Generazione di unità motorie umane con giunzioni neuromuscolari funzionali in dispositivi microfluidici

Questo metodo relativamente semplice può aiutare la ricerca concentrandosi sui motoneuroni e sulle giunzioni neuromuscolari nella salute e nella malattia. Questo protocollo utilizza la tecnologia standard delle cellule staminali e dispositivi microfluidici disponibili in commercio che aumentano la riproducibilità. La disconnessione dei motoneuroni e delle cellule muscolari è un fenomeno precoce in diverse malattie neuromuscolari.

Un semplice modello umanizzato potrebbe aiutare a sviluppare strategie per contrastare questo fenomeno. Usiamo questo modello per studiare il disturbo del motoneurone, la sclerosi laterale amiotrofica, tuttavia, questo modello può essere utilizzato anche per altri disturbi in cui l'unità motoria è essenziale. Inizia trasferendo il dispositivo utilizzando la pinza dal contenitore di spedizione alla capsula di Petri contenente 10 millilitri di etanolo dal 70% al 100% per la sterilizzazione per 10 secondi.

Trasferire il dispositivo con pinza su un pezzo di carta per asciugare all'aria nel flusso laminare per circa 30 minuti. Una volta che un dispositivo è stato asciugato, utilizzare una pinza per spostare ogni dispositivo su una singola capsula di Petri di 10 centimetri. Per rivestire il dispositivo con Poly-L-ornitina o PLO, aggiungere 100 microlitri di soluzione PLO al pozzo superiore e osservare il fluido che passa dal pozzo superiore attraverso il canale al pozzo inferiore.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione PLO al pozzetto inferiore e ripetere sull'altro lato delle micro scanalature. Completa aggiungendo 100 microlitri di soluzione PLO su un lato per creare un gradiente di volume tra i due lati specchiati del dispositivo per rivestire le micro scanalature. Incubare per tre ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo tre ore, lavare il dispositivo tre volte per cinque minuti con DPBS. Rivestire il dispositivo con 20 microgrammi per millilitro laminina e mezzo neurobasale seguendo la procedura simile al rivestimento PLO. Incubare il dispositivo durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Il giorno seguente utilizzare una pipetta da 200 microlitri e posizionare la punta nel pozzetto opposto all'apertura del canale per rimuovere il rivestimento laminina dai pozzetti. Dopo aver aggiunto DPBS a tutti i pozzetti, lasciare i dispositivi con DPBS nel flusso laminare a temperatura ambiente per la semina cellulare. Tagliare i fogli SCM alle dimensioni del dispositivo lasciando alcuni millimetri su ciascun lato.

Dopo aver sterilizzato i dispositivi e i fogli SCM in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di etanolo dal 70% al 100% per 10 secondi, trasferire i dispositivi con pinza su una piastra a sei pozzetti e i fogli SCM su una capsula di Petri di 10 centimetri per l'essiccazione all'aria nel flusso laminare. Posizionare il dispositivo sul bordo per consentire a tutti i lati di asciugarsi per circa 30 minuti. Rivestire i dispositivi aggiungendo un millilitro di soluzione PLO per pozzetto a ciascun dispositivo nella piastra a sei pozzetti.

Assicurarsi che il dispositivo galleggi sulla parte superiore della soluzione PLO con il canale e il lato micro scanalatura rivolti verso il basso nel liquido. Rivestire i fogli SCM aggiungendo 10 millilitri di soluzione PLO alla capsula di Petri da 10 centimetri e utilizzare la pinza per spingere verso il basso i fogli SCM nel liquido. Incubare dispositivi e fogli SCM per tre ore come dimostrato in precedenza.

Dopo tre ore, lavare i dispositivi e i fogli SCM due volte per cinque minuti con DPBS seguito da un altro lavaggio per cinque minuti con acqua sterile. Quindi trasferire ogni foglio SCM su una singola capsula di Petri da 10 centimetri per asciugare all'aria. Mentre si lavora al microscopio nel flusso laminare, utilizzare una pinza per montare il dispositivo in silicone con il canale e la micro scanalatura rivolti verso il basso con un angolo di 90 gradi sul foglio SCM assicurando che tutti i lati siano allineati.

Premere leggermente verso il basso sul dispositivo per assicurarsi di sigillare non solo i bordi esterni, ma anche intorno a pozzetti, canali e micro scanalature. Per rivestire il dispositivo con laminina, all'interno del flusso laminare e al microscopio, aggiungere 100 microlitri di 20 microgrammi per millilitro di soluzione di laminina nel pozzo superiore utilizzando una pipetta da 200 microlitri. Osservare il fluido che passa dal pozzo superiore attraverso il canale al pozzo inferiore senza alcuna perdita intorno al pozzo e al canale.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di soluzione di laminina sul pozzetto inferiore, ripetere sull'altro lato delle micro scanalature e finire con ulteriori 100 microlitri di laminina su un lato per creare un gradiente di volume tra i due lati specchiati del dispositivo per rivestire le micro scanalature, quindi incubare il dispositivo durante la notte. Il giorno seguente, rimuovere il rivestimento dai pozzetti con la pipetta da 200 microlitri posizionando la punta nel pozzo opposto all'apertura del canale, dopo aver aggiunto DPBS a tutti i pozzetti, lasciare i dispositivi con DPBS nel flusso laminare a temperatura ambiente per la semina cellulare. Per placcare le cellule progenitrici neurali o gli NPC nel dispositivo microfluidico, rimuovere DPBS da due pozzetti su un lato delle micro scanalature nel dispositivo utilizzando una pipetta da 200 microlitri.

Per seminare un totale di 250.000 NPC e da 60 a 100 microlitri del mezzo motoneurone del giorno 10 per dispositivo, nel pozzo in alto a destra, seminare metà della sospensione cellulare vicino all'apertura del canale con un angolo di 45 gradi. Sospendere per alcuni secondi per consentire alla sospensione cellulare di fluire attraverso il canale prima di aggiungere la metà rimanente della sospensione cellulare nel pozzetto inferiore. Utilizzare una penna per contrassegnare il lato seminato come NPC o equivalente, per un facile orientamento del dispositivo senza microscopio, e incubare per cinque minuti per il fissaggio cellulare.

Quindi, rabboccare lentamente i due pozzetti seminati NPC con un ulteriore mezzo motoneurone del giorno 10 per un volume totale di 200 microlitri per pozzetto. Usando una pipetta da 200 microlitri, rimuovere DPBS dai due pozzetti dall'altra parte delle micro scanalature opposte agli NPC appena seminati. Aggiungere 200 microlitri del giorno 10 media di motoneuroni per pozzetto ai pozzetti non seminati.

Quindi aggiungere sei millilitri di DPBS per piatto da 10 centimetri attorno al dispositivo per evitare l'evaporazione del mezzo durante l'incubazione. Per cambiare il mezzo, rimuovere lentamente i supporti in entrambi i pozzetti con NPC posizionando la punta della pipetta da 200 microlitri sul bordo inferiore della parete del pozzo di fronte all'apertura del canale. Per evitare che un forte flusso medio danneggi le cellule sul canale, aggiungere lentamente da 50 a 100 microlitri di mezzo motoneurone fresco a ciascun pozzetto cambiando continuamente tra il pozzetto superiore e inferiore.

Ripetere il processo fino a quando ogni pozzetto contiene 200 microlitri di mezzo. Il giorno 17 della differenziazione del motoneurone, rimuovere il mezzo del motoneurone sul lato non seminato delle micro scanalature nel dispositivo con una pipetta da 200 microlitri e lavare i pozzetti con DPBS. Semina un totale di 200.000 mesoangioblasti primari umani o MAB, in 60-100 microlitri di terreno di coltura per dispositivo seminando metà della sospensione cellulare nel pozzo superiore.

Pausa di alcuni secondi per consentire alla sospensione cellulare di fluire attraverso il canale prima di seminare la metà rimanente della sospensione cellulare nel pozzetto inferiore, come dimostrato in precedenza per la placcatura degli NPC. Incubare il dispositivo per cinque minuti per il fissaggio cellulare. Quindi rabboccare i due pozzetti appena seminati MAB con un mezzo di crescita aggiuntivo e incubare di nuovo come dimostrato.

Per iniziare la tattica della chemio e il gradiente volumetrico il 21 ° giorno della differenziazione del motoneurone, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di mezzo neurobasale del motoneurone contenente fattori di crescita al compartimento del miotubo, quindi aggiungere 100 microlitri per pozzetto di mezzo basale del motoneurone senza fattori di crescita al compartimento del motoneurone. È importante valutare il potenziale di differenziazione delle linee cellulari prima di co-coltivarle in dispositivi microfluidici. È stato determinato l'indice di fusione dei MAB e circa l'8% è stato stimato sufficiente per la co-coltura.

Le colture di motoneuroni generate erano positive dall'85 al 95% per i marcatori del motoneurone. Per caratterizzare e quantificare la quantità di giunzioni neuromuscolari o NMJ, il numero di co-localizzazioni tra il motoneurone e i marcatori pre-sinaptici a catena pesante del neurofilamento e sinaptofisina e marcatore del recettore dell'acetilene postsina alfa bungarotossina, è stato contato attraverso ogni pila di malattie ed è stato normalizzato in un numero di Myotubes marcati a catena pesante di miosina presenti nello stack Z. Gli NMJ sono apparsi come NMJ a punto di contatto singolo in cui il neurite ha toccato un gruppo di un sottile recettore della colina in un punto di interazione.

O come NMJ a punto di contatto multiplo in cui un neurite si è sfogato e si è impegnato con un sottile cluster di recettori della colina su una superficie più ampia. La quantificazione della percentuale di Myotubes innovati dai motoneuroni ha indicato che non tutti i miotubi contenevano NMJ. Dopo l'attivazione del motoneurone con cloruro di potassio, l'afflusso di calcio è stato osservato nei myotubi marcati Fluo-4, che hanno confermato una connessione funzionale attraverso il neurite del motoneurone nel miotubo, l'aggiunta del bloccante NMJ d-tubocurarina, o DTC al compartimento del miotubo ha provocato un'inibizione dell'afflusso di calcio.

Per avere il maggior successo con questo modello è incredibilmente importante eseguire un controllo di qualità della linea cellulare ed evitare la formazione di bolle d'aria nei canali del dispositivo. Combinando la giunzione neuromuscolare in un piatto con altri tipi di cellule dirette IPC imita ancora meglio la situazione in vitro, questo permette anche di studiare il ruolo di questi tipi di cellule.