Name: Immunofluorescenza dellovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per lanalisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Scopri l'immunofluorescenza di ovaio intero con clearing e microscopia multifotonica per analisi 3D quantitativa della riserva ovarica in sviluppo nel topo. Questo metodo supporta studi di tossicologia e diagnostica clinica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (R01 HD093778 a E.B-F e T32 HD007065 a R.B). Ringraziamo Zachary Boucher per la sua assistenza con l'esperimento delle radiazioni. Ringraziamo Mary Ann Handel per la lettura critica del manoscritto. Riconosciamo con gratitudine il contributo di Sonia Erattupuzha e del Microscopy Core Service presso il Jackson Laboratory per l'assistenza di esperti con il lavoro di microscopia descritto in questa pubblicazione e Jarek Trapszo dei servizi di strumenti scientifici presso il Jackson Laboratory per la progettazione della diapositiva dell'adattatore stampato in 3D.

<ol><li>Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+ovarian+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of the ovarian reserve.</a> Frontiers in Genetics. 6, 308(2015).</li>
<li>Pepling, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+primordial+germ+cell+to+primordial+follicle%3A+mammalian+female+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development.</a> Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).</li>
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<li>Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+chemotherapeutic+agents+damage+the+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">How do chemotherapeutic agents damage the ovary.</a> Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).</li>
<li>Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+primary+ovarian+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
<li>Biswas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+interrupted%3A+the+genetics+of+female+infertility+via+meiotic+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure.</a> Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).</li>
<li>Tam, P. P., Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+migration+of+primordial+germ+cells+during+compensatory+growth+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).</li>
<li>Pepling, M. E., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+mouse+germ+cells+form+synchronously+dividing+cysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts.</a> Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).</li>
<li>Pepling, M. E., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+ovarian+germ+cell+cysts+undergo+programmed+breakdown+to+form+primordial+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles.</a> Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).</li>
<li>Adams, I. R., McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+dimorphic+development+of+mouse+primordial+germ+cells%3A+switching+from+oogenesis+to+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis.</a> Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).</li>
<li>McLaren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+mouse+embryonic+germ+cells+into+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis.</a> Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).</li>
<li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+number+of+primordial+follicles+in+the+ovarian+reserve+established%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111(2015).</li>
<li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commuting+the+death+sentence%3A+how+oocytes+strive+to+survive%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).</li>
<li>Baker, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+and+cytological+study+of+germ+cells+in+human+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).</li>
<li>Baker, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+and+cytological+study+of+oogenesis+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey.</a> Journal of Anatomy. 100, Pt 4 761-776 (1966).</li>
<li>Kurilo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+antenatal+development+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in antenatal development in man.</a> Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).</li>
<li>Matova, N., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+animal+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of animal oogenesis.</a> Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).</li>
<li>Malki, S., vander Heijden, G. W., O'Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+retrotransposon+LINE-1+in+fetal+oocyte+attrition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice.</a> Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).</li>
<li>Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+the+ovarian+reserve+in+mice+by+evading+LINE-1+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity.</a> Nature Communications. 11 (1), 330(2020).</li>
<li>Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+checkpoint+eliminates+mouse+oocytes+with+chromosome+synapsis+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure.</a> Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).</li>
<li>Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+female+infertility+by+Chk2+ablation+reveals+the+oocyte+DNA+damage+checkpoint+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway.</a> Science. 343 (6170), 533-536 (2014).</li>
<li>Pepling, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+assembly%3A+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicular assembly: mechanisms of action.</a> Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).</li>
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<li>Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).</li>
<li>Di Giovanna, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+sample+mounting+for+light-sheet+fluorescence+Microscopy+of+clarified+specimens+by+polydimethylsiloxane+casting%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35(2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di immunocolorazione e imaging 3D per le ovaie prenatali e postnatali per studi comparativi ad alto rendimento per la quantificazione delle cellule germinali e la localizzazione delle proteine. Abbiamo sviluppato questo protocollo per analizzare il numero di ovociti nelle ovaie (N = 6-12) in sei punti temporali di sviluppo in 10-16 ceppi diversi, dove 2-4 piastre a 24 pozzetti vengono tipicamente elaborate contemporaneamente. Questo metodo può essere adattato per altri o...

La maggior parte delle femmine di mammifero nascono con un numero finito di ovociti meioticamente arrestati immagazzinati all'interno dei follicoli primordiali, costituendo la riserva ovarica (OR)1,2. La sala operatoria determina la durata complessiva della vita riproduttiva femminile e la salute3. La sala operatoria normalmente diminuisce di dimensioni con l'invecchiamento e può essere prematuramente impoverita in caso di esposizione a determinati agenti genotossici (radiazioni / chemioterapia) e stress ambientali (malnutrizione), portando a infertilità 4,5,6. L'infertilità femminile idiopatica può spesso essere attribuita alla qualità genetica e fisiologica delle uova che si sviluppano dalla sala operatoria e rimane poco compresa 7,8. Poiché la dotazione del follicolo femminile è in gran parte predeterminata dalla nascita, è essenziale comprendere i meccanismi di regolazione coinvolti nella creazione e nel mantenimento della sala operatoria.
Nei topi, la formazione di OR inizia con la specifica delle cellule germinali primordiali (PGC) intorno al giorno embrionale (E) 7.52. I PGC migrano verso le creste genitali, dove risiederanno di circa E10,59. La seguente proliferazione estesa si verifica con citochinesi incomplete con conseguente formazione di cisti che saranno scomposte più tardi nello sviluppo10,11. A circa E12,5, viene determinato il sesso gonadico e la proliferazione della PGC si arresta nelle ovaie. Nelle femmine, le PGC, ora ovociti, entrano nella profase meiotica I (MPI) a circa E13.5 12,13. Gli ovociti progrediscono attraverso MPI estese e arresto nella fase dictyate intorno al momento della nascita. Durante la prima settimana dopo la nascita, ogni ovocita arrestato è circondato da cellule di granulosa, formando così un follicolo primordiale.
Il numero di follicoli primordiali nella sala operatoria di una femmina dipende da quanti ovociti sono sopravvissuti alle onde di eliminazione degli ovociti che si verificano prima e durante l'arresto delle MPI attraverso apoptosi, autofagia o necrosi14,15. La prima ondata si verifica durante lo sviluppo fetale ed è nota come FOA. La FOA è un processo evolutivamente conservato nelle femmine (mammiferi e non mammiferi), per cui si stima che il 50-80% degli ovociti venga eliminato a seconda della specie femminile 16,17,18,19. Nei topi, foa si verifica durante E15.5 a E18.5 ed è stato attribuito alla riattivazione e all'espressione di sequenze line-1 di retrotrasposone che causano la morte degli ovociti20,21. La seconda ondata di eliminazione degli ovociti avviene attraverso un checkpoint meiotico che elimina gli ovociti con difetti meiotici come le rotture a doppio filamento del DNA non riparato (DSB)22,23. La successiva ondata di eliminazione degli ovociti si verifica durante la rottura della cisti, culminando durante la formazione dei follicoli primordiali, ognuno dei quali contiene un singolo ovocita 10,11,24,25.
Nei topi, la riserva follicolare primordiale è in gran parte stabilita dalla pubertà, dopo di che diminuisce quando i follicoli primordiali vengono attivati per la crescita durante i cicli riproduttivi regolari. La dimensione della sala operatoria varia tra le singole donne e tra i diversi ceppi genetici di topi; tuttavia, la regolazione genetica delle dimensioni or non è ben compresa 26,27,28,29. Gli studi genetici sulla regolazione della sala operatoria sono ostacolati dalla mancanza di protocolli standardizzati per studiare le onde di eliminazione degli ovociti durante lo sviluppo prenatale e postnatale. Diverse metodologie di quantificazione degli ovociti sono state sviluppate nei topi, con la più comune e ampiamente utilizzata è la valutazione istomorfometrica delle sezioniistologiche 30,31. In questa tecnica, gli ovociti vengono identificati su sezioni seriali con macchie istologiche, come ematossilina ed eosina (H & E) e marcatori periodici acido-Schiff (PAS) o fluorescenti. Questa tecnica è affidabile se tutte le condizioni rimangono costanti, compreso lo spessore della sezione, il recupero efficiente di tutte le sezioni in tutta l'ovaia e gli schemi di conteggio dei singoli laboratori. Tuttavia, i numeri riportati da diversi laboratori spesso differiscono in modo significativo e quindi non sono facilmente comparabili.
Inoltre, date le differenze genetiche, l'uso di diversi ceppi di topo può anche influenzare la conta degli ovociti. Ulteriori approcci computazionali sono stati sviluppati per la valutazione istomorfometrica e includono il rilevamento automatizzato degli ovociti utilizzando l'approccio del frazionatore, il conteggio automatico utilizzando algoritmi computazionali e la ricostruzione 3D di immagini istologiche per prevenire conteggi multipli dello stesso ovocita 31,32,33,34,35,36 . Anche con questi miglioramenti aggiunti alla valutazione istomorfometrica, la tecnica è relativamente laboriosa, in particolare per studi su larga scala e ad alto rendimento. I dati raccolti potrebbero non essere riproducibili e comparabili tra gli studi a causa delle differenze negli schemi di conteggio, negli algoritmi informatici e nel software utilizzato.
Recentemente, accelerata dallo sviluppo di nuovi metodi di microscopia multifotone e foglio luminoso a media risoluzione e metodi di compensazione ottica dei tessuti, le tecniche di modellazione e analisi 3D per le ovaie intatte stanno diventando il metodo di scelta per quantificare in modo efficiente il numero di ovociti e studiare la localizzazione e la dinamica delle proteine37,38. Questi metodi 3D sono in genere vantaggiosi rispetto ai metodi istologici in quanto i tessuti e gli organi sono meglio conservati e mantenuti intatti. Inoltre, l'analisi e la modellazione 3D forniscono ulteriori informazioni sulla funzione e le interazioni all'interno e tra nicchie o sottostrutture cellulari all'interno dell'organo che possono mancare nell'analisi 2D.
L'analisi 3D di interi organi richiede l'ottimizzazione dei protocolli di fissazione, immunocolorazione e clearing ottico per singoli organi, come le ovaie, senza distorsioni o danni ai tessuti. Per la microscopia ad alta risoluzione è necessaria un'ulteriore ottimizzazione del montaggio del campione per l'imaging e può dipendere dalla piattaforma di imaging disponibile. Infine, l'imaging dell'intera ovaia intatta genera una grande quantità di dati per le successive analisi computazionali. Pertanto, è necessario sviluppare metodi 3D standardizzati per il conteggio degli ovociti per studi comparativi e attraverso le fasi dello sviluppo.
Questo protocollo utilizza protocolli di immunocolorazione standard e di compensazione precedentemente riportati, concentrandosi su un approccio semplice, intuitivo e ad alto rendimento 38,39,40,41. Il protocollo è ottimizzato per analizzare un gran numero di ovaie prenatali e postnatali fino al giorno 28 postnatale (P28) e varie dimensioni di ovaie provenienti da diversi background genetici di topo. Le fasi di immunocolorazione sono simili per tutte le fasi; tuttavia, i protocolli di compensazione differiscono per le ovaie puberali a causa delle loro dimensioni maggiori, ScaleS4(0) e CUBIC per ovaie piccole e grandi, rispettivamente40,41. Inoltre, la perfusione di tutto il corpo viene eseguita nei topi P28 prima della fissazione per prevenire l'autofluorescenza dalle cellule del sangue. Un microscopio multifotone è stato costruito sulla piattaforma Leica DIVE/4Tune come alternativa alla microscopia a fogli luminosi per acquisire immagini, e per questo protocollo è stato scelto il software IMARIS 3D Visualization and Analysis con vari strumenti analitici. Questo protocollo è semplice da seguire e meno pratico, quindi consente di risparmiare tempo. Inoltre, la quantificazione degli ovociti è relativamente rapida, a seconda delle dimensioni dell'ovaio e della disposizione degli ovociti.

<table><tbody><tr><td>incubatore da banco</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2200-H</td><td>37 gradi Incubatrice C</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>ceppo consanguineo di topo</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1435</td><td>Materiale pericoloso</td></tr><tr><td>D-Sorbitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6021</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Barriere reattive FastWells</td><td>GraceBio</td><td>664113</td><td>Guarnizione in silicone appiccicosa e flessibile (pozzetto adesivo)</td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio IgG (H+L) di capra Cross-Adsorbided, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21246</td><td>Diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-ratto IgG di capra (H+L), Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21434</td><td>Diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Software IMARIS</td><td>Oxford Instruments</td><td>Versione 9.7.0</td> Software di <td>visualizzazione e analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Insight X3</td><td>Spectra-Physics</td><td>InSight&nbsp; Laser laser ultraveloce sintonizzabile X3</td><td>per imaging multifotone Software</td></tr><tr><td>LASX</td><td>Leica</td><td>versione 3.5.6</td><td>Software di acquisizione immagini</td></tr><tr><td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td><td>Leica</td><td>Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td><td>Microscopio multifotone</td></tr><tr><td>MaiTai HP</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai DeepSee One Box Laser ultraveloce</td><td>per imaging multifotone</td></tr><tr><td>Masterflex Pump Controller</td><td>SPW Modello industriale</td><td>: 7553-50</td><td>Pompa peristaltica per perfusione</td></tr><tr><td>Forbici Mayo</td><td>FST</td><td>14010-17</td><td>5" - ndash; 7 pollici forbici smussate/smussate per decapitazione</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, quadrato, n. 1.5 25x25mm</td><td>VWR</td><td>48366-249</td><td></td></tr><tr><td>Mini BioMixer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>B3D1020</td><td>shaker/nutator per 37 &deg; Incubatrice C</td></tr><tr><td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td><td>Leica</td><td>&nbsp; SMZ1270</td><td>stereomicroscopio</td></tr><tr><td>Paraformaldeide 16% (soluzione acquosa di formaldeide)</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 15710</td><td>Materiale pericoloso</td></tr><tr><td>PBS Compresse, soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2944100</td><td>Sciogliere in acqua Milli-Q</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina, 200x, doppia soluzione antibiotica</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ICN1670249</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polivinilico (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol (N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrakis(2-Idrossipropiletilendiammina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-DDX4/MVH</td><td>Abcam</td><td>ab27591</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Coniglio anti-LINE-1 ORF1p</td><td>Abcam</td><td>ab216324</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Ratto anti-TRA98/GCNA</td><td>Abcam</td><td>ab82527</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Materiale pericoloso</td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>Materiale pericoloso</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tekmar Orbital Shaker</td><td>Bimedis</td><td>VXR-S10</td><td>agitatore per</td></tr><tr><td>trietanolammina</td> <td>a temperatura ambienteSigma-Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UNOLOK Set di infusione</td><td>MYCO Medical</td><td>7001-23</td><td>aghi per perfusione</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Amresco</td><td>97061-920</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120LED</td><td>Excelitas</td><td>S / N XT640-W-0147</td><td>lampada a fluorescenza LED a bassa potenza</td></tr></tbody></table>

immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3d della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

La fertilità femminile e la durata della vita riproduttiva dipendono dalla qualità e dalla quantità della riserva ovocitaria ovarica. Si stima che l'80% delle cellule germinali femminili che entrano nella profase meiotica I vengano eliminate durante l'attrito fetale degli ovociti (FOA) e la prima settimana di vita postnatale. Tre meccanismi principali regolano il numero di ovociti che sopravvivono durante lo sviluppo e stabiliscono la riserva ovarica nelle femmine che entrano nella pubertà. Nella prima ondata di perdita di ovociti, il 30-50% degli ovociti viene eliminato durante la FOA precoce, un fenomeno che viene attribuito all'elevata espressione dell'elemento nucleare-1 intervallato lungo (LINE-1). La seconda ondata di perdita di ovociti è l'eliminazione degli ovociti con difetti meiotici mediante un checkpoint di qualità meiotico. La terza ondata di perdita di ovociti si verifica perinatale durante la formazione del follicolo primordiale quando alcuni ovociti non riescono a formare follicoli. Non è chiaro cosa regoli ciascuna di queste tre ondate di perdita di ovociti e come modellano la riserva ovarica nei topi o negli esseri umani.
L'immunofluorescenza e la visualizzazione 3D hanno aperto una nuova strada per l'immagine e l'analisi dello sviluppo degli ovociti nel contesto dell'intera ovaia piuttosto che in sezioni 2D meno informative. Questo articolo fornisce un protocollo completo per l'immunocolorazione dell'ovaio intero e la compensazione ottica, producendo preparati per l'imaging utilizzando la microscopia multifotonica e la modellazione 3D utilizzando il software disponibile in commercio. Mostra come questo metodo può essere utilizzato per mostrare la dinamica dell'attrito degli ovociti durante lo sviluppo ovarico nei topi C57BL / 6J e quantificare la perdita di ovociti durante le tre ondate di eliminazione degli ovociti. Questo protocollo può essere applicato alle ovaie prenatali e postnatali precoci per la visualizzazione e la quantificazione degli ovociti, nonché altri approcci quantitativi. È importante sottolineare che il protocollo è stato sviluppato strategicamente per ospitare un'elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile in grado di soddisfare le esigenze in tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

L'immunocolorazione e l'imaging dell'intera ovaia consentono la visualizzazione e la quantificazione dell'espressione di ovociti o proteine nelle ovaie in diversi stadi di sviluppo utilizzando la stessa tecnica e marcatori (Figura 3). Questo protocollo è stato sviluppato per un progetto su larga scala in cui era richiesta l'analisi delle ovaie in più fasi e da più ceppi di topo. Qui presentiamo i dati raccolti per il ceppo C57BL6/J, un ceppo standard per l'analisi genetica. La tecnica qui pr...

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'imaging di intere ovaie per analisi quantitative e qualitative utilizzando immunocolorazione a montaggio intero, microscopia multifotonica e visualizzazione e analisi 3D. Questo protocollo supporta un'elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile applicabile per tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a una delle domande chiave in campo riproduttivo, vale a dire come e quando i processi geneticamente regolati influenzano la dimensione della riserva ovarica che sappiamo avere un impatto sulle femmine, la longevità riproduttiva Questo protocollo può essere adottato per studi su larga scala utilizzando le stesse tecniche per ovaie intatte di diversi stadi di sviluppo. Genera dati producibili fornendo una quantificazione efficiente delle cellule germinali. Questo metodo applicato ad animali geneticamente diversi della stessa specie può fornire informazioni sui fattori genetici direttamente cellule germinali e sviluppo ovarico e altri organi di sviluppo.A dimostrare la procedura sarà Nathaniel Boechat, uno stagista di ricerca del mio laboratorio Per iniziare con il punto di passo di profusione e fissare il topo femmina puberale anestetizzato sulla schiena bloccando delicatamente tutte le gambe attraverso le zampe in una posizione rilassata su una tavola. Per aprire la cavità toracica del topo, tagliare con cura le costole su entrambi i lati dello sterno appena sotto la scapola, evitando di perforare i polmoni afferrare la pelle o i lembi delle costole con la pinza e appuntare i lembi per esporre gli organi interni utilizzare le forbici di dissezione per tagliare l'atrio destro del cuore e rilasciare sangue dal sistema. Quindi tenendo il cuore con una pinza inserire un ago di perfusione nel ventricolo sinistro e pompare 10 millilitri di PBS con una pressione delicata e costante.Quando i tessuti come i reni del fegato e il tratto riproduttivo sono passati dal rosa al bianco, sostituire il PBS con paraformaldeide o PFA appena prodotti all'1% e continuare la perfusione con circa 10 millilitri di PFA. Quindi individuare il cuscinetto di grasso con le ovaie sotto il rene e sezionare delicatamente l'intero tratto riproduttivo, comprese le ovaie del cuscinetto adiposo e le corna uterine per posizionarlo in una fiala con il 4% di PFA. Fissare le ovaie a temperatura ambiente per 16-24 ore prima di sostituire il 4% di PFA con il 70% di etanolo.Il giorno della colorazione tagliare le ovaie prima di procedere con la colorazione immuno. Il primo giorno del protocollo di immuno colorazione pipetta un millilitro di PBS per pozzo nel numero desiderato di pozzetti in una piastra pulita da 24 pozzetti. Tagliare la punta di una punta della pipetta da 1000 microlitri per fare un'ampia apertura e utilizzare la punta larga per trasferire delicatamente le ovaie puberali dalle fiale con il 70% di etanolo nei pozzetti, quindi sostituire PBS nel pozzo con 0,8 millilitri freschi di PBS Il giorno successivo aspirare PBS dai pozzetti per sostituirlo con 0,8 millilitri del tampone di permeazione per pozzetto.Dopo aver incubato le piastre sullo shaker a temperatura ambiente per quattro ore sostituire il tampone di permeazione con tampone di blocco Il terzo giorno, preparare gli anticorpi primari per diluizione nel tampone di blocco. Per visualizzare gli ovociti incubare le ovaie prenatali e prepuberali con i marcatori degli ovociti. L'ottavo giorno lavare i campioni con un tampone di lavaggio fresco per due ore, quindi sostituire il tampone di lavaggio con 0,5 millilitri delle miscele di anticorpi secondari diluiti in un tampone bloccante.Sigillare la piastra con un parafilm per evitare l'evaporazione e incubare i campioni a temperatura ambiente al buio per tre giorni. Il giorno 11 dopo il lavaggio immunocolorante, aspirare il tampone di lavaggio e incubare i campioni con 0,8 millilitri della soluzione di scala cubica a 37 gradi Celsius per tre giorni al buio. Cambiare la scala cubica una soluzione ogni giorno.Il giorno 15, lavare i campioni tre volte per 10 minuti e 0,8 millilitri di PBS a temperatura ambiente con un leggero scuotimento. Quindi sostituire il PBS con 0,8 millilitri del 20% di saccarosio degassato appena preparato con PBS seguito da un leggero scuotimento a temperatura ambiente. Dopo un'ora sostituire la soluzione di saccarosio al 20% per trattare i campioni con 0,8 millilitri della soluzione di scala cubica due per quattro o cinque giorni, come spiegato in precedenza.Per preparare un set di campioni, utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri con il taglio della punta per trasferire le ovaie puberali con 15-20 microlitri di soluzione cubica a due in scala nel mezzo del pozzetto adesivo. Una volta che le ovaie vengono trasferite nel pozzetto individuale con una goccia di soluzione di compensazione, posizionare delicatamente un vetro di copertura sul pozzetto adesivo e premere per creare un sigillo che inserisce i campioni e la soluzione di pulizia tra due scivoli di copertura. Per il luogo di imaging, il sandwich di scorrimento del coperchio in un vetrino adattatore per microscopio stampato in 3D.Impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini in base ai nuclei di microscopia o alle specifiche del produttore. Se disponibile, utilizzare l'acquisizione bidirezionale delle immagini per ridurre i tempi di scansione e migliorare l'efficienza. Regola la media delle linee, la media dei fotogrammi e l'accumulo dei fotogrammi nel software.Impostare lo stack Z identificando la posizione iniziale e finale, quindi selezionare una dimensione del gradino Z di due micrometri per le ovaie prepuberali e cinque micrometri per le ovaie puberali. Quindi attivare la funzione di compensazione Z e il guadagno di eccitazione. Impostare la compensazione Z per la parte inferiore e superiore del campione selezionando un'intensità laser per entrambi.Utilizzare la modalità di piastrellatura per campioni più grandi che non possono essere acquisiti in un singolo campo visivo. Attivare il navigatore immagini e indicare il numero di tessere necessarie per acquisire l'intero campione con lo strumento di marcatura rettangolare. Una volta completata l'impostazione, iniziare con l'acquisizione delle immagini per le immagini con più riquadri, iniziare l'acquisizione delle immagini con il navigatore per acquisire tutte le tessere.Dopo l'acquisizione dell'immagine, salva tutte le immagini. E se sono state acquisite più tessere, esegui lo strumento mosaico unito per unire le tessere in un'unica immagine. Per determinare la dimensione degli ovociti, aprite l'immagine e selezionate l'opzione slice per aprire l'immagine della pila Zs.Selezionate l'opzione linea e il pannello di misurazione e misurate la distanza disegnando una linea da un bordo di un ovocita o di un marcatore all'altro bordo nel punto più largo per determinare il diametro X Y dell'ovocita. Spostarsi attraverso la pila e ottenere la gamma di diametri per più ovociti dello stesso tipo. Utilizzare la lunghezza più breve come criterio di selezione delle dimensioni per i conteggi degli ovociti.Quindi, nell'opzione vista 3D, selezionate la feature spot. Nel pannello della scena attivare la funzione aggiungi nuovi spot per aprire il pannello dell'algoritmo. Quindi deselezionare tutte le impostazioni dell'algoritmo come filtro di selezione delle dimensioni con la dimensione degli ovociti ottenuta in precedenza.Fare clic sulla freccia in avanti del canale per passare al canale sorgente. Quindi selezionare il canale con il marcatore preferito e digitare il diametro acquisito nel diametro stimato X, Y. Dopo la selezione delle dimensioni attivare l'allungamento del modello PSF e la sottrazione dello sfondo che vengono determinati automaticamente.Quindi, scegliete la singola freccia in avanti da spostare nel pannello dei punti filtro e aggiungete il filtro qualità per determinare una soglia. Per garantire la stima accurata del numero di ovociti ingrandire l'immagine. Successivamente, fai clic sulla doppia freccia per completare i conteggi automatici.Utilizzare la scheda Modifica per selezionare manualmente gli ovociti persi o deselezionare le particelle non ovocitarie selezionate dalla soglia automatica. Al termine, registrare i dati nella scheda statistiche sotto la scheda generale per ulteriori analisi. Per stimare il numero totale di ovociti e le ovaie danneggiate, aprire le immagini delle ovaie intatte con MRS e selezionare la caratteristica del fotogramma.Sotto le impostazioni del frame, selezionate i segni di spunta della griglia delle caselle e le etichette di accesso. Nella scheda posizione XYZ selezionare 200 microme per generare segni di spunta con spazi di 200 micrometri in tutte le posizioni XYZ. Utilizzando i segni di spunta di 200 micrometri, selezionare gli ovociti che rientrano nel 50% del volume di ciascuna ovaia.Fai clic sulla funzione macchie e seleziona le etichette di modifica per classificare gli ovociti che rientrano nella regione del 50% per colore. Nella scala di grigi rappresentativa, si potevano vedere immagini multi fotoni delle ovaie non perfuse e perfuse, i piccoli ovociti nei follicoli primordiali con il sottile strato di colorazione citoplasmatica DDX4. Inoltre, sono stati individuati gli ovociti più grandi all'interno dei follicoli in crescita.Sono stati studiati i rendering 3D delle immagini multi fotone delle ovaie prenatali e postnatali. Al giorno postnatale 28, l'ovaio della femmina non irradiata di controllo conteneva una grande popolazione di piccoli ovociti nei follicoli primordiali. Al contrario, le ovaie della femmina irradiata con 0,5 grigi della radiazione gamma erano completamente prive di piccoli ovociti nei follicoli primari.Ma gli ovociti più grandi erano ancora presenti. Per la quantificazione degli ovociti, le immagini 3D multi fotone sono state elaborate nel software MRS utilizzando il filtro gouciano e gli ovociti di piccole e grandi dimensioni sono stati identificati e quantificati utilizzando la funzione spot. Successivamente, la percentuale media degli ovociti è stata calcolata in ogni fase rispetto al numero medio presente al primo stadio E 15,5 numeri di ovociti diminuiti bruscamente tra E 15,5 ed E 18,5 gli ovociti fetali E 15,5 ed E 18,5 espressi linea uno of uno P come visto nelle immagini multi fotone.L'analisi di intensità ha mostrato espressioni più elevate di linea uno o di una P per ovociti a E 18,5 rispetto a E 15,5. Le ovaie con piccoli danni possono essere utilizzate per l'analisi. Il numero totale di ovociti è determinato utilizzando la correzione computazionale.Il modello rappresentativo mostra ovociti G CNA positivi nell'ovaio E 15,5 con cinque regioni del 10% evidenziate in un'ovaia intatta. Allo stesso modo, è stata generata un'ovaia simulata con il 10% di regioni incrementali mancanti fino al 50% dell'ovaio. Il numero totale di ovociti e le ovaie simulate sono stati confrontati con le ovaie intatte originali.E la differenza è stata presentata come la deviazione percentuale Buona perfusione si traduce in una buona qualità dell'immagine. Quindi assicurati che tutti i tessuti siano eliminati con PBS prima di passare al PFA. Assicurarsi che le ovaie siano completamente esposte tagliando via il tessuto in eccesso.Il protocollo consente un'analisi efficiente di un gran numero di campioni, i dati quantitativi ottenuti da popolazioni di riferimento genetiche come l'incrocio collaborativo o l'output della diversità aiuteranno a identificare i modificatori genetici dello sviluppo degli ovociti e il numero di ovociti.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui presentiamo un adattamento del passivo chiarezza e metodo di ricostruzione 3D per la visualizzazione del vasculature ovarico e capillari follicolari nelle ovaie intatte del mouse.

Ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare i follicoli nelle ovaie colte di giovani topi senza sezionamento seriale. Mediante immunofluorescenza di intero organo e tessuto di compensazione, sezionamento fisico viene sostituito con sezionamento ottico. Questo metodo di preparazione del campione e visualizzazione mantiene l'integrità dell'organo e facilita la quantificazione automatizzata di cellule specifiche.

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Colture del tessuto ovarici possono essere utilizzati come modelli di atresia di sviluppo, l'ovulazione e follicolo pilifero e indicare i meccanismi regolatori dei processi dinamici ovarici.

Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse

Qui descriviamo, confrontiamo e confrontiamo due diverse tecniche per un accurato conteggio follicolo dei tessuti ovarico del topo fissi.

Enumerazione accurata del follicolo nelle ovaie di topo adulto

Questo protocollo descrive la coltura primaria / co-coltura di topo tessuto ovarico, con ovaie di topi neonati e singoli follicoli ovarici di topi prepuberi. Le tecniche di coltura supportano sviluppo in modo altamente fisiologico, consentendo studio dell'effetto di agenti estrinseci sulla ovaio, e di interazioni tra follicoli ovarici.

Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

Le mutazioni che portano a difetti cardiaci congeniti beneficiano dell'indagine in vivo della struttura cardiaca durante lo sviluppo, ma gli studi strutturali ad alta risoluzione nel cuore embrionale di topo sono tecnicamente impegnativi. Qui presentiamo un robusto metodo di immunofluorescenza e analisi delle immagini per valutare le strutture specifiche dei cardiomiociti nel cuore del topo in via di sviluppo.

Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

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Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere risultati di localizzazione sottocellulare della proteina sulla retina di zebrafish correlando microscopia di Super-risoluzione e immagini di microscopia elettronica di scansione.

Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

In questo protocollo, abbiamo descritte le tecniche per la corretta dissezione di Arabidopsis fiori e silique, alcune tecniche di base di schiarimento e selezionato le procedure per intero-monta le osservazioni delle strutture riproduttive di colorazione.

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Scopri l'immunofluorescenza di ovaio intero con clearing e microscopia multifotonica per analisi 3D quantitativa della riserva ovarica in sviluppo nel topo. Questo metodo supporta studi di tossicologia e diagnostica clinica.

Immunofluorescenza dellovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per lanalisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo (Video) | JoVE Journal

Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

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