Raccolta, espansione e differenziazione di modelli primari di cellule epiteliali nasali umane per la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia

Descriviamo la raccolta di cellule staminali delle vie aeree dalla mucosa nasale. Queste cellule sono espanse e differenziate in un epitelio pseudostratificato in laboratorio. Questa è l'espansione e la differenziazione in vitro, che è simile alle nostre vie aeree in vivo, il che significa che ci sono cellule specializzate, come le cellule ciliate, presenti che possono essere utilizzate per quantificare la frequenza del battito delle ciglia.

Per consentire una quantificazione coerente e riproducibile della frequenza dei battiti delle ciglia tra individui diversi e in risposta a diversi farmaci, standardizziamo le condizioni di coltura e l'acquisizione di immagini. Le misurazioni della frequenza del battito delle ciglia sono utilizzate come strumenti clinici in malattie come la discinesia ciliare primaria. Speriamo di stabilire questo come marker clinico per la fibrosi cistica.

A dimostrare la procedura sono Katelin Allan e Laura Fawcett, studenti di dottorato del mio laboratorio, e la dottoressa Sharon Wong, postdoc del mio laboratorio. Inizia chiedendo al partecipante di respirare attraverso la bocca. Quindi, prendendo un pennello citologico nella mano dominante e appoggiando la quinta cifra sul mento del partecipante per ancorare la mano, inserire il pennello citologico nel passaggio nasale del partecipante con un angolo di 45 gradi rispetto al viso del partecipante e passarlo attraverso il meato nasale.

Dopo aver ruotato il pennello in posizione verticale, in modo che sia perpendicolare al viso del partecipante, far avanzare il pennello delicatamente, ma con fermezza, contro la parete laterale del naso sotto il turbinato inferiore fino a quando non si trova nella parte medio-posteriore del turbinato inferiore. Ruotare il pennello di 360 gradi fino a tre volte. Quindi rimuoverlo delicatamente, invertendo la manovra di inserimento, in modo che le cellule non vengano spostate dal pennello.

Posizionare il pennello nel tubo di raccolta preparato con il mezzo di raccolta delle cellule nasali e posizionare il tubo di raccolta sul ghiaccio. Dopo un leggero vortice per rimuovere le cellule dalla spazzola, trasferire il tubo di raccolta sul ghiaccio nell'armadio di biosicurezza. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire il mezzo dalla provetta di raccolta a una nuova provetta, lasciando dietro di sé i pennelli citologici.

Quindi centrifugare il campione. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di media cellulare di riprogrammazione condizionale. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, passare le cellule attraverso un setaccio cellulare posto sopra un tubo da 50 millilitri con un movimento circolare.

Per ottenere una sospensione a cella singola, raccogliere la sospensione dal fondo del tubo e passarla attraverso il setaccio più volte. Quindi scartare il setaccio cellulare. Per seminare le cellule epiteliali delle vie aeree sugli inserti di supporto permeabili preparati, mescolare bene le cellule senza creare bolle, assicurandosi che siano omogenee e in sospensione.

Quindi aggiungere 150 microlitri della sospensione cellulare sul lato apicale degli inserti di supporto permeabili preparati. Per differenziare le cellule epiteliali delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido, coltivarle in differenziazione o terreni ALI per due giorni. Quindi aspirare il fluido e aggiungere 750 microlitri di media ALI solo al compartimento basale per creare un'interfaccia aria-liquido.

Per seminare le cellule epiteliali delle vie aeree nelle cupole ECM, risospendere le cellule epiteliali delle vie aeree dissociate con il volume appropriato del 90% di ECM. Quindi tenendo la pipetta verticalmente con un angolo di 90 gradi il più vicino possibile al fondo del pozzo, erogare 50 microlitri della sospensione della cella ECM al centro del pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 20 minuti fino a quando l'ECM non si solidifica.

Mentre l'ECM si sta solidificando, riscaldare il mezzo di semina degli organoidi delle vie aeree, o AOSM, a temperatura ambiente per evitare che causi la ri-liquefazione e la disintegrazione della cupola ECM dopo l'aggiunta. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di AOSM riscaldato a ciascun pozzetto erogando lungo la parete del pozzo. Non pipettare i fluidi direttamente sulla cupola ECM.

Cambiare il supporto ogni due giorni per quattro-sette giorni. Per aspirare il fluido, inclinare la piastra con un angolo di 45 gradi e aspirare dal bordo inferiore del pozzo lontano dalla cupola ECM. Dopo quattro-sette giorni, iniziare la differenziazione degli organoidi aggiungendo 500 microlitri di mezzi di differenziazione organoide delle vie aeree riscaldati, o AODM, a ciascun pozzetto e cambiare i terreni ogni due giorni per sette giorni.

Posizionare la piastra di coltura contenente i modelli di cellule epiteliali delle vie aeree nell'inserto della piastra del microscopio e chiudere la camera ambientale del microscopio. Lasciare che il campione si bilanci nella camera del microscopio preriscaldata, riempita di anidride carbonica al 5% per 30 minuti, a 37 gradi Celsius. All'oculare del microscopio, concentrarsi sul modello cellulare.

Quindi, utilizzando il software di acquisizione, fare clic su L100 per commutare il percorso della luce sulla porta in cui è montata la telecamera. Fare clic sul pulsante verde Play per visualizzare il campo visivo del microscopio tramite il software. Controllare che le ciglia siano a fuoco e regolare se necessario.

Per acquisire immagini time-lapse dal menu, fare clic su Acquisisci, quindi su Fast TimeLapse. Nella finestra pop-up, selezionare una posizione di salvataggio e il nome del file, acquisire 1.000 frame. Per visualizzare in anteprima le ciglia nel campo visivo del microscopio, fare clic su Applica, seguito dal pulsante verde Play.

Se necessario, regolare la messa a fuoco Z. Quindi fare clic su Esegui ora per acquisire il TimeLapse veloce. Dopo aver installato il software e le caselle degli strumenti necessari, copiare gli script di analisi personalizzati appropriati e la cartella degli script di supporto nell'unità locale del computer.

Successivamente, sul software informatico, fare clic sulla scheda Home, seguita da Imposta percorso. Nella finestra pop-up, fai clic su Aggiungi con sottocartelle. Nel percorso di ricerca MATLAB, seleziona la cartella visualizzata.

Quindi fare clic su Salva e chiudi. Verificare che gli script di analisi siano collegati al software di elaborazione controllando che appaiano nel pannello di sinistra. Quindi, trasferire i file di immagine raw di esempio acquisiti sull'unità locale del computer.

Quindi fare clic sul BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m analisi script nel software informatico. Per eseguire lo script, fare clic sulla scheda Editor, seguita dal pulsante verde Riproduci.

Nella finestra del prompt visualizzata, selezionare i file di immagine raw da analizzare. Immettere il tempo di esposizione per il tempo di acquisizione per fotogramma. Quindi fare clic su OK. Eseguire GetFirstAmplitude.

m nella cartella che contiene i file AveSpectrum. Attendere che lo script restituisca FirstAmplitudeStacked. XLSX, che contiene la frequenza di ampiezza più elevata e rientra nell'intervallo fisiologico del battito delle ciglia epiteliali delle vie aeree.

Copiare i valori di frequenza da FirstAmplitudeStacked. XLSX e tracciarli utilizzando un software di analisi scientifica. Vengono presentati i risultati della frequenza del battito delle ciglia misurata nei modelli ALI delle cellule epiteliali delle vie aeree derivati da tre partecipanti con fibrosi cistica e tre partecipanti sani di controllo.

Il giorno 14 della differenziazione della cultura, erano presenti ciglia battenti. Dal giorno 14, giorno 21 della differenziazione della coltura, non è stato osservato un aumento statisticamente significativo della frequenza dei battiti delle ciglia tra le coorti. Il giorno 21 della differenziazione della coltura, la frequenza media dei battiti delle ciglia per i partecipanti sani di controllo era significativamente superiore a quella dei partecipanti con fibrosi cistica.

Inoltre, quando la frequenza del battito delle ciglia è stata ripresa negli stessi modelli cellulari dopo la rimozione del muco, c'è stato un aumento statisticamente significativo della frequenza del battito delle ciglia quando il muco è stato rimosso nei modelli ALI di individui sani e quelli con fibrosi cistica. L'ambiente di imaging deve essere strettamente regolato, poiché la funzione delle ciglia è estremamente suscettibile ai cambiamenti nei fattori ambientali. Questa piattaforma ha il potenziale per essere stabilita per lo screening farmacologico specifico del paziente per essere in grado di identificare i farmaci che modulano la funzione CFTR.