L'estrazione di molecole di glicogeno epatico per la determinazione della struttura del glicogeno
8 febbraio 2022
È stata determinata una concentrazione ottimale di saccarosio per l'estrazione del glicogeno epatico utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio. L'aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti per inibire gli enzimi che degradano il glicogeno si è rivelata utile.
Questo protocollo consente l'estrazione delle molecole di glicogeno epatico in modo da preservarne la struttura e limitare la quantità di piccole particelle di glicogeno perse. Con precedenti ricerche che mostrano che il diabete altera la struttura del glicogeno, questo metodo potrebbe fornire nello studio del diabete e delle varie malattie da accumulo di glicogeno. Per estrarre il glicogeno dal fegato, iniziare trasferendo un grammo di tessuto epatico congelato in una provetta da 15 millilitri contenente sei millilitri di tampone di isolamento del glicogeno.
Mantenendo il ghiaccio, omogeneizzare il tessuto epatico utilizzando un omogeneizzatore per tessuti. Al termine, trasferire mezzo o tre millilitri di sospensione cellulare in una nuova provetta, seguita da ebollizione per 10 minuti. Tenere l'altra metà della sospensione su ghiaccio per estrarre le proteine associate contenenti glicogeno che non sono denaturate.
Per la determinazione del contenuto di glicogeno, rimuovere un'aliquota di otto microlitri da ciascuna provetta e mantenere la provetta sul ghiaccio. Dopo aver centrifugato la sospensione rimanente a 6.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, trasferire il surnatante in provette per ultracentrifugare a 3,6 volte 10 al quinto G e a quattro gradi Celsius per 90 minuti. Dopo aver scartato i surnatanti rimanenti, risospendere i pellet in 1,5 millilitri di tampone di isolamento del glicogeno.
Quindi, stratificare i campioni su 1,5 millilitri di soluzione di saccarosio al 30% in quattro provette da ultracentrifuga da un millilitro, seguita da centrifugazione come descritto in precedenza per due ore. Dopo aver scartato i surnatanti, risospendere i pellet in 200 microlitri di acqua deionizzata. Per far precipitare il glicogeno dalla sospensione cellulare, aggiungere 800 microlitri di etanolo assoluto alle sospensioni cellulari e mescolare bene.
Quindi, conservare le miscele a meno 20 gradi Celsius per almeno un'ora per consentire le precipitazioni. Una volta avvenuta la precipitazione, centrifugare i campioni a 6.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet di glicogeno in 200 microlitri di acqua deionizzata per ripetere tre volte il processo di precipitazione dell'etanolo. Dalla sospensione cellulare finale, rimuovere un'aliquota di otto microlitri da ciascuna provetta per la determinazione del contenuto di glicogeno.
Quindi, congelare i surnatanti rimanenti in azoto liquido e congelare per una notte. Il giorno successivo, conservare i campioni di glicogeno essiccati nel congelatore a meno 20 gradi Celsius. Lo studio ha analizzato la purezza, la resa grezza e la resa di glicogeno del campione di glicogeno essiccato estratto in diverse condizioni.
Non sono state riscontrate differenze significative nella resa grezza e nella resa di glicogeno tra i gruppi estratti con le varie condizioni. Al contrario, la purezza del glicogeno è stata significativamente influenzata dalle concentrazioni di saccarosio e dall'aggiunta di una fase di ebollizione. Il glicogeno con la massima purezza è stato estratto utilizzando la concentrazione di saccarosio al 30% e una fase di ebollizione di 10 minuti.
Il glicogeno è stato estratto dall'omogenato epatico con il 30% 50% o il 72,5% di saccarosio, bollito o non bollito, per valutare gli effetti delle varie condizioni sulla dimensione delle molecole nell'estratto finale. L'analisi della lunghezza della catena è stata eseguita su sei fegati sia bolliti che non bolliti, utilizzando concentrazioni di saccarosio del 30%, 50% e 72,5%. È stato calcolato il contenuto delle molecole di glicogeno o particelle beta con un raggio idrodinamico, RH, inferiore a 30 nanometri.
I campioni bolliti avevano valori medi di umidità relativa più bassi e un contenuto di particelle più elevato rispetto ai campioni non bolliti. Inoltre, concentrazioni più basse di saccarosio hanno portato a valori di RH più bassi e a un contenuto di particelle beta più elevato. L'introduzione di una fase di ebollizione ha anche portato a valori di RH max o massimi più bassi, mentre la concentrazione di saccarosio non ha avuto alcun effetto significativo.
Assicurarsi che il tessuto sia completamente omogeneizzato e che non rimangano pezzi di tessuto. Quindi, questa tecnica ci apre la strada per esplorare quali percorsi collegano le particelle beta più piccole per formare le particelle alfa più grandi.
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Panoramica
Questo protocollo consente l'estrazione del glicogeno epatico preservandone la struttura e minimizzando la perdita di piccole particelle di glicogeno. Il metodo include un passaggio di ebollizione per inibire gli enzimi degradanti il glicogeno, il che migliora il processo di estrazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare
- Biologia cellulare
- Metabolismo
Sfondo
- Il glicogeno è una molecola fondamentale per l'immagazzinamento dell'energia nel fegato.
- Il diabete può alterare la struttura del glicogeno, influenzando la salute metabolica.
- Le malattie da accumulo di glicogeno alterano il metabolismo del glicogeno.
- Metodi di estrazione efficaci sono essenziali per lo studio delle patologie correlate al glicogeno.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'estrazione del glicogeno epatico.
- Preservare l'integrità strutturale del glicogeno durante l'estrazione.
- Facilitare la ricerca sul diabete e sulle malattie da accumulo di glicogeno.
Metodi Utilizzati
- Trasferire il tessuto epatico congelato in un buffer per l'isolamento del glicogeno.
- Omogeneizzare il tessuto epatico mantenendolo sul ghiaccio.
- Far bollire per 10 minuti metà della sospensione cellulare.
- Mantenere l'altra metà sul ghiaccio per l'estrazione delle proteine non denaturate.
Risultati principali
- Il passaggio di ebollizione ha migliorato significativamente l'estrazione del glicogeno.
- Il metodo ha ridotto al minimo la perdita di particelle di glicogeno di piccole dimensioni.
- È stata osservata una struttura del glicogeno preservata dopo l'estrazione.
- Questo protocollo può essere utile nello studio delle malattie correlate al glicogeno.
Conclusioni
- La concentrazione ottimizzata di saccarosio migliora l'estrazione del glicogeno.
- Questo metodo è utile per lo studio dei disturbi metabolici.
- La ricerca futura potrà sfruttare questo protocollo per diverse applicazioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'estrazione affidabile del glicogeno epatico con struttura molecolare preservata è fondamentale per studi meccanicistici nella ricerca sulle malattie metaboliche e nella validazione degli obiettivi terapeutici. Questo protocollo consente una valutazione accurata della distribuzione dimensionale delle particelle di glicogeno, supportando una previsione affidabile nei flussi di lavoro della scoperta precoce e della ricerca traslazionale. La capacità del metodo di minimizzare la perdita di piccole particelle di glicogeno incide direttamente sulla fedeltà delle analisi biochimiche e strutturali successive, rilevanti per i percorsi di studio dei disturbi metabolici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi delle relazioni struttura-funzione del glicogeno in sistemi rilevanti per le malattie.
- Supporta la riduzione dei rischi biologici preservando la diversità nativa delle particelle di glicogeno.
- Facilita la validazione funzionale degli obiettivi per la modulazione delle vie metaboliche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce campioni standardizzati di glicogeno ad alta purezza per lo sviluppo di saggi quantitativi.
- Garantisce riproducibilità e confrontabilità tra diverse condizioni di estrazione e studi.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulla struttura e sul contenuto di glicogeno.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i profili di glicogeno estratti con modelli di malattia per studi traslazionali di biomarcatori.
- Mantiene la continuità dalla scoperta molecolare alla validazione preclinica di interventi metabolici.
- Riduce il rischio di risultati artefatti dovuti a danni molecolari indotti dall'estrazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di estrazione si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale di scoperta e la ricerca preclinica, sostenendo i flussi di lavoro dal test delle ipotesi all'identificazione dei composti promettenti nei programmi sulle malattie metaboliche.
- Biologia della scoperta: Preserva la struttura del glicogeno per la verifica di ipotesi meccanicistiche e l'analisi dei percorsi metabolici.
- Screening: Fornisce campioni di glicogeno rappresentativi pronti per saggi quantitativi su piattaforme di screening.
- Analisi: Consente misurazioni robuste della purezza, resa e distribuzione della dimensione delle particelle del glicogeno per studi comparativi.
- Ricerca traslazionale: Favorisce l'allineamento tra i risultati molecolari e i fenotipi rilevanti per le malattie nei modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità standardizzata di estrazione per applicazioni trasversali a programmi e team.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca metabolica.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro per l'estrazione del glicogeno.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale riducendo i rischi biologici in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di asset per le malattie metaboliche corretta in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di omogeneizzazione dei tessuti e di ultracentrifugazione.
- Necessita di accesso a centrifughe ad alta velocità e a infrastrutture analitiche per la valutazione di purezza e dimensione.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei parametri di estrazione per garantire la comparabilità dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi tipi di tessuto o specie.
- Un controllo accurato della concentrazione di saccarosio e dei passaggi di ebollizione è essenziale per preservare l'integrità molecolare.
