Name: Studio di modelli sperimentali di donazione di organi per il trapianto di polmone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri i modelli sperimentali di donazione polmonare post morte cerebrale, circolatoria e da shock emorragico nel ratto. Questo metodo consente di analizzare i processi infiammatori e ottimizzare le strategie di preservazione degli organi per il trapianto.

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Ringraziamo la FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) per il sostegno finanziario.

Gli esperimenti sugli animali sono stati conformi al Comitato Etico per l'Uso e la Cura degli Animali da Esperimento della Facoltà di Medicina dell'Università di San Paolo (numero di protocollo 112/16).
1. Raggruppamento degli animali
<ol><li>Assegnare in modo casuale dodici ratti maschi di Sprague Dawley (250-300 g) a uno dei tre gruppi sperimentali (n=4) per analizzare e confrontare gli effetti associati ai modelli animali.</li>
	<li>Assegnare gli animali al gruppo di shock emorragico (HS, n=4): animali sottoposti a cateterismo vascolare con induzione di shock emorragico + mantenimento per 360 min + estrazione del blocco cardiopolmonare + preparazione del campione per l'analisi.</li>
	<li>Assegnare gli animali al gruppo di morte cerebrale (BD, n=4): animali sottoposti a morte cerebrale + mantenimento per 360 min + estrazione del blocco cardiopolmonare + preparazione del campione per l'analisi.</li>
	<li>Assegnare gli animali al gruppo di morte circolatoria (CD, n=4): animali sottoposti a cateterismo vascolare + induzione della morte circolatoria + sospensione della ventilazione + ischemia a temperatura ambiente per 180 min + preparazione del campione per l'analisi.</li>
</ol>2. Anestesia e preparazione prechirurgica
<ol><li>Mettere il ratto in una camera chiusa con isoflurano al 5% per 1-4 minuti. Confermare la corretta anestesia controllando il riflesso di pizzicamento della punta. In assenza di reazioni riflesse (nessuna retrazione della zampa), eseguire l'intubazione orotracheale (angiocath 14-G) con l'ausilio di un laringoscopio pediatrico.</li>
	<li>Con un ventilatore meccanico precedentemente regolato (FiO2 100%, volume corrente 10 mL/kg, 90 cicli/min e PEEP 3,0 cmH2O), collegare il catetere tracheale al ventilatore e regolare la concentrazione di anestetico al 2%. NOTA: Tutte le procedure relative ai modelli animali hanno seguito lo stesso protocollo anestetico descritto in questa sezione.</li>
	<li>Rimuovere il pelo dalle regioni di interesse (testa, collo, petto e addome). Quindi, utilizzando una garza, disinfettare il campo operatorio e la coda dell'animale. La disinfezione viene eseguita con tre cicli alternati di una soluzione alcolica di scrub clorexidina digluconato.</li>
	<li>Taglia la punta della coda dell'animale, posiziona il pollice e l'indice sulla base della coda, quindi premili e allontanali dalla base. Raccogliere un campione di sangue periferico (20 μL) attraverso la coda per la conta leucocitaria totale8. NOTA: Questa procedura deve essere eseguita prima dell'inizio della tracheostomia e immediatamente alla fine di ogni protocollo (BD e HS - dopo 360 min).</li>
	<li>Utilizzare una pipetta di precisione per diluire il sangue raccolto in 380 μL (1:20) di soluzione di Turk (acido acetico glaciale 99%). Una volta diluito, pipettare il campione di sangue in una camera Neubauer e posizionarlo al microscopio (40x). Eseguire la conta leucocitaria totale nei quattro quadranti laterali della camera.</li>
</ol>3. Tracheostomia
<ol><li>Con l'aiuto di apposite forbici e pinze, eseguire la dissezione longitudinale della trachea cervicale, partendo dal terzo medio del collo fino all'intaglio soprasternale (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62975/62975eq01.jpg" style="margin: auto;">incisione di 1,5 cm). Dopo l'incisione della pelle e del tessuto sottocutaneo, sezionare i muscoli cervicali fino a quando la trachea non è esposta.</li>
	<li>Posizionare una legatura di seta 2-0 sotto la trachea.</li>
	<li>Usando le microforbici, tracheostomizzare il terzo superiore della trachea per ottenere una ventilazione uniforme. Tagliare orizzontalmente la trachea tra due anelli cartilaginei per accogliere il diametro di una cannula metallica (3,5 cm).</li>
	<li>Inserire il tubo di ventilazione e fissarlo con legature predisposte.</li>
	<li>Collegare il tubo di ventilazione al sistema di ventilazione per animali di piccola taglia.</li>
	<li>Ventilare il ratto con un volume corrente di 10 ml/kg, una velocità di 70 cicli/min e una PEEP di 3 cmH2O.</li>
</ol>4. Cateterismo dell'arteria e delle vene femorali
<ol><li>Esporre il triangolo femorale attraverso una piccola incisione (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62975/62975eq01.jpg" style="margin: auto;">1,5 cm) nella regione inguinale. Identificare e isolare i vasi femorali. Per questa procedura, utilizzare uno stereomicroscopio (ingrandimento 3,2x).</li>
	<li>Posizionare due legature di seta 4-0 sotto i vasi sanguigni (vena o arteria), una distale e l'altra prossimale. Chiudere la legatura più distale, quindi fare un nodo preregolato nella legatura prossimale e tirare.</li>
	<li>Inserire il catetere attraverso una piccola incisione preformata nei vasi. Fissare la cannula per evitare lussazioni. NOTA: Realizzare i cateteri da un estensore neonatale di 20 cm saldato mediante riscaldamento a un catetere endovenoso periferico adatto al calibro della rete venosa dell'animale, prevenendo così il rigurgito del contenuto ematico. Lubrificare la cannula con eparina, evitando la formazione di trombi e complicazioni durante la misurazione della pressione arteriosa media (MAP).</li>
	<li>Collegare il catetere arterioso a un trasduttore di pressione e a un sistema di monitoraggio dei segni vitali per registrare la pressione arteriosa media (MAP). Il trasduttore deve essere posizionato a livello del cuore dell'animale. Registrare la MAP ogni 10 minuti.</li>
	<li>Posizionare il catetere siringa (3 ml) nella vena, mirando all'idratazione e al dissanguamento quando necessario.</li>
</ol>5. Induzione da shock emorragico
<ol><li>Attraverso l'accesso venoso e con una siringa eparinizzata, prelevare piccoli volumi di sangue fino a raggiungere valori di MAP di <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62975/62975eq01.jpg" style="margin: auto;">50 mmHg, instaurando così uno shock emorragico. NOTA: Raccogliere un'aliquota di 2 ml di sangue ogni 10 minuti nella prima ora dell'esperimento e ogni 30 minuti nelle ore successive.</li>
	<li>Mantenere la pressione stabile a circa 50 mmHg per un periodo di 360 minuti. A tal fine, rimuovere o aggiungere aliquote di sangue se la pressione aumenta o diminuisce, rispettivamente.</li>
	<li>Metti una fonte di calore nelle vicinanze per evitare l'ipotermia. NOTA: In questo caso viene utilizzata una lampada riscaldante.</li>
	<li>Al termine del protocollo, prelevare il blocco polmonare alla capacità polmonare totale (TLC) e congelarlo in azoto liquido o metterlo in una soluzione di fissaggio per ulteriori studi. NOTA: Con l'aiuto di un ventilatore per animali di piccola taglia, è possibile accedere ai parametri ventilatori durante il protocollo. Nel presente studio, questi parametri sono stati valutati immediatamente prima dell'induzione dell'HS (basale) e 360 minuti dopo (finale).</li>
</ol>6. Induzione della morte circolatoria
<ol><li>Per indurre la morte circolatoria, somministrare 150 mg/kg di tiopentale di sodio attraverso la linea venosa. Quindi spegnere il sistema di ventilazione.</li>
	<li>Si noti la progressiva diminuzione della MAP fino a raggiungere 0 mmHg. Da questo punto, considera l'inizio del periodo di ischemia calda e inizia il conteggio del tempo. L'animale deve rimanere a temperatura ambiente (circa 22 °C) per 180 min.</li>
	<li>Al termine del protocollo, ricollegare i polmoni al ventilatore meccanico e prelevare il blocco polmonare presso TLC per la raccolta. Congelare con azoto liquido o metterlo nella soluzione di fissazione per ulteriori studi.</li>
</ol>7. Induzione della morte cerebrale
<ol><li>Metti il ratto in posizione prona.</li>
	<li>Rimuovere la pelle dal cranio usando le forbici chirurgiche. Praticare un foro calibro 1 mm, 2,80 mm anteriormente e 10,0 mm ventrale alla bregma e 1,5 mm lateralmente alla sutura sagittale.</li>
	<li>Inserire l'intero catetere a palloncino nella cavità cranica e assicurarsi che il palloncino sia preriempito con soluzione fisiologica (500 μL).</li>
	<li>Con l'aiuto di una siringa, gonfiare rapidamente il catetere.</li>
	<li>Confermare la morte cerebrale osservando un brusco aumento della MAP (riflesso di Cushing), l'assenza di riflessi, la midriasi bilaterale e l'apnea. Dopo la conferma, interrompere l'anestesia e tenere l'animale in ventilazione meccanica per 360 minuti.</li>
	<li>Posizionare una fonte di calore nelle vicinanze per evitare l'ipotermia.</li>
	<li>Al termine del protocollo, prelevare il blocco polmonare presso TLC per la raccolta e congelarlo in azoto liquido o metterlo in una soluzione di fissaggio per ulteriori studi. NOTA: Con l'aiuto di un ventilatore per animali di piccola taglia, è possibile accedere ai parametri ventilatori durante il protocollo. Nel presente studio, abbiamo valutato questi parametri immediatamente prima dell'induzione BD (Basale) e dopo 360 minuti (Finale).</li>
</ol>

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Desideriamo confermare che non ci sono conflitti di interesse noti associati a questa pubblicazione e che non c'è stato alcun sostegno finanziario significativo per questo lavoro che avrebbe potuto influenzarne l'esito.

Negli ultimi anni, il crescente numero di diagnosi di morte cerebrale l'ha portata a diventare il più grande fornitore di organi e tessuti destinati al trapianto. Questa crescita, però, è stata accompagnata da un incredibile aumento delle donazioni dopo la morte circolatoria. Nonostante la sua natura multifattoriale, la maggior parte dei meccanismi scatenanti delle cause di morte iniziano dopo o accompagnano il trauma con un'estesa perdita di contenuto ematico 4,18.
In questo contesto, i modelli sperimentali di morte cerebrale, arresto circolatorio e shock emorragico sono strumenti importanti per lo studio prospettico delle complicanze associate alla causa di morte del donatore e del loro impatto sulla vitalità di potenziali organi destinati al trapianto 6,8,10. Diversi lignaggi animali sono stati suggeriti per l'insediamento modello, come suini, conigli, ratti e topi. I modelli di ratto e topo sono più comuni in letteratura perché non sono molto costosi e comportano una bassa difficoltà logistica mentre riproducono in modo soddisfacente gli eventi fisiopatologici oggetto dello studio 8,13,14,15.
Ci teniamo a sottolineare che recenti linee guida e studi hanno avallato l'utilizzo dell'analgesia pre-anestetica come parte integrante dei protocolli chirurgici, anche in situazioni acute, puntando ad una gestione più completa del dolore perioperatorio e del benessere animale. Raccomandiamo che i ricercatori valutino tale approccio in studi futuri.
Morte cerebrale (BD) Il modello BD è risultato riproducibile per mezzo di un brusco aumento dell'ICP. L'utilizzo di strumenti adeguati e di personale addestrato consente il successo chirurgico e la riproduzione della tecnica con poche settimane di allenamento. Durante lo sviluppo della tecnica BD, la trapanazione deve essere eseguita con un trapano motorizzato appropriato in modo che non vi sia allentamento nel catetere, impedendo così la proiezione del tessuto cerebrale fuori dal foro. Inoltre, durante la perforazione, il movimento in avanti del trapano deve essere interrotto non appena viene superata la resistenza iniziale offerta dal cranio.
I ricercatori dovrebbero rimanere vigili e garantire un rapido gonfiaggio del catetere, poiché il gonfiaggio graduale promuove risposte infiammatorie ed emodinamiche distinte21. Le variazioni della pressione arteriosa, a loro volta, devono essere monitorate costantemente durante tutto il protocollo, in particolare durante l'insufflazione del catetere, che deve essere accompagnata da un brusco aumento della PMA e durante la prima ora dopo l'instaurazione della BD (periodo di ipotensione post-inflazione). Questi risultati sono in accordo con la letteratura, che mostra l'instaurarsi di un picco ipertensivo subito dopo l'insufflazione del catetere, seguito da una diminuzione dei livelli di pressione, in una probabile risposta all'aumento transitorio dei livelli circolanti di catecolamine22.
Mantenere l'animale in BD per periodi prolungati può portare all'ipotensione seguita dalla morte circolatoria, rendendo l'esperimento impraticabile. Di conseguenza, la maggior parte dei protocolli utilizzati in letteratura stabilisce un periodo di follow-up che varia dalle 4 alle 6 ore, dopodiché devono essere somministrati farmaci vasoattivi 12,13,21,22,23.
Oltre alle alterazioni emodinamiche, l'infarto cerebrale e l'ischemia favoriscono un aumento della circolazione sistemica dei fattori proinfiammatori, che, quando raggiungono i polmoni, contribuiscono al danno del parenchima polmonare 24,25,26.
Nel nostro studio, la BD è stata accompagnata da un aumento significativo dell'espressione tissutale di IL-1β (rispetto alla CD) e del rapporto peso umido/secco, un indice di edema polmonare. Studi precedenti hanno indicato un aumento dei livelli circolanti di citochine proinfiammatorie dopo un evento BD, che può in ultima analisi favorire la modulazione dell'espressione delle molecole di adesione, l'aumento della permeabilità vascolare e la conseguente migrazione leucocitaria 27,28,29,30.
Shock emorragico (HS) Stabilito attraverso il prelievo o la reinfusione di aliquote di sangue con l'obiettivo di un mantenimento prolungato dell'ipotensione (≤ 50 mmHg), il modello a pressione fissa di HS mira a mimare la diminuzione del volume di sangue causata dal processo emorragico e, di conseguenza, l'attenuazione della pressione di riempimento sistemica. Questi eventi portano ad una diminuzione della MAP, accompagnata da una diminuzione della pressione di perfusione polmonare31,32.
Tra i vantaggi di questo modello HS c'è la possibilità di controllare il grado e la durata dell'ipotensione, oltre alla maggiore riproducibilità della tecnica rispetto ai modelli basati su un volume di sangue prefissato. Di conseguenza, la maggior parte dei protocolli utilizzati in letteratura stabilisce un periodo di protocollo che varia da 15 minuti a più di 180 minuti, con livelli medi di pressione sanguigna che vanno da 20-55 mmHg, a seconda dell'analisi scelta nello studio 6,32. Nel presente studio, l'ipotensione è stata mantenuta per 3 ore, portando a un aumento della resistenza tissutale, seguita da una diminuzione della compliance polmonare negli animali sottoposti a HS. A conferma di ciò, diversi studi in letteratura hanno indicato una relazione proporzionale tra il tempo trascorso in HS e gli impatti dell'ipovolemia sulla resistenza delle vie aeree e sulla compliance polmonare 6,33,34.
Inoltre, nel presente studio, l'HS è stata accompagnata da una significativa leucocitosi e da un aumento dell'espressione tissutale di IL-1β (rispetto alla CD) e al TNF-α. La lesione dell'endotelio microvascolare polmonare, indotta dal rilascio di specie reattive dell'ossigeno dal processo primario di ipossia e ischemia stabilita, aumenterà la permeabilità vascolare, che, insieme all'aumento della pressione dell'arteria polmonare, agirà come fattore chemiotattico per i leucociti e il conseguente rilascio di mediatori infiammatori 6,20,31,35,36, 37,38.
Morte circolatoria (MC) La principale differenza tra gli innesti marginali originati dai processi BD e CD è il tempo di ischemia calda (WIT) a cui l'innesto sarà sottoposto, definito da alcuni ricercatori come il tempo che intercorre tra l'assenza di impulsi periferici e l'interruzione del flusso sanguigno dovuta alla rimozione delle apparecchiature di supporto vitale fino alla perfusione fredda o regionale dell'organo17, 39,40.
Nel presente studio, gli organi e i tessuti di animali derivati dal modello CD sono stati sottoposti a un periodo WIT di 180 minuti. Diversi studi in letteratura hanno rivelato una relazione proporzionale tra il WIT e la disfunzione post-trapianto, suggerendo che il tempo di ischemia dovrebbe variare in base alle particolarità e all'integrità di ciascun organo. In questo contesto, è stato dimostrato che gli innesti polmonari di ratti tollerano fino a periodi di 3 ore di ischemia calda41,42.
Con l'evidenza di lesioni tissutali causate dalla fase simpatica predominante, dall'instabilità emodinamica e dall'infiammazione sistemica derivante dal processo BD, le donazioni dopo l'arresto circolatorio sono state riconsiderate come una potenziale strategia per ridurre le complicanze associate al trapianto 41,42,43. In questo senso, i nostri dati indicano una drastica diminuzione dei livelli di IL-1β e TNF-α nel modello CD rispetto agli altri due modelli studiati. A conferma di ciò, Iskender et al.4 hanno notato i bassi livelli di citochine tissutali in un modello di riperfusione polmonare nei ratti con tessuti donati dopo il WIT attraverso meccanismi che sono ancora poco compresi.
Sulla base di quanto sopra, la scelta della metodologia e dei suoi adattamenti dovrebbe dipendere dagli obiettivi sviluppati dal ricercatore. Una volta determinati, questi obiettivi dovrebbero guidare il tipo di modello di donazione, il tempo del protocollo e le analisi da eseguire. E' inoltre possibile mettere in relazione il tipo di donazione con modelli animali di ricondizionamento e riperfusione polmonare.
Conclusioni In conclusione, i modelli di donatori di organi qui descritti sono potenziali strumenti nello studio dei cambiamenti associati a diverse metodologie di prelievo di innesto e potrebbero fornire mezzi attraverso i quali è possibile ottenere una piena comprensione dell'impatto della qualità di questi organi sugli esiti post-trapianto, data la riproducibilità e l'affidabilità delle metodologie qui presentate.

Rilevanza clinica Il trapianto d'organo è un'opzione terapeutica consolidata per diverse patologie gravi. Negli ultimi anni, sono stati raggiunti molti progressi nei campi clinici e sperimentali del trapianto d'organo, come una maggiore conoscenza della fisiopatologia della disfunzione primaria del trapianto (PGD) e progressi nelle aree della terapia intensiva, dell'immunologia e della farmacologia 1,2,3. Nonostante i risultati e i miglioramenti nella qualità delle relative procedure chirurgiche e farmacologiche, il rapporto tra il numero di organi disponibili e il numero di riceventi in lista d'attesa rimane una delle principali sfide 2,4. A questo proposito, la letteratura scientifica ha proposto modelli animali per lo studio di terapie che possono essere applicate ai donatori di organi per trattare e/o conservare gli organi fino al momento del trapianto 5,6,7,8.
Imitando i diversi eventi osservati nella pratica clinica, i modelli animali consentono di studiare i meccanismi patologici associati e i rispettivi approcci terapeutici. L'induzione sperimentale di questi eventi, nella maggior parte dei casi isolati, ha generato modelli sperimentali di donazione di organi e tessuti che sono ampiamente indagati nella letteratura scientifica sui trapianti d'organo 6,7,8,9. Questi studi impiegano diverse strategie metodologiche, come quelle che inducono la morte cerebrale (BD), lo shock emorragico (HS) e la morte circolatoria (CD), poiché questi eventi sono associati a diversi processi deleteri che compromettono la funzionalità degli organi e dei tessuti donati.
Morte cerebrale (BD) La BD è associata ad una serie di eventi che portano al progressivo deterioramento di diversi sistemi. Di solito si verifica quando si verifica un aumento acuto o graduale della pressione intracranica (ICP) a causa di un trauma cerebrale o di un'emorragia. Questo aumento dell'ICP promuove un aumento della pressione sanguigna nel tentativo di mantenere un flusso sanguigno cerebrale stabile in un processo noto come riflesso di Cushing10,11. Questi cambiamenti acuti possono provocare disfunzioni cardiovascolari, endocrine e neurologiche che compromettono la quantità e la qualità degli organi donati, oltre ad avere un impatto sulla morbilità e sulla mortalità post-trapianto 10,11,12,13.
Shock emorragico (HS) L'HS, a sua volta, è spesso associata ai donatori di organi, poiché la maggior parte di loro è vittima di traumi con una significativa perdita di volume del sangue. Alcuni organi, come i polmoni e il cuore, sono particolarmente vulnerabili all'HS a causa dell'ipovolemia e della conseguente ipoperfusione tissutale14. L'HS induce lesioni polmonari attraverso l'aumento della permeabilità capillare, l'edema e l'infiltrazione di cellule infiammatorie, meccanismi che insieme compromettono lo scambio gassoso e portano al progressivo deterioramento dell'organo, facendo deragliare di conseguenza il processo di donazione 6,14.
Morte circolatoria (MC) L'uso della donazione post-CD è cresciuto in modo esponenziale nei principali centri mondiali, contribuendo così all'aumento del numero di organi prelevati. Gli organi recuperati da donatori post-MC sono vulnerabili agli effetti dell'ischemia calda, che si verifica dopo un intervallo di scarso (fase agonica) o di assenza di afflusso di sangue (fase asistolica)8,15. L'ipoperfusione o l'assenza di flusso sanguigno porterà all'ipossia tissutale associata alla brusca perdita di ATP e all'accumulo di tossine metaboliche nei tessuti15. Nonostante il suo attuale utilizzo per il trapianto nella pratica clinica, permangono molti dubbi sull'impatto dell'uso di questi organi sulla qualità dell'innesto post-trapianto e sulla sopravvivenza del paziente15. Pertanto, anche l'uso di modelli sperimentali per una migliore comprensione dei fattori eziologici associati alla MC è in crescita 8,15,16,17.
Modelli sperimentali Esistono vari modelli sperimentali di donazione di organi (BD, HS e CD). Tuttavia, gli studi spesso si concentrano su una sola strategia alla volta. C'è una notevole lacuna negli studi che combinano o confrontano due o più strategie. Questi modelli sono molto utili nello sviluppo di terapie che cercano di aumentare il numero di donazioni e di conseguenza diminuire la lista d'attesa dei potenziali riceventi. Le specie animali utilizzate a questo scopo variano da studio a studio, con modelli suini che sono più comunemente selezionati quando l'obiettivo è una traduzione più diretta con la fisiologia morfofologica umana e meno difficoltà tecniche nella procedura chirurgica a causa delle dimensioni dell'animale. Nonostante i benefici, le difficoltà logistiche e i costi elevati sono associati al modello suino. D'altra parte, il basso costo e la possibilità di manipolazione biologica favoriscono l'utilizzo di modelli di roditori, consentendo al ricercatore di partire da un modello affidabile per riprodurre e trattare le lesioni, nonché di integrare le conoscenze acquisite nel campo del trapianto d'organo.
Qui, presentiamo un modello di roditore di morte cerebrale, morte circolatoria e donazione di shock emorragico. Descriviamo i processi infiammatori e le condizioni patologiche associate a ciascuno di questi modelli.

<table><tbody><tr><td>Angiocath DB calibro 14</td><td>38186714</td><td></td><td>Intubazione orotracheale</td></tr><tr><td>Brasutura</td><td>in seta 2.0</td><td>AA553</td><td>Fissazione del tubo tracheale</td></tr><tr><td>Angiocath calibro 24</td><td>DB</td><td>38181214</td><td>Accesso arterioso e venoso</td></tr><tr><td>Brasutura</td> in<td>seta 4.0</td><td>AA551</td><td>Fissazione di cannule arteriose e venose</td></tr><tr><td>Soluzione alcolica di clorexidina digluconato (2%).</td><td>Vic Pharma</td><td>Y/N Apparecchio</td> per <td></td></tr><tr><td>tricotomia</td> per asepsi <td>Oster</td><td>Y/N</td><td>Clipping device</td></tr><tr><td>Precision balance</td><td>Shimadzu</td><td>D314800051</td><td>Analisi del rapporto peso/umido</td></tr><tr><td>Barbiturico (tiopentale)</td><td>Crist&aacute; lia</td><td>18080003</td><td>Catetere a palloncino a induzione DC</td></tr><tr><td>(Fogarty-4F)</td><td>Edwards Life Since</td><td>120804</td><td></td></tr><tr><td>Estensore neonatale</td> a induzione BD <td>Embramed</td><td>497267</td><td>Utilizzato come catetere con l'ausilio del 1142254 Angiocath</td></tr><tr><td>FlexiVent</td><td>Scireq</td><td></td> da 24 G <td>Analisi dei parametri ventilatori</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Blau Farmaceutica SA</td><td><forte>7000982-06</forte></td><td><forte>Anticoagulante</forte></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Crist&aacute; lia</td><td>10,29,80,130</td><td>Anestesia per inalazione</td></tr><tr><td>Micropipetta (1000 &micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>347765Z</td><td>Manipolazione di liquidi di piccolo volume</td></tr><tr><td>Micropipette (20 &; L)</td><td>Eppendorf</td><td>H19385F</td><td>Manipolazione di liquidi di piccolo volume</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>1601004545</td><td>Assistenza nella visualizzazione di strutture per la procedura chirurgica</td></tr><tr><td>Monitor multiparametrico</td><td>Dixtal</td><td>101503775</td><td>Registrazione MAP</td></tr><tr><td>Trapano motorizzato</td><td>Midetronic</td><td>MCA0439</td><td>Utilizzato per perforare un foro di calibro 1 mm</td></tr><tr><td>Camera Neubauer</td><td>Kasvi</td><td>D15-BL</td><td>Conta cellulare</td></tr><tr><td>Laringoscopio pediatrico</td><td>Oxygel</td><td>S/N</td><td>Assistenza durante l'intubazione tracheale</td></tr><tr><td>Siringa (3 mL)</td><td>SR</td><td>3330N4</td><td>Idratazione e dissanguamento durante il protocollo HS</td></tr><tr><td>Trasduttore di pressione</td><td>Edwards Life A partire dalla</td><td>registrazione MAP</td> <td>P23XL</td></tr><tr><td>Tubo tracheale metallico</td><td>Biomedical</td><td>006316/12</td><td>Cannula rigida per analisi con il ventilatore FlexiVent</td></tr><tr><td>Vaporizzatore di isoflurano</td><td>Harvard Bioscience</td><td>1,02,698</td><td>Sistema di anestesia</td></tr><tr><td>Ventilatore meccanico per piccoli animali (683)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>MA1 55-0000</td><td>Ventilazione meccanica</td></tr><tr><td>xMap metodologia</td><td>Millipore</td><td>RECYTMAG-65K-04</td><td>Analisi dei marcatori infiammatori</td></tr></tbody></table>

studio di modelli sperimentali di donazione di organi per il trapianto di polmone

Study of Experimental Organ Donation Models for Lung Transplantation

I modelli sperimentali sono strumenti importanti per comprendere i fenomeni eziologici coinvolti in vari eventi fisiopatologici. In questo contesto, diversi modelli animali sono utilizzati per studiare gli elementi che innescano la fisiopatologia della disfunzione primaria del trapianto dopo il trapianto per valutare potenziali trattamenti. Attualmente, possiamo dividere i modelli di donazione sperimentale in due grandi gruppi: donazione dopo morte cerebrale e donazione dopo arresto circolatorio. Inoltre, gli effetti deleteri associati allo shock emorragico dovrebbero essere considerati quando si considerano modelli animali di donazione di organi. Qui, descriviamo la creazione di tre diversi modelli di donazione polmonare (donazione post-morte cerebrale, donazione post-morte circolatoria e donazione post-shock emorragico) e confrontiamo i processi infiammatori e i disturbi patologici associati a questi eventi. L'obiettivo è quello di fornire alla comunità scientifica modelli animali affidabili di donazione polmonare per lo studio dei meccanismi patologici associati e la ricerca di nuovi bersagli terapeutici per ottimizzare il numero di innesti vitali per il trapianto.

Pressione arteriosa media (MAP) Per determinare le ripercussioni emodinamiche di BD e HS, la MAP è stata valutata per 360 minuti del protocollo. La misurazione basale è stata raccolta dopo la rimozione della pelle e la perforazione del cranio e prima della raccolta di aliquote di sangue per gli animali sottoposti a BD o HS, rispettivamente. Prima dell'induzione di BD e HS, la MAP basale dei due gruppi era simile (BD: 110,5 ± 6,1 vs. HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; ANOVA a due vie). Dopo l'insufflazione del catetere, il gruppo BD ha sperimentato un brusco aumento dei livelli di pressione sanguigna (138,7 ± 10,1 mmHg). Il picco ipertensivo è un evento peculiare correlato all'aumento della pressione intracranica e può essere considerato la prima evidenza dell'instaurarsi della BD. Inoltre, abbiamo osservato l'assenza di riflessi, midriasi bilaterale e apnea post-inflazione in tutti gli animali. Questa pressione di picco è stata seguita da una rapida diminuzione della MAP (10 min - 81,2 ± 10 mmHg). L'ipotensione è persistita per circa 50 minuti, dopodiché i livelli di MAP sono tornati a valori vicini a quelli al basale (120 minuti - 120,7 ± 7,5 mmHg) (Figura 1).
A differenza del gruppo BD, la diminuzione della MAP nel gruppo HS è associata al ritiro delle aliquote di sangue nei primi 10 minuti dell'esperimento. Lo shock ipovolemico è stato mantenuto per 360 minuti (variazione media durante il protocollo 52,3 ± 1,2 mmHg). Dopo la fine del protocollo, il gruppo BD ha mostrato un pattern MAP significativamente diverso nel follow-up di 6 ore rispetto al gruppo HS (BD: 93,7 ± 4,5 vs. HS: 52,3 ± 0,5 mmHg; p&lt;0,0001; Test t di Student).
Meccanica polmonare Per valutare i parametri elastici e resistivi dell'apparato respiratorio è stata eseguita un'analisi della meccanica polmonare degli animali sottoposti a BD e HS. 360 minuti dopo l'insorgenza e dopo il mantenimento dell'ipotensione, il gruppo HS ha mostrato un aumento della resistenza del tessuto polmonare (G) (HS: basale - 0,26 ± 0,02 vs. finale - 0,51 ± 0,05 cmH2O.mL-1; p=0,03; Bidirezionale ANOVA), seguita da una ridotta compliance del sistema respiratorio (Crs) (HS: basale - 0,64 ± 0,05 vs. finale - 0,23 ± 0,004 cmH2O/mL; p=0,001; Bidirezionale ANOVA) (Figura 2A,B).
Edema polmonare Alla fine del protocollo, il lobo medio del polmone destro è stato raccolto per tutti i gruppi e il suo peso è stato misurato per analizzare il rapporto peso umido/secco, che è stato utilizzato come indice di edema polmonare. Il peso umido è stato valutato immediatamente dopo l'estrazione dell'organo, mentre il peso secco è stato misurato dopo 24 ore in un forno a 80 °C. Secondo questo rapporto, il gruppo BD (2,32 ± 0,1) ha mostrato un edema maggiore rispetto ai gruppi HS (1,97 ± 0,03) e CD (2,04 ± 0,02) (Figura 3).
Parametri infiammatori sistemici e tissutali Alla fine del protocollo, c'è stato un aumento significativo del numero totale di leucociti sistemici nel gruppo sottoposto a HS (basale - 13888 ± 887,3 vs. finale - 35263 ± 4076 mm3; p = 0,0189); Bidirezionale ANOVA) (Figura 4). Il gruppo HS ha anche mostrato un aumento del numero di leucociti sia rispetto ai valori basali che in relazione al gruppo BD (p = 0,0132).
L'infiammazione tissutale è stata valutata quantificando i marcatori infiammatori nel tessuto polmonare. A tale scopo, i campioni di biopsia del tessuto polmonare sono stati omogeneizzati in tampone fosfato e quindi inviati per l'analisi dell'espressione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e dell'interleuchina 1 beta (IL1-β). I livelli di espressione di IL1-β erano maggiori nel gruppo BD (304,4 ± 91 pg/mg) e nel gruppo HS (327,5 ± 25,2 pg/mg) rispetto al gruppo CD (8 ± 2,3 pg/mg; p=0,004; Unidirezionale ANOVA) (Figura 5B). Il gruppo HS ha anche mostrato livelli più elevati di TNF-α (4,7 ± 0,3 pg/mg; p&lt;0,0001; Unidirezionale ANOVA) rispetto al gruppo BD (1,3 ± 0,3 pg/mg) e al gruppo CD (0,4 ± 0,2 pg/mg) (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig01.jpg"> Figura 1: Andamento temporale della pressione arteriosa media (MAP) nei gruppi di morte cerebrale (BD) e shock emorragico (HS). I valori di tutte le misurazioni sono espressi come medie ± errori standard delle medie (SEM). MAP, pressione arteriosa media; BD, morte cerebrale; HS, shock emorragico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig02.jpg"> Figura 2: Meccanica polmonare. Meccanica polmonare determinata da (A) compliance del sistema respiratorio e (B) resistenza tissutale nel gruppo della morte cerebrale (BD) e nel gruppo dello shock emorragico (HS). * indica differenze significative tra il valore basale e quello finale nel gruppo HS (p&lt;0,05). I valori di tutte le misurazioni sono espressi come medie ± errori standard delle medie (SEM) e per i confronti è stata utilizzata l'ANOVA a due vie . Crs, compliance dell'apparato respiratorio; G, resistenza tissutale; BD, morte cerebrale; HS, shock emorragico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig03.jpg"> Figura 3: Edema polmonare determinato dal rapporto di peso polmonare umido/secco nel gruppo di morte cerebrale (BD) e nel gruppo di shock emorragico (HS). I valori di tutte le misurazioni sono espressi come medie ± errori standard delle medie (SEM) e sono stati effettuati confronti con ANOVA unidirezionale . BD, morte cerebrale; HS, shock emorragico; MC, morte circolatoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig04.jpg"> Figura 4: Leucogramma del gruppo shock emorragico (HS) e del gruppo morte cerebrale (BD). * indica differenze significative tra i valori basali e finali nel gruppo HS (p&lt;0,05). I valori di tutte le misurazioni sono espressi come medie ± errori standard della media (SEM) e sono stati effettuati confronti con ANOVA a due vie . BD, morte cerebrale; HS, shock emorragico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig05.jpg"> Figura 5: Le risposte infiammatorie locali erano meno prominenti nel gruppo di morte circolatoria (CD). (A) Espressione di IL-1β nel tessuto polmonare; (B) Espressione tissutale polmonare di TNF-α. I valori di tutte le misurazioni sono espressi come medie ± errori standard della media (SEM) e sono stati effettuati confronti con ANOVA unidirezionale . BD, morte cerebrale; HS, shock emorragico; MC, morte circolatoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Il presente studio mostra la creazione di tre diversi modelli di donazione polmonare (donazione post-morte cerebrale, donazione post-morte circolatoria e donazione post-shock emorragico). Confronta i processi infiammatori e i disturbi patologici associati a questi eventi.

Studio di modelli sperimentali di donazione di organi per il trapianto di polmone

Experimental models are important tools for understanding the etiological phenomena involved in various pathophysiological events. In this context, ...

I modelli sperimentali di donazione di organi generalmente simulano situazioni isolate di lesione tissutale correlata al processo di morte e/o eventi legati alla conservazione e all'impianto dell'organo. Questi modelli sono molto utili nello sviluppo di terapie che cercano di aumentare il numero di donazioni, e di conseguenza diminuire la lista di ponderazione dei potenziali riceventi. Di conseguenza, è diventato importante sviluppare diversi modelli, come quelli che inducono la morte cerebrale e la morte circolatoria.Poiché questi eventi sono associati a diversi processi deleteri che compromettono la funzionalità degli organi e dei tessuti donati. Anestesia e preparazione prechirurgica. Metti il ratto in una camera chiusa con isoflurano al 5% per uno o quattro minuti.Confermare la corretta anestesia controllando il riflesso di pizzicamento della punta. In assenza di reazioni riflesse, eseguire l'intubazione orotracheale, calibro 14 Angiocath con l'ausilio di un laringoscopio pediatrico. Con un ventilatore meccanico precedentemente regolato e un volume corrente di 10 millilitri per chilogrammo, 90 cicli al minuto e PEEP 3,0 centimetri H2O, collegare il catetere tracheale al ventilatore e regolare la concentrazione di anestetico al 2%Rimuovere il pelo dalle regioni di interesse, testa, collo, torace e addome.Quindi, utilizzando una garza, pulire il campo chirurgico e la coda dell'animale con una soluzione alcolica di clorexidina digluconato, la procedura di disinfezione al 2% è stata ripetuta tre volte. Taglia la punta della coda dell'animale, posiziona il pollice e l'indice sulla base della coda, quindi premi e fai scorrere via dalla base. Raccogliere un campione di sangue periferico, 20 microlitri attraverso la coda per la conta totale dei leucociti. Tracheostomia.Eseguire la dissezione longitudinale della trachea cervicale, partendo dal terzo medio del collo fino all'incavo soprasternale. Incisione di circa 1,5 centimetri. Dopo l'incisione della pelle e del tessuto sottocutaneo, sezionare i muscoli cervicali fino a quando la trachea non è esposta.Posizionare la legatura in seta 2.0 sotto la trachea. Utilizzando micro forbici, le tracheostomie colpiscono il terzo superiore della trachea per ottenere una ventilazione uniforme. Tagliare orizzontalmente la trachea tra due anelli cartilaginei per accogliere il diametro di una cannula metallica, 3,5 centimetri.Inserire il tubo di ventilazione e fissarlo con legature predisposte. Collegare il tubo di ventilazione al sistema di ventilazione per piccoli animali. Ventilare il ratto con un volume corrente di 10 millilitri per chilogrammo, una velocità di 70 cicli al minuto e una PEEP di 3 centimetri H2O.Cateterismo dell'arteria e delle vene femorali. Quindi, esponi il triangolo femorale attraverso una piccola incisione, di circa 1,5 centimetri nella regione inguinale. Identificare e isolare i vasi femorali.Per questa procedura, utilizzare uno stereomicroscopio con ingrandimento 3,2x. Posizionare due legature di seta 4.0 sotto i vasi sanguigni, la vena o l'arteria, una distale e l'altra prossimale. Chiudere la legatura più distale e inserire un nodo pre-regolato nella legatura prossimale e tirare.Inserire il catetere attraverso una piccola incisione preformata nei vasi. Fissare la cannula per evitare lussazioni. Collegare il catetere arterioso a un trasduttore di pressione e a un sistema di monitoraggio dei segni vitali per registrare la MAP.Il trasduttore deve essere posizionato a livello del cuore dell'animale. Collegare il catetere per tiro con l'arco a un trasduttore di pressione e a un sistema di monitoraggio dei segni vitali per registrare la MAP. Il trasduttore deve essere posizionato a livello del cuore dell'animale.Posizionare il catetere siringa per 3 millilitri nella vena, mirando all'idratazione e al dissanguamento quando necessario. Induzione da shock emorragico. Attraverso l'asse venoso e con una siringa eparinizzata, prelevare piccoli volumi di sangue fino a raggiungere valori di MAP di circa 50 millimetri di mercurio.Così, stabilendo uno shock emorragico. Si noti che le aliquote di sangue devono essere prelevate a intervalli di 10 minuti. Mantenere la pressione stabile a circa 50 millimetri di mercurio per un periodo di 360 minuti.A tale scopo, rimuovere o aggiungere aliquote di sangue se la pressione aumenta o diminuisce rispettivamente. Metti una fonte di calore nelle vicinanze per evitare l'ipotermia. Al termine del protocollo, prelevare il blocco polmonare alla capacità polmonare totale per la raccolta e congelarlo in azoto liquido o metterlo in soluzione fissante per ulteriori studi.Induzione della morte circolatoria. Per indurre la morte circolatoria, somministrare 150 milligrammi per chilogrammo di tiopentale di sodio attraverso la linea venosa. Quindi, spegnere il sistema di ventilazione.Si noti la progressiva diminuzione della MAP. L'animale deve rimanere in ischemia calda a temperatura ambiente per 180 minuti. Al termine del protocollo, ricollegare i polmoni al ventilatore meccanico e prelevare il blocco polmonare alla capacità polmonare totale per la raccolta.E congelare in azoto liquido o metterlo in soluzione di fissazione per ulteriori studi. Induzione della morte cerebrale. Metti il ratto in posizione prona.Rimuovere la pelle dal cranio usando le forbici chirurgiche. Praticare un foro di calibro 1 millimetro, 2,8 millimetri anteriormente e 10 millimetri ventrale e 1,5 millimetri lateralmente alla sutura sagittale. Inserire l'intero catetere a palloncino nella cavità cranica e assicurarsi che il palloncino sia preriempito con soluzione fisiologica, 500 microlitri.Con l'aiuto di una siringa, gonfiare rapidamente il catetere. Confermare la morte cerebrale osservando l'aumento improvviso della MAP. Riflesso di Cushing, assenza di riflessi, midriasi bilaterale e apnea.Dopo la conferma, interrompere l'anestesia e tenere l'animale in ventilazione meccanica per 360 minuti. Posizionare una fonte di calore nelle vicinanze per evitare l'ipotermia. Al termine del protocollo, prelevare il blocco polmonare alla capacità polmonare totale per la raccolta. Risultati.Dopo l'insufflazione del catetere, il gruppo con morte cerebrale ha sperimentato un brusco aumento dei livelli di pressione sanguigna. Il picco ipertensivo è un evento peculiare correlato all'aumento della pressione intracranica, e può essere considerato la prima evidenza dell'instaurarsi della morte cerebrale. Questa pressione di picco è stata seguita da una rapida diminuzione della MAP.L'ipotensione è persistita per circa 50 minuti, dopodiché i livelli di MAP sono tornati a valori vicini a quelli basali. A differenza del gruppo di morte cerebrale, la diminuzione della MAP nel gruppo di shock emorragico è associata al ritiro di aliquote di sangue nei primi 10 minuti dell'esperimento. Lo shock ipovolemico è stato mantenuto per 360 minuti.Sei ore dopo l'insorgenza dello shock emorragico, gli animali hanno mostrato una maggiore resistenza del tessuto polmonare, seguita da una ridotta compliance del sistema respiratorio. Per valutare i cambiamenti nell'edema polmonare, è stato esaminato il rapporto tra peso umido e secco. In questo contesto, la morte cerebrale ha mostrato un maggiore edema rispetto al gruppo con shock emorragico e morte circolatoria.Infine, il gruppo shock emorragico è stato associato a un aumento del numero totale di leucociti sistemici rispetto ai valori basali e in relazione al gruppo di morte cerebrale. Ciò è stato accompagnato da un aumento dei livelli di espressione di IL1 Beta nel gruppo di morte cerebrale e nel gruppo di shock emorragico rispetto al gruppo di morte circolatoria. Il gruppo di shock emorragico ha anche mostrato livelli più elevati di TNF alfa rispetto al gruppo di morte cerebrale e al gruppo di morte circolatoria.I modelli di donatori di organi qui descritti sono potenziali strumenti nello studio dei cambiamenti associati a diverse metodologie di prelievo degli innesti e potrebbero fornire mezzi per ottenere una piena comprensione dell'impatto della qualità di questi organi sugli esiti post-trapianto. Data la riproducibilità e l'affidabilità delle metodologie qui presentate.

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