fenotipico, citometria a flusso e saggi biochimici, fornisce letture quantitative per ridurre i rischi associati a ipotesi meccanicistiche fin dalle fasi iniziali della scoperta. L'approccio migliora la sicurezza predittiva nella distinzione tra geni che influenzano il numero di melanociti rispetto al contenuto di melanina per cellula, orientando la priorità del portafoglio per modulatori topici o sistemici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette la disamina funzionale di geni candidati in specificatori e differenziatori di melanociti in base agli effetti sul numero cellulare rispetto alla sintesi del pigmento.
- Valore operativo: Utilizza l'abbattimento genico mediante morpholino nei larve di zebrafish per valutare rapidamente le conseguenze fenotipiche sui percorsi di pigmentazione.
- Valore scientifico: Supporta il test delle ipotesi collegando la perturbazione genica a cambiamenti misurabili nel conteggio dei melanofori e nel contenuto di melanina.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output standardizzati e quantitativi, inclusi il valore medio di grigio da immagini in campo chiaro e la concentrazione di melanina mediante spettrofotometria.
- Valore operativo: Integra il conteggio dei melanociti basato su FACS con l'analisi dell'immagine, consentendo uno screening fenotipico ad alto contenuto per identificare modulatori genetici.
- Valore scientifico: Favorisce la riproducibilità del saggio attraverso una definizione precisa delle fasi (48 HPF), dell'immobilizzazione e dei parametri di acquisizione, per confronti longitudinali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Utilizza reporter transgenici GFP (mitfa, tyrp1) per tracciare le fasi di specificazione e differenziazione dei melanociti rilevanti per la biologia della pigmentazione umana.
- Valore operativo: Permette la suddivisione dei risultati positivi in classi meccanistiche (specificatori vs. differenziatori) per guidare la validazione successiva in modelli mammiferi.
- Valore scientifico: Fornisce un sistema rilevante per la patologia per valutare geni coinvolti nei percorsi del piebaldismo, dell'albinismo o del vitiligine.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase iniziale della scoperta fino all'identificazione del capostazione, in cui i bersagli genetici vengono convalidati per i loro effetti sulla biologia dei melanociti prima dello screening dei composti o di ulteriori indagini meccanistiche.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione del target isolando gli effetti specifici del gene sullo sviluppo dei melanociti mediante fenocopia con morpholino e imaging quantitativo.
- Screening: Permette modelli di pesce zebra pronti per saggi, dotati di reporter fluorescenti, per la valutazione su larga scala di modulatori genetici o di piccole molecole.
- Analisi: Fornisce letture multiparametriche — numero di melanofori (FACS), contenuto di melanina (spettrofotometria) e distribuzione spaziale (imaging) — per supportare la selezione dei risultati basata sui dati.
- Ricerca traslazionale: Utilizza marcatori conservati dei melanociti (mitfa, tyrp1) per collegare i risultati ottenuti nel pesce zebra ai meccanismi di pigmentazione umana.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening della genetica della pigmentazione, applicabile a diverse famiglie di target e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica distinguendo i geni che alterano la specificazione dei melanociti da quelli che influenzano la produzione di pigmento per cellula.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di manipolazione, acquisizione delle immagini e dissociazione degli embrioni per garantire la riproducibilità tra laboratori e campagne di screening.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto fornendo un'attendibilità fenotipica precoce sul meccanismo bersaglio prima di investire in chimica medicinale.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sulla validazione genetica di fenotipi specifici dei melanociti.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta competenza in embriologia del pesce zebra, microiniezione e progettazione di morfolini per una valutazione fenotipica accurata.
- La strumentazione include microscopi a fluorescenza, citometri a flusso e spettrofotometri per letture multiparametriche.
- La standardizzazione tra gruppi di lavoro richiede una sincronizzazione delle fasi di sviluppo (HPF), protocolli di immobilizzazione e impostazioni di acquisizione immagini per ridurre al minimo la variabilità.
- L'adattamento ad altri modelli potrebbe richiedere la validazione di reporter espressi da promotori conservati e di endpoint fenotipici.
- Le limitazioni includono effetti fuori bersaglio dei morfolini e un silenziamento transitorio, che rendono necessario un approfondimento mediante CRISPR o linee mutanti per la conferma del bersaglio.
