Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Questo metodo può aiutare a rispondere a una delle domande chiave in campo riproduttivo, vale a dire come e quando i processi geneticamente regolati influenzano la dimensione della riserva ovarica che sappiamo avere un impatto sulle femmine, la longevità riproduttiva Questo protocollo può essere adottato per studi su larga scala utilizzando le stesse tecniche per ovaie intatte di diversi stadi di sviluppo. Genera dati producibili fornendo una quantificazione efficiente delle cellule germinali. Questo metodo applicato ad animali geneticamente diversi della stessa specie può fornire informazioni sui fattori genetici direttamente cellule germinali e sviluppo ovarico e altri organi di sviluppo.

A dimostrare la procedura sarà Nathaniel Boechat, uno stagista di ricerca del mio laboratorio Per iniziare con il punto di passo di profusione e fissare il topo femmina puberale anestetizzato sulla schiena bloccando delicatamente tutte le gambe attraverso le zampe in una posizione rilassata su una tavola. Per aprire la cavità toracica del topo, tagliare con cura le costole su entrambi i lati dello sterno appena sotto la scapola, evitando di perforare i polmoni afferrare la pelle o i lembi delle costole con la pinza e appuntare i lembi per esporre gli organi interni utilizzare le forbici di dissezione per tagliare l'atrio destro del cuore e rilasciare sangue dal sistema. Quindi tenendo il cuore con una pinza inserire un ago di perfusione nel ventricolo sinistro e pompare 10 millilitri di PBS con una pressione delicata e costante.

Quando i tessuti come i reni del fegato e il tratto riproduttivo sono passati dal rosa al bianco, sostituire il PBS con paraformaldeide o PFA appena prodotti all'1% e continuare la perfusione con circa 10 millilitri di PFA. Quindi individuare il cuscinetto di grasso con le ovaie sotto il rene e sezionare delicatamente l'intero tratto riproduttivo, comprese le ovaie del cuscinetto adiposo e le corna uterine per posizionarlo in una fiala con il 4% di PFA. Fissare le ovaie a temperatura ambiente per 16-24 ore prima di sostituire il 4% di PFA con il 70% di etanolo.

Il giorno della colorazione tagliare le ovaie prima di procedere con la colorazione immuno. Il primo giorno del protocollo di immuno colorazione pipetta un millilitro di PBS per pozzo nel numero desiderato di pozzetti in una piastra pulita da 24 pozzetti. Tagliare la punta di una punta della pipetta da 1000 microlitri per fare un'ampia apertura e utilizzare la punta larga per trasferire delicatamente le ovaie puberali dalle fiale con il 70% di etanolo nei pozzetti, quindi sostituire PBS nel pozzo con 0,8 millilitri freschi di PBS Il giorno successivo aspirare PBS dai pozzetti per sostituirlo con 0,8 millilitri del tampone di permeazione per pozzetto.

Dopo aver incubato le piastre sullo shaker a temperatura ambiente per quattro ore sostituire il tampone di permeazione con tampone di blocco Il terzo giorno, preparare gli anticorpi primari per diluizione nel tampone di blocco. Per visualizzare gli ovociti incubare le ovaie prenatali e prepuberali con i marcatori degli ovociti. L'ottavo giorno lavare i campioni con un tampone di lavaggio fresco per due ore, quindi sostituire il tampone di lavaggio con 0,5 millilitri delle miscele di anticorpi secondari diluiti in un tampone bloccante.

Sigillare la piastra con un parafilm per evitare l'evaporazione e incubare i campioni a temperatura ambiente al buio per tre giorni. Il giorno 11 dopo il lavaggio immunocolorante, aspirare il tampone di lavaggio e incubare i campioni con 0,8 millilitri della soluzione di scala cubica a 37 gradi Celsius per tre giorni al buio. Cambiare la scala cubica una soluzione ogni giorno.

Il giorno 15, lavare i campioni tre volte per 10 minuti e 0,8 millilitri di PBS a temperatura ambiente con un leggero scuotimento. Quindi sostituire il PBS con 0,8 millilitri del 20% di saccarosio degassato appena preparato con PBS seguito da un leggero scuotimento a temperatura ambiente. Dopo un'ora sostituire la soluzione di saccarosio al 20% per trattare i campioni con 0,8 millilitri della soluzione di scala cubica due per quattro o cinque giorni, come spiegato in precedenza.

Per preparare un set di campioni, utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri con il taglio della punta per trasferire le ovaie puberali con 15-20 microlitri di soluzione cubica a due in scala nel mezzo del pozzetto adesivo. Una volta che le ovaie vengono trasferite nel pozzetto individuale con una goccia di soluzione di compensazione, posizionare delicatamente un vetro di copertura sul pozzetto adesivo e premere per creare un sigillo che inserisce i campioni e la soluzione di pulizia tra due scivoli di copertura. Per il luogo di imaging, il sandwich di scorrimento del coperchio in un vetrino adattatore per microscopio stampato in 3D.

Impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini in base ai nuclei di microscopia o alle specifiche del produttore. Se disponibile, utilizzare l'acquisizione bidirezionale delle immagini per ridurre i tempi di scansione e migliorare l'efficienza. Regola la media delle linee, la media dei fotogrammi e l'accumulo dei fotogrammi nel software.

Impostare lo stack Z identificando la posizione iniziale e finale, quindi selezionare una dimensione del gradino Z di due micrometri per le ovaie prepuberali e cinque micrometri per le ovaie puberali. Quindi attivare la funzione di compensazione Z e il guadagno di eccitazione. Impostare la compensazione Z per la parte inferiore e superiore del campione selezionando un'intensità laser per entrambi.

Utilizzare la modalità di piastrellatura per campioni più grandi che non possono essere acquisiti in un singolo campo visivo. Attivare il navigatore immagini e indicare il numero di tessere necessarie per acquisire l'intero campione con lo strumento di marcatura rettangolare. Una volta completata l'impostazione, iniziare con l'acquisizione delle immagini per le immagini con più riquadri, iniziare l'acquisizione delle immagini con il navigatore per acquisire tutte le tessere.

Dopo l'acquisizione dell'immagine, salva tutte le immagini. E se sono state acquisite più tessere, esegui lo strumento mosaico unito per unire le tessere in un'unica immagine. Per determinare la dimensione degli ovociti, aprite l'immagine e selezionate l'opzione slice per aprire l'immagine della pila Zs.

Selezionate l'opzione linea e il pannello di misurazione e misurate la distanza disegnando una linea da un bordo di un ovocita o di un marcatore all'altro bordo nel punto più largo per determinare il diametro X Y dell'ovocita. Spostarsi attraverso la pila e ottenere la gamma di diametri per più ovociti dello stesso tipo. Utilizzare la lunghezza più breve come criterio di selezione delle dimensioni per i conteggi degli ovociti.

Quindi, nell'opzione vista 3D, selezionate la feature spot. Nel pannello della scena attivare la funzione aggiungi nuovi spot per aprire il pannello dell'algoritmo. Quindi deselezionare tutte le impostazioni dell'algoritmo come filtro di selezione delle dimensioni con la dimensione degli ovociti ottenuta in precedenza.

Fare clic sulla freccia in avanti del canale per passare al canale sorgente. Quindi selezionare il canale con il marcatore preferito e digitare il diametro acquisito nel diametro stimato X, Y. Dopo la selezione delle dimensioni attivare l'allungamento del modello PSF e la sottrazione dello sfondo che vengono determinati automaticamente.

Quindi, scegliete la singola freccia in avanti da spostare nel pannello dei punti filtro e aggiungete il filtro qualità per determinare una soglia. Per garantire la stima accurata del numero di ovociti ingrandire l'immagine. Successivamente, fai clic sulla doppia freccia per completare i conteggi automatici.

Utilizzare la scheda Modifica per selezionare manualmente gli ovociti persi o deselezionare le particelle non ovocitarie selezionate dalla soglia automatica. Al termine, registrare i dati nella scheda statistiche sotto la scheda generale per ulteriori analisi. Per stimare il numero totale di ovociti e le ovaie danneggiate, aprire le immagini delle ovaie intatte con MRS e selezionare la caratteristica del fotogramma.

Sotto le impostazioni del frame, selezionate i segni di spunta della griglia delle caselle e le etichette di accesso. Nella scheda posizione XYZ selezionare 200 microme per generare segni di spunta con spazi di 200 micrometri in tutte le posizioni XYZ. Utilizzando i segni di spunta di 200 micrometri, selezionare gli ovociti che rientrano nel 50% del volume di ciascuna ovaia.

Fai clic sulla funzione macchie e seleziona le etichette di modifica per classificare gli ovociti che rientrano nella regione del 50% per colore. Nella scala di grigi rappresentativa, si potevano vedere immagini multi fotoni delle ovaie non perfuse e perfuse, i piccoli ovociti nei follicoli primordiali con il sottile strato di colorazione citoplasmatica DDX4. Inoltre, sono stati individuati gli ovociti più grandi all'interno dei follicoli in crescita.

Sono stati studiati i rendering 3D delle immagini multi fotone delle ovaie prenatali e postnatali. Al giorno postnatale 28, l'ovaio della femmina non irradiata di controllo conteneva una grande popolazione di piccoli ovociti nei follicoli primordiali. Al contrario, le ovaie della femmina irradiata con 0,5 grigi della radiazione gamma erano completamente prive di piccoli ovociti nei follicoli primari.

Ma gli ovociti più grandi erano ancora presenti. Per la quantificazione degli ovociti, le immagini 3D multi fotone sono state elaborate nel software MRS utilizzando il filtro gouciano e gli ovociti di piccole e grandi dimensioni sono stati identificati e quantificati utilizzando la funzione spot. Successivamente, la percentuale media degli ovociti è stata calcolata in ogni fase rispetto al numero medio presente al primo stadio E 15,5 numeri di ovociti diminuiti bruscamente tra E 15,5 ed E 18,5 gli ovociti fetali E 15,5 ed E 18,5 espressi linea uno of uno P come visto nelle immagini multi fotone.

L'analisi di intensità ha mostrato espressioni più elevate di linea uno o di una P per ovociti a E 18,5 rispetto a E 15,5. Le ovaie con piccoli danni possono essere utilizzate per l'analisi. Il numero totale di ovociti è determinato utilizzando la correzione computazionale.

Il modello rappresentativo mostra ovociti G CNA positivi nell'ovaio E 15,5 con cinque regioni del 10% evidenziate in un'ovaia intatta. Allo stesso modo, è stata generata un'ovaia simulata con il 10% di regioni incrementali mancanti fino al 50% dell'ovaio. Il numero totale di ovociti e le ovaie simulate sono stati confrontati con le ovaie intatte originali.

E la differenza è stata presentata come la deviazione percentuale Buona perfusione si traduce in una buona qualità dell'immagine. Quindi assicurati che tutti i tessuti siano eliminati con PBS prima di passare al PFA. Assicurarsi che le ovaie siano completamente esposte tagliando via il tessuto in eccesso.

Il protocollo consente un'analisi efficiente di un gran numero di campioni, i dati quantitativi ottenuti da popolazioni di riferimento genetiche come l'incrocio collaborativo o l'output della diversità aiuteranno a identificare i modificatori genetici dello sviluppo degli ovociti e il numero di ovociti.