Approccio genetico inverso per identificare i regolatori della pigmentazione usando il pesce zebra
March 1st, 2022
I regolatori delle funzioni dei melanociti governano le differenze visibili nel risultato della pigmentazione. Decifrare la funzione molecolare del gene candidato della pigmentazione rappresenta una sfida. Qui, dimostriamo l'uso di un sistema modello di zebrafish per identificare i candidati e classificarli in regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.
Questo protocollo è una fusione di varie tecniche che consentirebbero ai ricercatori di delineare il ruolo del gene candidato nella biologia dei melanociti. È un approccio olistico verso il raggiungimento di un'inferenza logica. Combinando vari metodi, i fattori confondenti possono essere evitati e possono aiutare i ricercatori a ottenere un risultato sostanziale.
Per iniziare l'analisi, immobilizzare i 48 embrioni HPF con 0,016% tricaina. Montare gli embrioni usando pochi millilitri di 1,5-2% di metilcellulosa in una capsula di Petri. Prelevare gli embrioni con una pipetta Pasteur e metterli in metilcellulosa per limitare il movimento durante l'imaging.
Per un'imaging laterale o dorsale ottimale, regolare la loro posizione con un ingrandimento superiore a 5X. Posizionare la capsula di Petri al microscopio. Utilizzando un manipolatore, regolare il pesce in modo che tutte e cinque le strisce embrionali dei melanociti siano visibili contemporaneamente.
Utilizzando il software di acquisizione, catturare le immagini. Se il pesce si risveglia, mettilo in acqua tricaina fino a quando non si stabilizza. Utilizzando lo strumento aperto del software ImageJ, aprire l'immagine da quantificare.
Selezionate lo strumento forma a mano libera per delineare l'area da analizzare. Selezionare l'opzione imposta misure, fare clic sul valore medio del grigio e quindi sull'area. Per calcolare il valore medio di grigio per l'area selezionata, fare clic su M o andare su analizzare e selezionare misura.
In base allo stadio di interesse, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri contenente 0,6 milligrammi per millilitro di Pronase. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire gli embrioni dechorionati in una capsula di Petri contenente acqua embrionale semplice dopo cinque-10 minuti. Con una pipetta Pasteur in vetro, raccogliere e trasferire circa 100 embrioni in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.
Scartare il mezzo e aggiungere 200 microlitri di soluzione Ringers deyolking ghiacciata. Posizionare il tubo sul ghiaccio e mescolare il contenuto circa 20 volte con una pipetta per sciogliere il giogo. Centrifugare i tubi a 100 G per un minuto a quattro gradi Celsius due volte e scartare il surnatante.
Trasferire gli embrioni deyolked utilizzando una pipetta da un millilitro in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di soluzione di tripsina. Mescolare la soluzione una o due volte utilizzando una pipetta da un millilitro per ridurre l'aggregazione. Far passare la sospensione tripsinzzata attraverso un filtro da 70 micrometri posto su un tubo conico da 50 millilitri per raccogliere una sospensione a cella singola.
Lavare le piastre di Petri con la sospensione tripsinizzata per rimuovere le cellule aderenti dalla superficie. Per contare le celle marcate con fluorescenza utilizzando un citometro a flusso, dopo aver creato una nuova cartella dell'esperimento, disegnare un grafico a dispersione laterale rispetto a un grafico a dispersione laterale. Fai un istogramma per l'intensità dell'isotiocianato di fluoresceina.
Caricare prima le celle di tipo wild per impostare i gate di dispersione anteriore e laterale e la soglia FITC. Successivamente, caricare le cellule isolate dagli embrioni transgenici della linea FTYRP GFP per contare i melanociti. Montare gli embrioni in 1,5-2% di metilcellulosa in una capsula di Petri.
Posizionarlo sotto il microscopio e regolarlo nell'orientamento desiderato utilizzando una punta per pipetta. Utilizzando il software di acquisizione, acquisire le immagini. Per gli embrioni inferiori a 24 HPF, utilizzando un ingrandimento 10X, catturare l'intera immagine, mentre per gli embrioni più di 24 HPF, acquisire più campi di scansione e successivamente assemblarli.
Dopo aver eseguito il test, l'imaging Brightfield dopo 48 ore ha rivelato la presenza di tutte e cinque le strisce melanofore pigmentate. Allo stadio 48 HPF, è stato calcolato il numero di melanofori laterali ed è stato riscontrato che i morfani h2afv della variante istonica hanno dimostrato un numero ridotto di melanofori rispetto al controllo. Il valore medio del grigio è stato misurato per i morfalanti CA14 e h2afv, che hanno rivelato che i valori erano più alti per le varianti rispetto ai morfi di controllo.
Utilizzando un metodo di assorbimento spettrofotometrico basato sull'idrossido di sodio, il contenuto di melanina è stato quantificato dove i morfanti CA14 mostravano un contenuto inferiore rispetto ai morfani di controllo. L'imaging a fluorescenza è stato eseguito per valutare l'alterazione a base di morfolino per diversi stadi dello sviluppo del melanoforo zebrafish. Il numero di melanofori nei morfalanti CA14 e h2afv è stato analizzato utilizzando FACS.
È stato osservato che il numero di melanofori in CA14 è rimasto invariato, mentre sono stati significativamente ridotti in h2afv rispetto al morphant di controllo. È stata calcolata anche l'intensità media di fluorescenza per area, dimostrando che i morfalanti h2afv mostrano una notevole diminuzione del valore relativo ai morfalanti di controllo. Mentre regoli il pesce prima dell'imaging, assicurati di poter visualizzare tutte e cinque le strisce melanofore.
È necessario inclinare leggermente il pesce per distinguere tra le due strisce laterali. Dopo aver stabilito il ruolo di un gene candidato nello sviluppo dei melanociti, possiamo eliminare il gene in modo tessuto-specifico utilizzando la tecnologia CRISPR. Sarà un approccio più mirato.
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Panoramica
Questo studio indaga il ruolo dei geni candidati della pigmentazione nella biologia dei melanociti utilizzando un sistema modello di zebrafish. Impiegando varie tecniche di imaging e saggi, la ricerca identifica i regolatori chiave del contenuto di melanina e del numero di melanociti.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Sviluppo dei melanociti
- Genetica della pigmentazione
- Zebrafish come organismo modello
Contesto
- Comprendere la funzione molecolare dei geni della pigmentazione è essenziale per decifrare le variazioni del colore della pelle.
- Fattori confondenti nella ricerca possono ostacolare una valutazione accurata delle funzioni geniche.
- Gli embrioni di zebrafish forniscono un modello efficace per studiare i primi processi di sviluppo nella pigmentazione.
Metodi utilizzati
- Immobilizzazione di embrioni e tecniche di imaging
- Zebrafish come modello biologico
- Flow cytometry per contare i melanociti e saggi spettrofotometrici per il contenuto di melanina
Risultati principali
- È stato osservato un numero ridotto di melanofori nei morphants h2afv rispetto ai controlli.
- I morphants CA14 hanno mostrato meno contenuto di melanina rispetto ai morphants di controllo.
- L'imaging a fluorescenza ha confermato differenze di sviluppo nei melanofori.
Conclusioni
- I risultati illustrano l'importanza di specifici geni della pigmentazione nello sviluppo dei melanociti.
- Questa ricerca ha implicazioni più ampie per comprendere le influenze genetiche sulla pigmentazione.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables systematic interrogation of genetic regulators in melanocyte development, supporting target validation in pigment-related disorders. By combining phenotypic imaging, flow cytometry, and biochemical assays, it provides quantitative readouts for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach enhances predictive confidence in distinguishing genes affecting melanocyte number versus melanin content per cell, informing portfolio prioritization for topical or systemic modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional dissection of candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators based on effects on cell number versus pigment synthesis.
- Operational Value: Uses morpholino knockdown in zebrafish larvae to rapidly assess phenotypic consequences on pigmentation pathways.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing by linking gene perturbation to measurable changes in melanophore count and melanin content.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs including mean gray value from brightfield imaging and melanin concentration via spectrophotometry.
- Operational Value: Integrates FACS-based melanocyte counting with imaging to enable high-content phenotypic screening of genetic modulators.
- Scientific Value: Facilitates assay reproducibility through defined staging (48 HPF), immobilization, and imaging parameters for longitudinal comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses transgenic GFP reporters (mitfa, tyrp1) to track melanocyte specification and differentiation stages relevant to human pigmentation biology.
- Operational Value: Enables segregation of hits into mechanistic classes (specifiers vs. differentiators) to guide downstream validation in mammalian models.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for evaluating genes implicated in piebaldism, albinism, or vitiligo pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are validated for effects on melanocyte biology before compound screening or mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports target validation by isolating gene-specific effects on melanocyte development through morpholino phenocopy and quantitative imaging.
- Screening: Enables assay-ready zebrafish models with fluorescent reporters for scalable evaluation of genetic or small-molecule modulators.
- Analytics: Delivers multiparametric readouts—melanophore number (FACS), melanin content (spectrophotometry), and spatial distribution (imaging)—to support data-driven hit triage.
- Translational Research: Uses conserved melanocyte markers (mitfa, tyrp1) to bridge zebrafish findings to human pigmentation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pigment genetics screening applicable across target families and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing genes that alter melanocyte specification from those affecting pigment production per cell.
- Operational Value: Standardizes embryo handling, imaging, and dissociation protocols to ensure reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic confidence in target mechanism before investing in medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on genetic validation of melanocyte-specific phenotypes.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology, microinjection, and morpholino design is required for accurate phenotypic assessment.
- Instrumentation includes fluorescence microscopes, flow cytometers, and spectrophotometers for multiparametric readout.
- Standardization across teams requires synchronized staging (HPF), immobilization protocols, and imaging settings to minimize variability.
- Adaptation to other models may require validation of conserved promoter-driven reporters and phenotypic endpoints.
- Limitations include morpholino off-target effects and transient knockdown, necessitating follow-up with CRISPR or mutant lines for target confirmation.
