Name: Profilazione della sensibilità alle terapie mirate negli organoidi derivati dal paziente NSCLC EGFR-Mutant (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Scopri la profilazione della sensibilità farmacologica negli organoidi derivati da pazienti con NSCLC EGFR-mutante usando osimertinib. Questo metodo supporta lo sviluppo di terapie personalizzate per il cancro al polmone.

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Ringraziamo i laboratori di Jeroen P Roose (UCSF) e Calvin J Kuo (Stanford) per il loro contributo alla coltura organoide e allo sviluppo del protocollo. Ringraziamo inoltre Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) per i protocolli e l'input di creazione del campione. Questo progetto di ricerca è stato condotto con il supporto del NIH [U54CA224081]. F. Haderk è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato Mildred Scheel del German Cancer Aid.

Per la ricerca su soggetti umani, è stato ottenuto il consenso informato e la raccolta dei tessuti è stata effettuata nell'ambito dei protocolli approvati dall'UCSF Internal Review Board (IRB, protocollo n.: #13-12492, o CC#17-23309). La creazione di colture organoidi da campioni clinici de-identificati è stata eseguita in collaborazione con partner di ricerca secondo metodi precedentemente pubblicati13,14,15,16. Le colture organoidi sono state recuperate per la manutenzione e gli esperimenti di escalation dei farmaci al passaggio tre o più tardi. Tutti i seguenti protocolli sono stati eseguiti in condizioni asettiche in un ambiente di laboratorio di coltura di tessuti di mammiferi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2.jpg"> Figura 1: Schema del protocollo del flusso di lavoro e passaggi critici nella tecnica. (A) Flusso di lavoro sperimentale che include la semina di organoidi in formato a 96 pozzetti, il trattamento con escalation del farmaco a 7 giorni dopo la semina e la lettura della sopravvivenza cellulare basata sulla luminescenza 5 giorni dopo il trattamento utilizzando un lettore di piastre ELISA. (B) Un'immagine di esempio delle colture organoidi EGFRdel19-positive TH107 e EGFRL858R-positive TH330 NSCLC. Vengono mostrate colture originali, cellule al momento della semina (giorno 0) e organoidi al trattamento che iniziano 7 giorni dopo la semina (giorno 7). Barra della scala = 100 μm. I cambiamenti nel diametro degli organoidi durante il periodo di coltura iniziale di 7 giorni sono quantificati e indicano &gt;2 volte l'aumento delle dimensioni degli organoidi. Le variazioni relative delle dimensioni al giorno 7 rispetto alle dimensioni medie al giorno 0 sono presentate sotto le immagini rappresentative. Per TH107, si osserva un cambiamento di piega di 2,38 in 7 giorni, indicando un tempo di raddoppio di 5,88 giorni (141,12 h). Per TH330, si osserva un cambio di piega di 2,41 in 7 giorni, indicando un tempo di raddoppio di 5,81 giorni (139,42 ore). Vengono presentate la quantificazione delle variazioni delle dimensioni degli organoidi e la valutazione statistica (a destra). La significatività statistica è calcolata mediante t-test spaiato, p &lt; 0,0001. (C) Layout di trattamento per l'escalation del farmaco in formato di piastra organoide a 96 pozzetti. Sono indicati il numero di repliche tecniche e dosi esemplari, compreso un controllo negativo. Gli schemi sono creati con BioRender, uno strumento di illustrazione basato sul web. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
1. Preparazioni sperimentali
<ol><li>Preparare il mezzo di crescita (GM) come precedentemente riportato15: Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's nutrient mixture F12 (DMEM/F-12) con L-alanil-L-glutammina, integrata con 100 U/mL penicillina/streptomicina, 10 mM HEPES, 25 nM hRspondina, 1x B27, 5 mM Nicotinamide, 1,25 mM N-Acetilcisteina, 500 nM A-8301, 500 nM SB202190, 50 μg/mL Primocina, 100 ng/mL hNoggin, 100 ng/mL hFGF-10, 25 ng/mL hFGF-7 (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma e filtrare attraverso un sistema di filtraggio da 0,22 μm. Riscaldare i fluidi a 37 °C entro 1 ora prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare mezzi a basso fattore di crescita (LGM) come precedentemente riportato16 senza l'aggiunta di fattore di crescita epidermico (EGF): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's nutrient mixture F12 (DMEM/F-12), integrato con 1 mM HEPES, 1x L-alanil-L-glutammina, 1x Penicillina-Streptomicina-Glutammina, 10 mM Nicotinamide, 1 mM N-Acetilcisteina, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ng/mL hNoggin. NOTA: Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Riscaldare i fluidi a 37 °C entro 1 ora prima dell'uso.</li>
	<li>Scongelare BME2 (Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, vedi Tabella dei materiali) su ghiaccio, a 4 °C, durante la notte.</li>
</ol>2. Generazione di sospensione unicellulare e semina delle cellule
<ol><li>Dissociare la coltura di organoidi BME2 sommersi come descritto nelle fasi seguenti (2.1.1-2.1.6).<ol>
<li>Aspirare accuratamente i mezzi dalle piastre di coltura. Evitare di toccare la coltura organoide BME2 sommersa. NOTA: Media Aspiration può essere fatto come il ricercatore preferisce, ad esempio, con un sistema di aspirazione del fluido di base o utilizzando una pipetta. Evitare di toccare gli organoidi incorporati BME2 in quanto ciò potrebbe comportare la perdita di biomassa organoide.</li>
		<li>Tripsinizzare la coltura organoide di BME2 sommersa con un enzima ricombinante adatto (vedi Tabella dei materiali). In formato piastra a 6 pozzetti, aggiungere 2 ml per pozzetto. Rompere meccanicamente il BME2 pipettando ripetutamente su e giù. Incubare le piastre a 37 °C nell'incubatore di colture cellulari per 5 min.</li>
		<li>Trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 15 mL e centrifugare a 600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare accuratamente l'enzima ricombinante senza toccare il pellet organoide. NOTA: potrebbe essere presente BME2 residuo. Ripetere la digestione enzimatica se necessario.</li>
		<li>Sospendere il pellet organoide in GM (fase 1.1). Aggiungere DNasi I 1x 100 U/mL e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Centrifugare a 600 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Pipettare con attenzione il supporto senza toccare il pellet organoide e scartare. Riespeso in GM freschi.</li>
	</ol></li>
	<li>Semina di sospensioni monocellulari organoidi<ol><li>Preriscaldare una nuova piastra nera a fondo chiaro a 96 pozzetti a 37 °C nell'incubatore di colture cellulari per 10 minuti. NOTA: l'uso di piastre inferiori trasparenti è essenziale per monitorare la crescita degli organoidi e la risposta al farmaco.</li>
		<li>Per il conteggio, preparare una diluizione 1:5 della sospensione cellulare in PBS (volume totale: 500 μL) e contare la sospensione cellulare utilizzando un analizzatore cellulare (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Assicurarsi di moltiplicare per il fattore di diluizione (x 5) per ricevere la concentrazione cellulare finale. È possibile utilizzare metodi di conteggio alternativi come un emocitometro. La vitalità cellulare deve essere monitorata utilizzando un test di colorazione di vitalità (ad esempio, con Trypan Blue17). Utilizzando un analizzatore di celle, la redditività viene valutata automaticamente. La vitalità delle sospensioni organoidi monocellulari valutata dall'analizzatore cellulare deve essere ≥95% (Figura supplementare 1).</li>
		<li>Calcola il volume della sospensione cellulare necessaria per seminare per l'esperimento. NOTA: La concentrazione di semina è di 1500 cellule/μL BME2, con 5 μL BME2 necessari per pozzetto (Numero totale: 7500 cellule/pozzetto). Per una piastra da 96 pozzetti, sono necessarie 6 celle 10E5. Ciò include la semina di 60 pozzi con cupole organoidi (4,5 x 10E5) e surplus sperimentale (calcolo per un totale di 80 pozzi).</li>
		<li>Preparare un'aliquota di sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml per ogni piastra da 96 pozzetti che si prevede di seminare se nell'esperimento sono incluse più piastre da 96 pozzetti. NOTA: sono necessarie eccedenze sperimentali e aliquote separate per piastra a 96 pozzetti seminata per tenere conto dell'aumento della distorsione sperimentale dovuta alla manipolazione di BME2.</li>
		<li>Cellule aliquote della sospensione monocellulare calcolate (fase 2.2.3) dopo un'attenta risospensione mediante pipettaggio su e giù. Celle a pellet a 600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il supporto utilizzando una pipetta P200 senza toccare il pellet della cella. Posizionare il pellet di cella sul ghiaccio a breve (~ 1 min) e risospescere il pellet di cella in BME2. NOTA: i fluidi residui possono compromettere la struttura e la rigidità di BME2. Pipettare con cura tutti i supporti. Posizionare le cellule sul ghiaccio a breve per acclimatare il pellet cellulare e consentire alle cellule di essere risospese in BME2 senza aggregarsi. Mantenere BME2 sul ghiaccio costantemente affinché rimanga allo stato liquido. Per una piastra da 96 pozzetti, sono necessari 400 μL BME2 per la risospensione del pellet cellulare. Sospendere accuratamente i pellet cellulari, evitando l'introduzione di bolle.</li>
		<li>Inclina la tua piastra nera preriscaldata a fondo trasparente a 96 pozzetti verso di te. Celle a piastre che utilizzano 5 μL di sospensione cellulare per pozzetto e cupole di cellule di semina a ore 6 di ciascun pozzetto (Figura 1A).  Seminare le cupole cellulari nei restanti pozzetti interni (colonne 2-10 e righe B-G di una piastra a 96 pozzetti). NOTA: il pipettaggio inverso18 è consigliato quando si maneggia BME2.</li>
		<li>Non spostare la piastra a 96 pozzetti e incubare cupole cellulari appena seminate nella cappa a flusso laminare di coltura cellulare per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi spostare la piastra nell'incubatore di colture cellulari e incubarla per 10 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Aggiungere con attenzione 100 μL di GM per pozzetto a tutti i pozzetti contenenti organoidi (colonne 2-10 e righe B-G di una piastra a 96 pozzetti). Aggiungere 100 μL di PBS ai pozzetti esterni sul bordo della piastra.</li>
		<li>Coltura BME2 incorporato organoidi in mezzi GM a 37 °C nell'incubatore di colture cellulari per un totale di 7 giorni. Ispezionare regolarmente la crescita degli organoidi al microscopio ottico. NOTA: Fare riferimento alla Figura 1B e alla Tabella supplementare 1 per un esempio di progresso di crescita previsto dalla semina al giorno del trattamento.</li>
		<li>Cambiare il supporto una volta dopo 3-4 giorni di coltura: ruotare la piastra in senso orario di 180° (organoidi ora a ore 12), aspirare accuratamente GM dalla posizione opposta alla cupola organoide utilizzando un apparato multicanale se disponibile, e quindi aggiungere GM fresco.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Trattamento farmacologico
<ol><li>Preparare una diluizione seriale del farmaco in LGM per il farmaco di scelta, ad esempio osimertinib, per il trattamento degli organoidi NSCLC mutanti EGFR. Includere un controllo negativo (fluidi LGM + 0,1% DMSO). Preparare aliquote di farmaco sufficienti di tutte le dosi in base al numero di pozzetti seminati più l'eccedenza sperimentale. NOTA: Una serie di diluizioni comprendente ≥8 dosi e che vanno da 1 nM-10 μM è raccomandata per gli inibitori mirati.</li>
	<li>Ruotare la piastra organoide in senso orario di 180° (organoidi ora a ore 12). Aspirare accuratamente GM utilizzando preferibilmente un apparecchio multicanale. NOTA: Evitare di toccare la cupola organoide durante l'aspirazione del GM in quanto ciò potrebbe comportare la perdita di biomassa organoide e risultati di impatto.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di controllo (ad esempio, fluidi LGM + 0,1% DMSO) o soluzione farmacologica per pozzetto. NOTA: fare riferimento alla Figura 1C per lo schema di trattamento dell'escalation del farmaco in formato piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Incubare gli organoidi trattati a 37 °C nell'incubatore di colture cellulari per 5 giorni.</li>
</ol>4. Lettura mediante test di sopravvivenza basato sulla luminescenza
<ol><li>Raccolta e lettura della sopravvivenza<ol>
<li>Eseguire il test di sopravvivenza secondo Reference19.<ol>
<li>Reagente di scongelamento (vedi Tabella dei materiali) durante la notte a 4 °C. Equilibrare il reagente a bagnomaria a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso e mescolare invertendo.</li>
			<li>Aggiungere un volume uguale del reagente a ciascun pozzetto (100 μL per pozzetto). Mescolare accuratamente con il pipettaggio su e giù, con la punta della pipetta posta nella posizione della cupola organoide. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
			<li>Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire circa il 75% (150 μL) del lisato (punto 4.1.1.2) su una nuova piastra bianca a fondo opaco a 96 pozzetti. NOTA: il trasferimento del 75% dei lisati su una nuova piastra garantisce l'assenza di bolle nella lettura successiva senza influire sulla sensibilità del test.</li>
			<li>Incubare per altri 25 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Registrare la luminescenza utilizzando un lettore di piastre ELISA (tempo di integrazione 0,25-1 s/per pozzetto) (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Salvare i dati in un formato appropriato, ad esempio una tabella dati contenente tutte le letture grezze e la registrazione del layout della piastra e dei farmaci utilizzati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi dei dati tramite software di analisi statistica (vedi Tabella dei materiali)<ol>
<li>Creare una nuova tabella XY e inserire i dati in un formato XY: le righe (X) sono un controllo negativo seguito da dosi di farmaco crescenti, con dosi come log [Inibitore] nella concentrazione molare. Le colonne (Y) sono valori di lettura che includono le repliche in pila insieme alle colonne. NOTA: La concentrazione del controllo negativo deve essere indicata come valore minimo (dato 0 non è possibile in scala logaritmica), ad esempio log [Inibitore], M = -10.</li>
		<li>Normalizzare i valori selezionando Analizza &gt; Normalizza e utilizzando i seguenti parametri: normalizzare ogni sottocolonna separatamente, Y = 0 come 0 %, "ultimo valore in ogni sottocolonna (o primo, a seconda di quale sia il più grande)" come 100 %, risultati in percentuali, rappresentare graficamente i risultati.</li>
		<li>Adatta la curva di regressione non lineare sui dati normalizzati selezionando Analizza analisi &gt; XY &gt; Regressione non lineare &gt; Risposta alla dose - Inibizione &gt; log (inibitore) vs . risposta normalizzata - Pendenza variabile.</li>
		<li>Riporta i risultati come una tabella di valori IC50 emessi dopo l'analisi di regressione non lineare e il grafico della curva di risposta, inclusi i punti dati normalizzati come deviazione media +/- standard e curva di regressione adattata.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

T.G.B. è consulente di Array Biopharma, Revolution Medicines, Novartis, AstraZeneca, Takeda, Springworks, Jazz Pharmaceuticals, Relay Therapeutics, Rain Therapeutics, Engine Biosciences e riceve finanziamenti per la ricerca da Novartis, Strategia, Kinnate e Revolution Medicines.

Questo manoscritto sviluppa e descrive un protocollo standardizzato per la valutazione della sensibilità ai farmaci in modelli DOP 3D derivati da NSCLC. Oltre agli studi di sensibilità ai farmaci, è necessaria un'ulteriore caratterizzazione dei modelli organoidi disponibili per determinare le cause alla base delle differenze nella sensibilità ai farmaci. Ciò può includere la profilazione genetica di organoidi e campioni di pazienti e altre analisi disponibili per gli organoidi, come la colorazione immunoistochimica per i marcatori di differenziazione e i biomarcatori e la fisiologia generali di segnalazione cellulare13,29.
Passaggi critici nel protocollo Il protocollo qui delineato fornisce un flusso di lavoro standardizzato che consente analisi accurate e riproducibili della sensibilità ai farmaci se seguite attentamente. Particolare attenzione deve essere prestata nelle seguenti fasi: digestione di TrypLE e DNAse I durante la generazione di sospensioni monocellulari, semina di sospensioni monocellulari in BME2, monitoraggio della crescita organoide fino al trattamento, cambiamenti dei media e interruzione e lisi degli organoidi incorporati BME2 durante la lettura della sopravvivenza cellulare basata sulla luminescenza. (1) Mentre la digestione aggiuntiva di DNAse I dopo la dissociazione degli organoidi basata su TrypLE non è essenziale per espandere i modelli organoidi durante il regolare mantenimento della coltura, la digestione della DNAse I non dovrebbe essere omessa quando si semina per esperimenti di escalation di farmaci in quanto garantisce una migliore separazione dei cluster organoidi in sospensioni monocellulari e un accurato conteggio cellulare. (2) La semina di sospensioni monocellulari in BME2 rappresenta un passo critico data la solidificazione di BME2 a temperatura ambiente. Pertanto, un massimo di 1-2 file deve essere seminato contemporaneamente e i campioni devono essere posti sul ghiaccio prima che vengano seminate ulteriori file. Da notare, le cellule devono essere pipettate su e giù quando si continua la semina per consentire una sospensione cellulare omogenea. (3) La crescita degli organoidi deve essere monitorata attentamente durante l'espansione di 7 giorni dalla semina al trattamento. Un esempio dello sviluppo previsto è riportato nella figura 1B e nella tabella supplementare 1. Da notare, la valutazione dei cambiamenti nelle dimensioni degli organoidi mediante microscopia a campo luminoso e analisi delle immagini come presentato nella Figura 1B può consentire una valutazione precisa delle differenze nella crescita degli organoidi e nei tempi di raddoppio. I tempi di raddoppio possono avere un impatto sulle risposte ai farmaci, come recentemente discusso in letteratura30. Se il tasso di crescita degli organoidi supera significativamente l'esempio presentato, si può prendere in considerazione un tempo di espansione più breve fino all'inizio del trattamento e una durata del trattamento più breve. (4) Inoltre, si deve prestare particolare attenzione quando si cambiano i fluidi per evitare l'aspirazione di organoidi. La posizione di semina degli organoidi incorporati BME2 a ore 6 consente un'aspirazione sicura del fluido quando le piastre vengono ruotate in senso orario di 180 ° e il fluido viene aspirato nella posizione opposta degli organoidi. (5) Infine, la lisi completa degli organoidi incorporati in BME2 durante la lettura della sopravvivenza è essenziale per registrare risultati accurati. Secondo le istruzioni del produttore, i campioni devono essere pipettati su e giù ripetutamente, idealmente utilizzando punte non filtrate, per garantire una corretta lisi. I tempi di incubazione devono essere seguiti come descritto. Inoltre, il trasferimento del 75% del lisato (anziché del volume totale) su una piastra bianca a fondo opaco a 96 pozzetti per la lettura finale utilizzando un lettore di piastre ELISA consente una valutazione appropriata, in quanto ciò garantisce lo stesso volume in ciascun pozzetto e l'assenza di bolle d'aria che possono essere introdotte mediante un vigoroso pipettaggio.
Da notare, la profilazione delle risposte ai farmaci in colture organoidiche incorporate in BME2 può mostrare una deviazione standard più elevata rispetto a quella osservata nelle colture cellulari regolari (Figura 2, Figura 3A). La deviazione standard più elevata si basa su diversi fattori, tra cui una maggiore probabilità di piccole variazioni nella semina quando si lavora con BME2 e differenze nei tassi di crescita dei singoli organoidi tra i pozzi nel periodo di crescita iniziale di 7 giorni. Pertanto, dovrebbero essere seminate uguali o più di quattro repliche tecniche per concentrazione di farmaco.
Ancora più importante, la presenza di cellule maligne portatrici della mutazione del driver oncogenico e la contaminazione limitata da parte delle normali cellule epiteliali delle vie aeree devono essere attentamente valutate. Le sfide nella costituzione di NSCLC possono favorire la crescita delle normali cellule epiteliali delle vie aeree7. Il profilo del numero di copia o gli approcci basati sulla PCR e sul sequenziamento per confermare la presenza delle mutazioni del driver oncogenico sono i metodi di scelta per garantire la qualità delle colture organoidiche NSCLC.
Modifiche e risoluzione dei problemi del metodo I media e i rispettivi fattori di crescita aggiunti alle soluzioni multimediali di base possono avere un impatto significativo sulla risposta dei farmaci agli inibitori mirati. Attivano i recettori di bypass e le vie di segnalazione che influenzano e limitano la risposta ai farmaci (ad esempio, FGF, HGF, EGF)26. Mentre un fattore di crescita ricco e su misura può essere ottimale per espandere la coltura di organoidi, l'escalation dei farmaci e le valutazioni della sensibilità dovrebbero essere eseguite in un mezzo a fattore di crescita ridotto, come descritto sopra. Ciò si basa sull'esperienza interna che confronta diverse formulazioni dei media e dati sulla risposta ai farmaci (Figura 3C). Mentre le soluzioni multimediali possono influenzare il grado di sensibilità a determinati trattamenti farmacologici e possono spostare i valori IC50 , fenotipi robusti di sensibilità o resistenza sono evidenti indipendentemente dalla formulazione dei media (Figura 3C, D). Inoltre, si raccomanda una coerenza generale nella formulazione dei mezzi e la profilazione delle risposte ai farmaci tra le colture organoidiche e devono essere seminate una replica tecnica uguale o superiore a quattro per concentrazione. Ciò è particolarmente importante per confrontare gli intervalli di sensibilità rispetto a. resistenza per l'Inibitore di interesse.
Limitazioni del metodo Il protocollo qui presentato descrive la sensibilità dei modelli organoidi del cancro NSCLC 3D agli inibitori mirati quando vengono coltivate cellule tumorali derivate dal paziente. Ulteriori esperimenti, tra cui l'analisi farmacodinamica riguardante l'inibizione della via e l'analisi di sequenziamento per la presenza dell'oncogene driver e delle mutazioni secondarie, sono necessari per una caratterizzazione dettagliata della resistenza e della sensibilità ai farmaci. Inoltre, i fattori degli astanti come gli stimoli microambientali derivati da interazioni o fattori secreti da cellule non tumorali nel microambiente tumorale non sono presi in considerazione e sono necessari nuovi protocolli quando si tentano modelli organoidi di co-coltura con cellule immunitarie o stromali. Recenti lavori hanno evidenziato l'uso di modelli organoidi per ricapitolare le interazioni del microambiente tumorale e profilare le risposte agli inibitori del checkpoint immunitario, come il trattamento anti-PD-L113,31.
Il significato del metodo rispetto ai metodi esistenti / alternativi I modelli organoidi 3D del cancro ricapitolano la diversità genetica e i determinanti della risposta al trattamento presenti nel tumore originale4,5,6. In particolare, l'eterogeneità spaziale e temporale può promuovere l'evoluzione del tumore e possono verificarsi l'emergenza parallela e lo sviluppo sequenziale di sottocloni tumorali32,33. L'eterogeneità intratumorale è significativa per la selezione di cellule tumorali più resilienti sotto pressione terapeutica9,34,35. Il protocollo qui fornito consente una rapida valutazione della sensibilità al trattamento con inibitori mirati in campioni vicini al paziente. Pertanto, i modelli organoidi presentano vantaggi rispetto ai modelli di linee cellulari omogenee più convenzionali privi di diversità genetica o studi a lungo termine che utilizzano linee cellulari o xenotrapianti derivati dal paziente. Inoltre, il presente protocollo consente di scalare fino a più bracci di trattamento e approcci di trattamento combinato con poche limitazioni per quanto riguarda i costi e la capacità analitica. Pertanto, l'aggiunta di un secondo farmaco di interesse a una dose fissa mentre si intensifica l'inibitore principalmente mirato e lo si confronta con l'escalation dell'inibitore principalmente mirato da solo consente di valutare in modo efficiente i potenziali effetti combinatori e con una biomassa aggiuntiva minima richiesta (Figura supplementare 3). Rispetto alle valutazioni basate sull'imaging utilizzate per monitorare lo sviluppo di organoidi e la risposta ai farmaci, il test di sopravvivenza cellulare basato sulla luminescenza qui descritto ha una sensibilità simile con attrezzature e formazione minimi richiesti.
Importanza e potenziali applicazioni del metodo in specifiche aree di ricerca Lo sviluppo di una pipeline standardizzata che consenta di stabilire modelli organoidi di cancro da campioni di pazienti e il successivo profilo di sensibilità ai farmaci ha un significativo potenziale di applicabilità clinica. Il profilo farmacologico ex vivo ha ottenuto riconoscimenti nel rilevare vulnerabilità e caratteristiche resistenti associate nei tumori, in correlazione con la risposta al trattamento nei pazienti36,37. Significativamente, la profilazione ex vivo delle sensibilità ai farmaci può aiutare nella selezione del trattamento in clinica e nella progettazione di trattamenti combinati razionali che affrontano i meccanismi di resistenza. Nel complesso, questo approccio potrebbe aiutare a migliorare le strategie personalizzate per la terapia molecolare o i regimi di trattamento combinatorio. Quest'ultimo può aiutare a indirizzare precocemente i meccanismi di tolleranza e resistenza ai farmaci e approfondire la risposta clinica per migliorare i risultati dei pazienti in futuro.

Le terapie personalizzate contro i driver oncogeni hanno rivoluzionato il trattamento del cancro, migliorando la sopravvivenza dei pazienti e riducendo gli effetti collaterali mediati dal trattamento1. I recenti progressi nella diagnostica molecolare e nelle tecnologie di sequenziamento hanno evidenziato la complessità dei tumori umani, con l'eterogeneità spaziale e temporale che influisce sulla risposta al trattamento2. La ricapitolazione di queste differenze subclonali nei modelli di coltura cellulare è stata a lungo limitata allo studio di alterazioni selezionate di interesse in linee cellulari altrimenti uniformi. I modelli DOP 3D di recente sviluppo generati da biopsie tumorali o resezioni chirurgiche del tumore consentono una migliore rappresentazione della complessità cellulare e della diafonia di segnalazione all'interno del tessuto tumorale derivato dal paziente3. Pertanto, gli organoidi tumorali derivati dal cancro gastrointestinale e pancreatico sono stati generati con successo e ricapitolano la diversità genetica e i determinanti della risposta al trattamento4,5,6. Nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), le sfide dello sviluppo e dell'insediamento di organoidi sono riconosciute e l'ottimizzazione delle tecniche di coltura e dei fattori selettivi dei mezzi è necessaria per consentire un uso più ampio e sistematico delle DOP NSCLC in futuro7,8.
Lo sviluppo di terapie combinatorie mirate alle cellule tumorali residue che resistono al trattamento farmacologico iniziale è essenziale per inibire lo sviluppo della resistenza e, in ultima analisi, per migliorare la sopravvivenza del paziente9. Data la complessità architettonica delle colture organoidiche, i parametri classici di risposta ai farmaci devono essere ottimizzati per consentire test accurati e riproducibili della sensibilità ai farmaci. Letture basate sull'imaging10,11 e saggi di vitalità cellulare classici che misurano l'abbondanza di ATP cellulare6,12, tra le altre tecniche, sono disponibili per profilare le risposte ai farmaci nelle colture DOP. Qui, sviluppiamo e descriviamo un protocollo standardizzato per valutare la sensibilità dei farmaci alla terapia mirata rispetto a driver clinici noti in modelli NSCLC PDO.

<table><tbody><tr><td>Provette da 1,5 mL Provette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>da centrifuga da 15 mL</td></tr><tr><td>500 mL Sistema di filtro/bottiglia di conservazione sottovuoto, 0,2 & micro; m Poro 33,2 cm2 Membrana in nylon</td><td>Corning</td><td>430773</td><td>per entrambi i terreni</td></tr><tr><td>Micropiastra nera a 96 pozzetti, trattata con coltura cellulare, fondo piatto trasparente</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti, trattata con colture cellulari, solida bianca Micropiastra a fondo piatto</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>A-8301</td><td>Tocris Bioscience</td><td>293910</td><td>per entrambi i terreni</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>per LGM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>per entrambi i media</td></tr><tr><td>BioRender 2021</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>online software di illustrazione scientifica</td></tr><tr><td>BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2)</td><td>R& D Systems</td><td>353301002</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari (37 ° C, 5% CO2)</td>CellTiter-Glo <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9682</td><td>Reagente di lettura 3D-CTG</td></tr><tr><td>Centrifuga contenente 15 mL di provette</td><td></td><td></td><td></td>da centrifuga</tr><tr><td>Desossiribonucleasi I (DNAsi I)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Corning</td><td>MT21031CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, supplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>per GM</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>per software LGM</td></tr><tr><td>GraphPad Prism (versione 9.2.0)</td><td>Software di analisi statistica</td> <td>GraphPad</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>per entrambi i terreni</td></tr><tr><td>hFGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26-100ug</td><td>per GM</td></tr><tr><td>hFGF-7</td><td>PeproTech</td><td>100-19-50ug</td><td>per GM</td></tr><tr><td>hNoggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C-100ug</td><td>per entrambi i terreni</td></tr><tr><td>hRspondin</td><td>PeproTech</td><td>120-38-100ug</td><td>per puntali</td></tr><tr><td>per pipette GM a bassa ritenzione, 20 e micro; L (P20)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2149P-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette a bassa ritenzione, 200 & micro; L (P200)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2069-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette di lunghezza regolare, 1000 & micro; L (P1000)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2179-HR</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td></td><td></td><td></td>multicanale</tr><tr><td>N-Acetilcisteina</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-424-777</td><td>per entrambi i terreni</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>per entrambi i terreni</td></tr><tr><td>Osimertinib</td><td>Selleck Checm</td><td>S7297</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>per LGM</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV30010</td><td>per</td></tr><tr><td>pipette GM (diverse dimensioni)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Dispositivi molecolari Apparecchiature</td><td>SpectraMax M5</td><td>, possono essere utilizzati lettori alternativi</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>per GM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Selleck Chem</td><td>S1077</td><td>per GM</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a vuoto e tubi Analizzatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellulare Vi-CELL XR</td><td>Beckman Coulter Analizzatore</td> cellulare <td>Vi-CELL XR</td><td>/ contatore</td></tr></tbody></table>

profilazione della sensibilità alle terapie mirate negli organoidi derivati dal paziente nsclc egfr-mutant

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Nuove colture organoidi tumorali 3D derivate da campioni di pazienti clinici rappresentano un importante sistema modello per valutare l'eterogeneità intratumorale e la risposta al trattamento agli inibitori mirati nel cancro. Il lavoro pionieristico nei tumori gastrointestinali e pancreatici ha evidenziato la promessa di organoidi derivati dal paziente (DOP) come sistema di coltura prossima al paziente, con un numero crescente di modelli emergenti. Allo stesso modo, il lavoro in altri tipi di cancro si è concentrato sulla creazione di modelli organoidi e sull'ottimizzazione dei protocolli di coltura. In particolare, i modelli organoidi tumorali 3D mantengono la complessità genetica dei campioni tumorali originali e quindi traducono i dati di sequenziamento derivati dal tumore in trattamento con terapie mirate geneticamente informate in un ambiente sperimentale. Inoltre, le DOP potrebbero favorire la valutazione di trattamenti combinati razionali per superare l'adattamento associato alla resistenza dei tumori in futuro. Quest'ultimo si concentra su intensi sforzi di ricerca nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), poiché lo sviluppo della resistenza alla fine limita il successo del trattamento degli inibitori mirati. Una valutazione precoce dei meccanismi terapeuticamente mirabili utilizzando NSCLC DOP potrebbe aiutare a informare i trattamenti combinati razionali. Questo manoscritto descrive un protocollo standardizzato per la valutazione basata su piastre di coltura cellulare della sensibilità dei farmaci agli inibitori mirati nelle DOP 3D derivate da NSCLC, con potenziale adattabilità a trattamenti combinati e altre modalità di trattamento.

Sono state rilevate notevoli sfide nella creazione di organoidi NSCLC7. Pertanto, è emozionante vedere il recente lavoro che stabilisce organoidi del cancro del polmone e li utilizza per i test di trattamento farmacologico20,21,22. Le mutazioni di EGFR rappresentano l'11,3% dei casi di NSCLC23. Il trattamento mirato con inibitori dell'EGFR rappresenta l'opzione di trattamento di prima linea nel NSCLC mutante dell'EGFR e ha migliorato la sopravvivenza globale e la sicurezza del trattamento nei pazienti24. Questo lavoro ha determinato la sensibilità all'inibitore della tirosin-chinasi EGFR approvato dalla FDA osimertinib24,25 negli organoidi NSCLC EGFR-mutanti. Gli organoidi NSCLC EGFR-mutanti sono stati generati da campioni chirurgici di resezione o biopsia tumorale di pazienti con NSCLC e confermati per ospitare la mutazione oncogenica indicata mediante sequenziamento del DNA. Come descritto sopra, i modelli organoidi di NSCLC EGFR-mutanti sono stati trattati con dosi crescenti di osimertinib e vitalità PDO valutate mediante lettura della sopravvivenza cellulare basata sulla luminescenza cinque giorni dopo l'inizio del trattamento. Mentre gli organoidi TH107 mutanti EGFR (EGFRdel19)-positivi hanno mostrato sensibilità al trattamento con osimertinib con una concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) di 56 nM (Figura 2A), gli organoidi TH116 EGFR-mutanti (EGFRL858R)-positivi erano resistenti al trattamento con osimertinib con un IC50 superiore a 1 μM (Figura 2B). La sensibilità del NSCLC TH107 EGFRdel19-positivo è stata accompagnata da significativi cambiamenti trascrizionali, tra cui una riduzione dell'espressione delle firme geniche associate al ciclo cellulare e un aumento dell'espressione delle firme geniche associate all'apoptosi (Figura supplementare 2A,B). Come riferimento, vengono presentati i dati di risposta per la linea cellulare NSCLC sensibile EGFRdel19-positiva PC9 (Figura 3A,B). Quest'ultimo include l'analisi della sopravvivenza a dosi crescenti di osimertinib mediante un saggio di sopravvivenza basato sulla luminescenza 2D (Figura 3A) e lo studio della soppressione della segnalazione a livello di segnalazione EGFR-MAPK da parte di Western blot (Figura 3B). Nel complesso, questi dati evidenziano l'accuratezza del presente protocollo per determinare la risposta ai farmaci e distinguere tra modelli NSCLC PDO sensibili e resistenti. Sono necessarie ulteriori analisi dell'organoide TH116 EGFRL858R-positivo e dei campioni clinici disponibili per determinare possibili alterazioni associate alla resistenza.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig02.jpg"> Figura 2: Curva di risposta al trattamento di modelli organoidi NSCLC EGFR-mutanti all'escalation di osimertinib. (A) Risposta di Osimertinib nel modello organoide sensibile EGFRdel19-positivo al TH107 NSCLC. (B) Risposta di Osimertinib nel modello organoide resistente EGFRL858R-positivo TH116 NSCLC. I punti dati sono presentati come valori normalizzati che mostrano la deviazione standard media +/-, con una curva di regressione non lineare montata attraverso i dati. TH107, n = 6 repliche tecniche per punto dati. TH116, n = 4 repliche tecniche per punto dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig03.jpg"> Figura 3: Dati comparativi per la risposta al trattamento con osimertinib in una linea cellulare sensibile di NSCLC EGFR-mutante e modelli organoidi coltivati in diversi mezzi. (A) Risposta di Osimertinib nella linea cellulare sensibile EGFRdel19-positiva NSCLC PC9, determinata mediante saggio standard 2D-CTG. (B) Soppressione della segnalazione nelle cellule PC9 dopo due giorni di trattamento con osimertinib (2 μM). (C) Risposta di Osimertinib nella coltura sensibile del modello di modello di NSCLC EGFRL858R-positivo TH330 in terreni LGM e GM. (D) Risposta di Osimertinib nel modello organoide resistente AZ021 NSCLC in LGM e mezzi GM. La conferma della mutazione oncogenica EGFRL858R in AZ021 non è riuscita e può essere causa della mancanza di risposta a osimertinib. Per A e C-D, i punti dati sono presentati come valori normalizzati che mostrano la deviazione standard media +/-, con una curva di regressione non lineare montata attraverso i dati. PC9, n = 3 repliche tecniche per punto dati. TH330, n = 5 repliche tecniche per punto dati. AZ021, n = 6 repliche tecniche per punto dati. Un test di rango di Wilcoxon è stato eseguito su dati normalizzati per determinare la significatività statistica. Per TH330 (C), LGM vs GM, ** p = 0,0078. Per AZ021 (D), LGM vs. GM, ns p = 0,0742. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Risultati rappresentativi dell'analizzatore cellulare per il conteggio e la valutazione della vitalità di modelli organoidi EGFR-mutanti. TH107 e TH107BC si riferiscono a diversi modelli organoidi e A e B a repliche biologiche. Per ogni modello e replica biologica vengono contate tre repliche tecniche; tutti mostrano una redditività ≥95%. Un'immagine rappresentativa durante il conteggio delle cellule è presentata a destra, mostrando una robusta vitalità e la dissociazione a singola cellula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig1-R2.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Analisi di arricchimento del set genico (GSEA) utilizzando i dati di sequenziamento dell'RNA di massa ottenuti per gli organoidi NSCLC TH107 mutanti EGFR, confrontando il controllo non trattato (DMSO) e le cellule trattate con Osimertinib per 3 giorni (OSI_D3). (A-B) Dopo un trattamento mirato, le cellule sensibili subiranno l'arresto del ciclo cellulare G1 e cesseranno la proliferazione attiva. Poiché un'espressione dei geni del ciclo cellulare G2M è associata alla proliferazione attiva, si prevede un arricchimento nominale dell'espressione nel controllo non trattato (DMSO). Per i geni correlati all'apoptosi, è previsto un arricchimento nominale nelle cellule trattate (OSI_D3). Entrambi sono stati confermati nel modello organoide EGFR-mutante TH107 NSCLC trattato con Osimertinib: (A) GSEA per la firma dell'espressione G2M Hallmark (a sinistra) mostra l'arricchimento nelle cellule trattate con DMSO. Punteggio di arricchimento nominale (NES): +1,708, FDR &lt; 0,0001. (B) GSEA per la firma dell'espressione dell'apoptosi marcata (a destra) mostra l'arricchimento nelle cellule trattate con Osimertinib. NES: -1,075, FDR: ns, 0,3275. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig2-R2.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Figura 3 supplementare: Trattamento farmacologico combinatorio in modello organoide EGFR-mutante TH330 trattato con escalation di Osimertinib in presenza di un secondo inibitore additivo a concentrazione fissa. Le alterazioni associate alla resistenza nel NSCLC mutante EGFR, cioè l'attivazione di SRC e AXL26,27,28, sono state farmacologicamente mirate dal trattamento combinatorio con l'inibitore SRC Saracatinib (100 nM) o l'inibitore AXL R428 (500 nM), n = 6 repliche tecniche per punto dati. Entrambi i trattamenti combinatori hanno determinato un aumento della risposta al trattamento, con significato per l'associazione di Osimertinib con l'inibitore della CRS Saracatinib. La significatività statistica è stata valutata mediante il test di rango di Wilcoxon: Osimertinib versus Osimertinib + Saracatinib, *p = 0,0195; Osimertinib vs. Osimertinib + R428, ns, p = 0,2500. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig3-R2.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 1: Modifica della dimensione degli organoidi dalla semina (d0) a 7 giorni dopo il trattamento (d7). (A) Sviluppo della crescita dell'organoide NSCLC EGFRdel19-positivo TH107. (B) Sviluppo della crescita dell'organoide NSCLC POSITIVO AGFRL858R TH330. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>

Questo protocollo descrive una valutazione standardizzata della sensibilità dei farmaci agli inibitori di segnalazione mirati in modelli di organoidi derivati dal paziente NSCLC.

Profilazione della sensibilità alle terapie mirate negli organoidi derivati dal paziente NSCLC EGFR-Mutant

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Questo protocollo è significativo perché lavorare con successo con gli organoidi risiede nei dettagli e nel campo mancano protocolli chiari e dettagliati da cui altri possano costruire. Il più grande vantaggio di questa tecnica è la tempistica, i bassi requisiti di biomassa e la scalabilità a basso costo. Mentre è necessario molto più lavoro, questa tecnica potrebbe aiutare a migliorare il trattamento del cancro del polmone consentendo la sperimentazione di terapie individuali o combinate più precise che potrebbero essere tradotte clinicamente.La sfida più grande è con la gestione di BME2, ampiamente noto come Matrigel. Consiglio vivamente di praticare il pipettaggio e la manipolazione del BME2 liquido prima di introdurre i tuoi preziosi organoidi. Inizia dissociando la coltura di organoidi BME2 sommersi aspirando attentamente i media dalle piastre di coltura evitando di toccare la cultura.Tripsinizzare la coltura organoide BME2 sommersa con un enzima ricombinante adatto aggiungendo due millilitri di enzima ricombinante per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Rompere meccanicamente il BME2 pipettando ripetutamente su e giù e incubare le piastre a 37 gradi Celsius nell'incubatore di colture cellulari per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire la sospensione in un tubo centrifugo da 15 millilitri e centrifuga a 600 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.Aspirare accuratamente l'enzima surnatante ricombinante senza toccare il pellet organoide e risospesare il pellet organoide nel mezzo di crescita. Dopo aver aggiunto DNasi 1, incubare la sospensione per cinque minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 600 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Scartare accuratamente il mezzo senza toccare il pellet organoide e risospesciare il pellet in un terreno di crescita fresco.Preriscaldare una nuova piastra nera trasparente da 96 pozzetti a 37 gradi Celsius nell'incubatore di colture cellulari per 10 minuti, quindi preparare una sospensione cellulare in PBS per contare le cellule utilizzando un analizzatore cellulare. Dopo aver calcolato il volume di sospensione cellulare richiesto per l'esperimento, aliquotare le cellule dalla sospensione monocellulare e dal pellet verso il basso mediante centrifugazione, come dimostrato in precedenza. Una volta che il supporto viene scartato, mantenere le cellule sul ghiaccio per circa un minuto prima di riesegnare in BME2.Inclinare la piastra del pozzo 96 inferiore nero preriscaldato verso il corpo e seminare cinque microlitri di sospensione cellulare per pozzetto, seguita dalla semina delle cupole cellulari nella posizione a ore sei del pozzo. Riempire i pozzetti esterni sul bordo della piastra del pozzo 96 con PBS e seminare le cupole cellulari nei restanti pozzetti interni. Incubare le cupole cellulari appena seminate nella cappa a flusso laminare della coltura cellulare per cinque minuti senza spostare la piastra, quindi trasferire la piastra nell'incubatore di colture cellulari per l'incubazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Aggiungere con attenzione 100 microlitri di terreno di coltura per pozzetto a tutti i pozzetti contenenti organoidi e 100 microlitri di PBS ai pozzetti esterni sul bordo della piastra. Coltivare gli organoidi a 37 gradi Celsius per sette giorni, cambiando i mezzi secondo le indicazioni menzionate nel manoscritto di testo, ispezionando regolarmente la crescita degli organoidi al microscopio ottico. Preparare una diluizione seriale del farmaco in mezzi a basso fattore di crescita per osimertinib per il trattamento di organoidi del carcinoma polmonare non a piccole cellule mutanti EGFR.Includere un controllo negativo aggiungendo media a basso fattore di crescita e 0,1% DMSO. Ruotare la piastra organoide in senso orario di 180 gradi in modo tale che gli organoidi ora siano in posizione a ore 12 e aspirare accuratamente i mezzi di crescita utilizzando preferibilmente un apparato multicanale. Aggiungere 100 microlitri di controllo o soluzione farmacologica per pozzetto.Incubare nuovamente gli organoidi trattati a 37 gradi Celsius nell'incubatore di colture cellulari per cinque giorni. Iniziare a eseguire il test di sopravvivenza scongelando il reagente durante la notte a quattro gradi Celsius. Equilibrare il reagente a bagnomaria a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso e mescolare invertendo.Aggiungere 100 microlitri del reagente a ciascun pozzetto e mescolare accuratamente pipettando su e giù con la punta della pipetta posta nella posizione della cupola dell'organoide. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente al buio. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire circa 150 microlitri del lisato su una nuova piastra bianca opaca del fondo 96 e quindi incubare la piastra per altri 25 minuti a temperatura ambiente al buio.Registra la luminescenza utilizzando un lettore di piastre ELISA. Salvare i dati in un formato di tabella dati appropriato contenente tutte le letture e le registrazioni grezze del layout della piastra e dei farmaci utilizzati. Gli organoidi TH107 EGFR-mutanti positivi hanno mostrato sensibilità al trattamento con osimertinib con una concentrazione inibitoria semi-massima di 56 nanomolari mentre gli organoidi TH116 positivi a EGFR-mutanti erano resistenti al trattamento con osimertinib con una concentrazione inibitoria semi-massima superiore a un micromolare.La sensibilità delle cellule tumorali polmonari a piccole cellule TH107 EGFR-positive è stata accompagnata da significativi cambiamenti trascrizionali, tra cui una riduzione dell'espressione delle firme geniche associate al ciclo cellulare e un aumento dell'espressione della firma genica associata all'apoptosi. La risposta del sensibile TH330 positivo mutazione EGFR agli inibitori mirati è significativamente influenzata nei mezzi di crescita rispetto ai mezzi a basso fattore di crescita. I trattamenti combinatori in EGFR-mutante positivo TH330 hanno determinato un aumento della risposta al trattamento.Questo approccio migliora le strategie personalizzate per la terapia molecolare o i regimi di trattamento combinatorio. Quest'ultimo aiuta a indirizzare precocemente i meccanismi di tolleranza e resistenza ai farmaci per approfondire la risposta clinica e migliorare i risultati dei pazienti.

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Presentato qui è un protocollo per studiare le risposte farmacologiche negli organoidi epiteliali prostatici. Gli organiidi assomigliano molto alla biologia in vivo e riassumono la genetica dei pazienti, rendendoli interessanti sistemi modello. Gli organoidi della prostata possono essere stabiliti da prostati wildtype, modelli murini geneticamente ingegnerizzati, tessuto umano benigno e cancro avanzato alla prostata.

Le colture organoide della prostata come strumenti per tradurre genotipi e profili mutazionali in risposte farmacologiche

Viene descritto un metodo per creare organoidi utilizzando xenoinnesti derivati dal paziente (PDX) per lo screening in vitro, con conseguente coppie abbinate di modelli in vivo/in vitro. I tumori PDX sono stati raccolti/trasformati in piccoli pezzi meccanicamente o enzimaticamente, seguiti dal metodo clevers per far crescere organoidi tumorali che sono stati passaggi, crioconservati e caratterizzati contro il PDX originale.

Creazione di coppie di modelli in vivo/in vitro derivati dal paziente abbinate di organoidi derivati da PDX e PDX per la ricerca farmacologica sul cancro

È stato sviluppato un sistema di analisi ad alto rendimento in vitro altamente accurato per valutare i farmaci antitumorali utilizzando organoidi tumorali derivati dal paziente (DOP), simili ai tessuti tumorali ma inadatti per sistemi di analisi ad alta produttività in vitro con piastre a 96 pozzetti e 384 pozzetti.

Test in vitro ad alto rendimento utilizzando organoidi tumorali derivati dal paziente

Questo protocollo descrive un metodo semi-automatico per screening di farmaci organoidi a medio-alto rendimento e un software di analisi delle immagini automatizzato indipendente dal microscopio per quantificare e visualizzare risposte multiparametriche a singolo organoide per catturare l'eterogeneità intratumorale.

Screening multiparametrico di farmaci organoidi tumorali mediante imaging a cellule vive a campo ampio per analisi di massa e organoidi singoli

Questo protocollo descrive i passaggi chiave per generare e caratterizzare organoidi 3D orali-esofagei murini che rappresentano lesioni da carcinoma a cellule squamose normali, preneoplastiche e squamose indotte tramite carcinogenesi chimica.

Modellazione del carcinoma a cellule squamose orale-esofagea in organoidi 3D

L'aumento dei biomarcatori molecolari da testare per la gestione della cura del carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule (NS-NSCLC) ha spinto lo sviluppo di metodi di rilevamento molecolare rapidi e affidabili. Descriviamo un flusso di lavoro per la valutazione dell'alterazione genomica per i pazienti NS-NSCLC utilizzando un approccio di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ultraveloce.

Sequenziamento ultraveloce di nuova generazione basato su ampliconi nel carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule

Qui, delineiamo un protocollo completo per la generazione e l'utilizzo di organoidi di glioblastoma ingegnerizzati in laboratorio (LEGO) per studiare le dipendenze genotipo-fenotipo e selezionare potenziali farmaci per il trattamento del glioblastoma.

Coltura di organoidi di glioblastoma ingegnerizzata in laboratorio e screening farmacologico

Questo protocollo delinea un metodo semplificato per generare organoidi del carcinoma epatocellulare, applicare trattamenti farmacologici ed eseguire sequenziamento dell'RNA a singola cellula prima e dopo il trattamento per caratterizzare i cambiamenti trascrizionali associati al tratto.

Generazione e analisi trascriromica unicellulare degli organoidi del carcinoma epatocellulare dopo il trattamento farmacologico

Utilizzando i tumori derivati ​​da pazienti in un modello preclinico per via sottocutanea è un ottimo modo per studiare l'efficacia di nuove terapie, scoperta di biomarcatori predittivi, e percorsi resistenti ai farmaci. Questo modello, nel processo di sviluppo di un farmaco, è essenziale nel determinare il destino di molte nuove terapie anti-cancro prima indagine clinica.

Sviluppo e manutenzione di un tumore del paziente preclinici Derivato dello xenotrapianto modello per il Controllo delle Novel Anti-Cancer Therapies

Il seguente protocollo si concentra sulla creazione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato (STS). Questo modello potrebbe aiutarci a comprendere meglio le priorità bassa molecolare e il profilo farmacologico di queste malignità rare e potrebbe rappresentare un punto di partenza per ulteriori ricerche finalizzate a migliorare la gestione di STS.

Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato

Scopri la profilazione della sensibilità farmacologica negli organoidi derivati da pazienti con NSCLC EGFR-mutante usando osimertinib. Questo metodo supporta lo sviluppo di terapie personalizzate per il cancro al polmone.

Profilazione della sensibilità alle terapie mirate negli organoidi derivati dal paziente NSCLC EGFR-Mutant

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