Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine
7 dicembre 2021
Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l'analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell'asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell'asta.
Le due tecniche di peeling qui dimostrate isolano i singoli compartimenti subcellulari dell'asta e possono aiutare a rivelare gli importanti processi fisiologici che si verificano in ciascun compartimento specializzato in bastoncelli sani e malati. Isolare diversi compartimenti cellulari dell'asta dalla retina del topo può essere difficile. Queste semplici tecniche utilizzano materiali di laboratorio economici e comuni per isolare in modo affidabile i compartimenti subcellulari dell'asta per l'analisi delle proteine.
Per iniziare, metti un pezzo di carta da filtro in una capsula di Petri piena di tampone Ames HEPES bollito con ossigeno al 100%. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento a foro largo, trasferire un rettangolo retinico sezionato da un mouse C57 Black 6J di due o tre mesi. Orientare la retina partizionata concava verso l'alto e assicurarsi che i fotorecettori siano rivolti verso il basso verso il fondo del piatto.
Quindi, usando una pinzetta, afferrare leggermente i lati della retina dimezzata e spostarla sopra la carta da filtro. Una volta centrata la retina, spostare la carta da filtro verso l'alto in modo che la retina dimezzata tocchi la carta da filtro per creare il segmento esterno dell'asta o ROS per l'adesione della carta da filtro. Sollevare con attenzione la carta da filtro con la retina collegata dal tampone Ames HEPES.
Posizionare il lato inferiore della carta da filtro su un tovagliolo di carta e tamponare due o tre volte per asciugare. Aggiungere una goccia di Ames HEPES sul lato della carta da filtro con la retina e posizionare nuovamente la carta da filtro sul tovagliolo di carta per asciugare. Quindi, riposizionare la carta da filtro con la retina nella capsula di Petri e, usando una pinzetta, spingere delicatamente tutti i bordi della retina dimezzata verso l'alto e lontano dalla carta da filtro su tutti i lati.
Staccare delicatamente la retina dalla carta da filtro, toccando solo il perimetro estremo della retina per preservarne l'integrità strutturale. Quindi, sollevare la carta da filtro dalla capsula di Petri e rimuovere il liquido in eccesso su un tovagliolo di carta, assicurandosi che il lato a contatto con la retina non contatti il tovagliolo di carta. Posizionare la carta da filtro con lo strato ROS parziale in un tubo etichettato su ghiaccio e mantenere la retina sbucciata immersa nel tampone Ames HEPES.
Ripetere il processo di peeling per questa retina dimezzata circa sette-otto volte per rimuovere l'intero strato ROS. Dopo ogni peeling, posizionare la carta da filtro nello stesso tubo per combinare tutti i ROS isolati da una retina dimezzata. Tenere il tubo contenente tutte le bucce di carta da filtro del ROS isolato su ghiaccio per un uso immediato.
Usando una pinzetta, trasferire la retina pelata rimanente in un tubo opportunamente etichettato e mantenere il tubo sul ghiaccio per un uso immediato. Per preparare il campione retinico per la liofilizzazione, posizionare un pezzo di carta da filtro e trasferire una retina dimezzata in una capsula di Petri piena di tampone di Ringer freddo. Successivamente, usando una pinzetta, capovolgere con attenzione la retina in modo che sia orientata verso l'alto e spostarla per appoggiarla sopra la carta da filtro.
Sollevare la carta da filtro dai bordi verso l'alto in modo che il pezzo di retina dimezzato tocchi la carta da filtro. Continuare a sollevare la carta da filtro dalla soluzione di Ringer. Quindi, posizionare il lato inferiore della carta da filtro su un tovagliolo di carta e tamponare con cura due o tre volte per rimuovere il liquido in eccesso.
Quindi, raccogliere la carta da filtro con una pinzetta e aggiungere una goccia di Ringer freddo sul lato della carta da filtro con la retina. Ancora una volta, posizionare la carta da filtro sul tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Conservare ogni campione di retina e carta da filtro aderente in una capsula di Petri piena di suonerie fredde fino al momento di congelare tutti i campioni.
Quindi, usando una pinzetta, sollevare ogni campione dal buffer della suoneria fredda, assicurandosi che le pinzette entrino in contatto solo con i bordi della carta da filtro, evitando la retina dimezzata. Posizionare il lato inferiore di ogni carta da filtro su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Quindi, aggiungere una goccia di PBS freddo sul lato della carta da filtro in cui la retina è aderente e tamponare nuovamente la carta da filtro sul tovagliolo di carta.
Posizionare tutti i pezzi di carta da filtro nella capsula di Petri e, utilizzando carta velina priva di lanugine, allontanare il liquido in eccesso che circonda la carta da filtro. Quindi, avvolgere strettamente l'intero piatto con un foglio di alluminio e assicurarsi che i bordi del foglio di alluminio siano fissati e premuti uniformemente sul fondo della capsula di Petri. Forare una manciata di fori da 0,1 a 0,2 millimetri nel coperchio del foglio di alluminio.
Successivamente, utilizzando pinze metalliche, abbassare gradualmente la capsula di Petri ricoperta di foglio di alluminio in azoto liquido. Conservare i campioni in azoto liquido fino al momento della liofilizzazione. Per la liofilizzazione, posizionare la capsula di Petri ricoperta di foglio di alluminio in un pallone di liofilizzazione e collegarla alla macchina liofilizzante seguendo il protocollo del produttore.
Liofilizzare la retina per 30 minuti. Dopo la liofilizzazione, raccogliere il segmento esterno e interno dell'asta posando con cura un piccolo pezzo di nastro adesivo sulla parte superiore della retina liofilizzata e applicando una leggera pressione con le pinzette per assicurarsi che si leghi con lo strato di fotorecettore. Staccare lentamente il nastro e assicurarsi che sia il ROS che il RIS abbiano aderito al nastro.
Un sottile film bianco sarà presente sulla superficie fratturata. Questo è il RIS. Per separare questo RIS, posizionare un altro pezzo di nastro e spingere il nastro verso il basso sulla superficie fratturata.
Quindi, posizionare il pezzo di nastro con solo lo strato rosa-arancio in un tubo microcentrifuga etichettato come ROS e pezzi di nastro con il sottile strato bianco in un altro tubo etichettato RIS. Successivamente, usando il nastro adesivo, raccogliere il tessuto retinico rimanente situato sulla carta da filtro staccando lo spesso strato bianco. Quindi, posizionare questo isolato in un tubo etichettato OIS.
Se si utilizza lo stesso giorno, conservare gli strati isolati dalla retina liofilizzata a temperatura ambiente. Negli animali adattati al buio, la distribuzione di GNAT1 e ARR1 corrispondeva strettamente alle loro distribuzioni di stato oscuro conosciute, dove il segnale GNAT1 era visibilmente più forte nell'isolamento ROS e il segnale ARR1 era più robusto nell'isolamento ROS. La quantificazione dei segnali GNAT1 e ARR1 ha mostrato differenze significative tra le condizioni di luce scura per GNAT1 e ARR1 nei campioni ROS e ROS.
Sia nei campioni scuri che in quelli adattati alla luce, i segnali G beat 5S, citocromo C e actina sono esclusi dai campioni ROS, dimostrando un'assenza di contaminazione da altri strati cellulari. Inoltre, il segnale G beta 5L era chiaramente visibile nei campioni ROS. La microscopia elettronica a scansione delle superfici della retina liofilizzata intatta e sbucciata ha dimostrato che, prima del peeling con nastro adesivo, la superficie della retina liofilizzata intatta corrispondeva strettamente al caratteristico ROS cilindrico.
Dopo la desquamazione iniziale del nastro, il ROS e il RIS sembravano essere completamente rimossi, come dimostra lo strato nucleare uniforme presente sulla superficie della retina liofilizzata, sbucciata e pelata. Le successive sbucciature del nastro hanno rimosso RIS dalla superficie libera dello strato pelato. Questa tecnica ha anche dimostrato che l'immunoreattività GRK1 era più intensa nei campioni ROS nella retina esposta alla luce e assente nei campioni OIS.
Al contrario, i campioni ROS e RIS hanno mostrato un debole segnale per PKC alfa, che comunemente non viene rilevato in ROS o RIS mediante colorazione di immunofluorescenza. Infine, il peeling del nastro non ottimale potrebbe produrre campioni leggermente contaminati. Il campione RIS è stato contaminato da alcuni campioni OIS, producendo sia le bande G beta 5L che G beta 5S e un segnale alfa PKC più elevato.
Bisogna fare attenzione quando si liofilizza la retina. Se viene utilizzata una tecnica di liofilizzazione impropria, la retina può sciogliersi, rendendo impossibile l'isolamento di diversi strati subcellulari di bastoncelli tramite nastro. L'utilizzo di questo metodo di peeling del nastro in combinazione con la qRT-PCR ha permesso la separazione dei trascritti dei fotorecettori dal resto della retina.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori di rod murine, concentrandosi sulla comprensione dei processi fisiologici sia in condizioni di salute che di malattia. I protocolli utilizzano retine vive e campioni liofilizzati, impiegando materiali di laboratorio comuni per un'efficace isolamento per l'analisi delle proteine.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia dei fotorecettori
- Analisi delle proteine
Contesto
- L'isolamento dei compartimenti subcellulari delle rod è fondamentale per studiare la fisiologia dei fotorecettori.
- Esistono sfide nel mantenere l'integrità delle strutture retiniche durante i processi di isolamento.
- Le tecniche comuni spesso richiedono strumenti avanzati o costosi; questo studio fornisce alternative più semplici.
Obiettivo dello studio
- Dettagliare i protocolli per l'isolamento dei segmenti esterni ed interni delle rod dalle retine di topo.
- Facilitare l'analisi delle proteine dei compartimenti isolati.
- Supportare futuri studi che indagano i cambiamenti fisiologici nei fotorecettori.
Metodi utilizzati
- Isolamento di retina viva utilizzando carta filtro di cellulosa e tampone Ames HEPES.
- Processo di liofilizzazione sia per gli isolamenti del segmento esterno che di quello interno.
- Utilizzo di nastro adesivo per rimuovere gli strati dalla retina liofilizzata.
- Più iterazioni di peeling per garantire un isolamento completo degli strati.
Risultati principali
- I metodi descritti consentono una separazione affidabile dei segmenti esterni (ROS) e interni (RIS) delle rod.
- I test hanno confermato segnali proteici distinti in ROS e RIS in diverse condizioni di luce.
- Lo studio evidenzia distinte differenze molecolari tra i compartimenti isolati.
Conclusioni
- Questo lavoro consente una migliore comprensione della funzionalità dei fotorecettori di rod attraverso un'analisi dettagliata dei compartimenti.
- Le tecniche di isolamento possono essere adattate ampiamente per applicazioni di ricerca nella biologia dei fotorecettori.
- I risultati possono informare future ricerche sulle malattie retiniche e la fisiopatologia dei fotorecettori.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolating subcellular compartments of rod photoreceptors enables precise measurement of protein distribution, supporting target validation in retinal disease research. These peeling methods provide enriched, compartment-specific fractions for quantitative western blot analysis, improving mechanistic de-risking of photoreceptor targets. The techniques are adaptable to healthy and degenerating retinae, offering translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating rod outer segment (ROS) and inner segment (RIS) for protein-specific analysis.
- Operational Value: Uses inexpensive, common lab materials (filter paper, tweezers, tape) to isolate subcellular compartments without specialized equipment.
- Predictive Value: Facilitates quantitative measurement of photoreceptor protein redistribution under dark- and light-adapted conditions, supporting functional target assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers enriched subcellular fractions (ROS, RIS, OIS) that reduce contamination from other retinal layers, improving assay specificity.
- Operational Value: Simple peeling workflow allows rapid preparation of samples for downstream protein analysis, increasing throughput in early screening.
- Predictive Value: Enables reliable detection of compartment-specific proteins (e.g., GNAT1 in ROS, ARR1 in ROS) under defined physiological conditions, supporting biomarker-aligned assay design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by allowing isolation of compartments from both healthy and degenerating retinae.
- Operational Value: Lyophilization and tape-based peeling preserve structural integrity, enabling consistent sample preparation across experimental conditions.
- Predictive Value: Demonstrates absence of contamination (e.g., exclusion of G beta 5S, cytochrome C, actin from ROS) confirming layer-specific protein signals for reliable translational readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven isolation of photoreceptor compartments prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating ROS and RIS to study protein localization and redistribution.
- Screening: Generates quantitative, compartment-specific protein outputs suitable for assay standardization and reproducibility testing.
- Analytics: Provides measurable readouts (e.g., GNAT1, ARR1, GRK1 signals) that allow comparison across light/dark conditions and disease states.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by enabling protein analysis in disease models of retinal degeneration.
- Enterprise Reuse: Protocol uses standardized, low-cost materials, supporting adaptation across labs and model systems as a reusable isolation capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through compartment-specific protein resolution.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via simple, repeatable peeling steps using accessible lab supplies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of target engagement and subcellular specificity, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on target distribution in photoreceptor compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection and handling of delicate neural tissue under sterile or controlled conditions.
- Dependent on standard lab equipment: Petri dishes, filter paper, tweezers, tape, lyophilizer, and buffers (Ames HEPES, Ringer's, PBS).
- Necessitates cross-team standardization of peeling technique and lyophilization timing to ensure sample integrity and reproducibility.
- Must account for adaptation across model systems, as retinal curvature and layer thickness may vary between species or disease states.
- Practical limitation: suboptimal tape peeling or improper lyophilization can yield contaminated samples, requiring careful technique execution.
