Name: Generazione di organoidi cardiaci umani auto-assemblanti derivati da cellule staminali pluripotenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri come generare organoidi cardiaci umani auto-assemblanti da cellule staminali pluripotenti. Questo protocollo riproducibile produce tessuti cardiaci 3D complessi per modellare malattie cardiovascolari e screening farmacologico.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute del National Institutes of Health con i numeri di premio K01HL135464 e R01HL151505 e dall'American Heart Association con il numero di premio 19IPLOI34660342. Desideriamo ringraziare il MSU Advanced Microscopy Core e il Dr. William Jackson presso il Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia della MSU per l'accesso ai microscopi confocali, al Nucleo di Microscopia QI e al Nucleo di Genomica MSU per i servizi di sequenziamento. Desideriamo anche ringraziare tutti i membri dell'Aguirre Lab per i loro preziosi commenti e consigli.

1. Coltura e manutenzione hPSC
NOTA: Le PSC indotte dall'uomo (hiPSC) o le cellule staminali embrionali umane (hESC) devono essere coltivate per almeno 2 passaggi consecutivi dopo lo scongelamento prima di essere utilizzate per generare EB per differenziazione o ulteriore crioconservazione. Le hPSC sono coltivate in terreno PSC (vedi tabella dei materiali) su piastre di coltura a 6 pozzetti rivestite con membrana basale (BM-ECM). Quando si eseguono cambiamenti del mezzo sulle hPSC in piastre a 6 pozzetti, aggiungere il mezzo direttamente sul lato interno del pozzo piuttosto che direttamente sopra le cellule per evitare il distacco o lo stress cellulare indesiderato. Gli utenti dovrebbero diffidare dei supporti PSC pre-riscaldamento che non dovrebbero essere riscaldati a 37 ° C; tutti i supporti PSC utilizzati in questo protocollo erano termostabili.
<ol><li>Per rivestire le piastre del pozzo con il BM-ECM, scongelare un'aliquota del BM-ECM (conservato a -20 °C secondo le istruzioni del produttore) sul ghiaccio e mescolare 0,5 mg del BM-ECM con 12 ml di mezzo eagle modificato (DMEM)/F12 di Dulbecco freddo (conservato a 4 °C). Distribuire 2 mL della miscela DMEM/F12-BM-ECM su ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per almeno 2 ore.</li>
	<li>Per scongelare le cellule, in primo luogo, scongelare il crioviale hPSC in un tallone a 37 ° C o a bagnomaria per 1-2 minuti fino a quando non è visibile solo una piccola quantità di ghiaccio. Trasferire le cellule scongelate in un tubo di centrifuga e aggiungere lentamente 8-9 mL del mezzo PSC integrato con 2 μM dell'inibitore ROCK, tiazovivina (Thiaz), e centrifugare a 300 × g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospescere il pellet cellulare nel mezzo PSC integrato con 2 μM di Thiaz. Distribuire le cellule nel terreno di coltura in 1-2 pozzetti a seconda della concentrazione e della coltura crioviale a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore prima di cambiare il mezzo PSC.</li>
	<li>Cambiare il mezzo sulle celle a intervalli di 48 ore. Eseguire lavaggi e cambi di mezzo utilizzando dmEM/F12 (1 mL/pozzetto) e il mezzo PSC (2 ml/pozzetto), rispettivamente. NOTA: i lavaggi aiutano a rimuovere i rifiuti cellulari e i detriti, mentre i cambiamenti dei mezzi freschi forniscono alle cellule una rinnovata fonte di sostanze nutritive.</li>
	<li>Passare le cellule al subunondanza (60-80% confluente) aspirando il mezzo, quindi lavando ciascun pozzetto con 1 mL di 1x soluzione tamponata con fosfato di Dulbecco (senza calcio, senza magnesio; DPBS). Aspirare il DPBS e aggiungere 1 mL del reagente di dissociazione per le hPSC (vedere la tabella dei materiali), seguito dall'aspirazione di tutti tranne un film sottile del reagente dopo 10 s.</li>
	<li>Incubare per 2-5 minuti con il film sottile del reagente di dissociazione per hPSC fino a quando non si formano spazi tra le cellule. NOTA: il tempo per interrompere la dissociazione dipende dalla linea cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL del mezzo PSC integrato con 2 μM di Thiaz (PSC medium + Thiaz) al pozzo e picchiettare delicatamente la piastra per indurre il distacco cellulare. Pipettare le cellule staccate nel mezzo 1-2 volte per rompere eventuali colonie di grandi dimensioni e risospese le cellule in mezzo PSC + Thiaz in un rapporto pozzo 1: 6 (cellule da 1 pozzo risospese in 12 ml di terreno di coltura). Riplazionare le cellule su pozzetti rivestiti di BM-ECM.</li>
</ol>2. Generazione di organoidi cardiaci umani autoassemblanti 3D
<ol><li>Formazione del corpo embrionale (EB): NOTA: È imperativo limitare le cellule differenziate osservabili prima della formazione del corpo embrioide. Due o tre pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con una confluenza del 60-80% produrranno abbastanza cellule per una singola piastra di organoidi da 96 pozzetti. Tutti i fluidi devono essere aliquotati e riscaldati a 37 °C a bagnomaria prima di qualsiasi cambiamento del mezzo per ridurre al minimo lo shock termico degli EB o degli organoidi (questo non include i reagenti di dissociazione cellulare). Vedere la Figura 1A,B.<ol>
<li>Giorno -2<ol>
<li>Per creare EB, il giorno -2, lavare hPSC sub-confluenti (60-80% confluenti) con DPBS per almeno 10 s per lavare eventuali detriti cellulari e aspirare il DPBS.</li>
			<li>Per staccare le cellule e rilasciarle in uno stato a cella singola, aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare a temperatura ambiente (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto per 3-6 minuti. Picchiettare delicatamente la piastra ~ 5 volte al minuto per indurre il distacco durante il controllo al microscopio. Aggiungere 1 mL di PSC medium+Thiaz per fermare la reazione.</li>
			<li>Per raccogliere le cellule e rompere eventuali aggregati rimanenti, pipettare il fluido su e giù nel pozzo 2-3 volte per generare una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione monocellulare in un tubo centrifuga e ruotare per 5 minuti a 300 × g.</li>
			<li>Per ottenere la concentrazione cellulare desiderata, scartare il surnatante e risospese le cellule in 1 mL di PSC medio + Thiaz. Contare le cellule usando un contatore cellulare o un emocitometro e diluire le cellule in mezzo PSC + Thiaz ad una concentrazione di 100.000 cellule / mL.</li>
			<li>Per distribuire le celle per la formazione di EB, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 μL (10.000 celle) a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con attacco ultra-basso a fondo tondo. Centrifugare la piastra a 100 × g per 3 min e incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Giorno -1<ol>
<li>Rimuovere con cautela 50 μL di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 200 μL di terreno PSC fresco riscaldato a 37 °C per ottenere un volume finale di 250 μL per pozzetto. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C, 5% CO2. NOTA: Rimuovere e aggiungere il mezzo con attenzione sul lato del pozzetto per evitare di disturbare gli EB nella parte inferiore del pozzo. A causa della natura delicata degli EB e della coltura di sospensione, è necessario lasciare un piccolo volume di liquido in ciascun pozzetto quando si cambia il mezzo per evitare di disturbare gli EB.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Differenziazione dell'organoide del cuore umano (hHO): NOTA: tutti i supporti devono essere riscaldati a 37 °C a bagnomaria prima di qualsiasi cambio di supporto. Rimuovere e aggiungere il mezzo con attenzione sul lato del pozzetto per evitare di disturbare gli organoidi in via di sviluppo sul fondo del pozzo. I lavaggi non sono necessari tra i cambiamenti dei media per ridurre al minimo l'agitazione e consentire la graduale rimozione di inibitori e fattori di crescita. RPMI con supplemento B-27 al 2% (Table of Materials) è stato utilizzato in tutto il protocollo di differenziazione. Il supplemento di B-27 contiene insulina se non specificato (senza insulina nei giorni 0-5). Vedere la Figura 1C.<ol>
<li>Giorno 0<ol>
<li>Per avviare la differenziazione verso un lignaggio mesodermico, rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto (~2/3 del volume totale del pozzo) e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 contenente integratore B-27 insulino-libero, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng/mL proteina morfogenetica ossea 4 (BMP4) e 1,5 ng/mL Activin A per una concentrazione finale del pozzo di 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/mL BMP4 e 1 ng/mL Activin A. Incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Giorno 1<ol>
<li>Rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco con integratore B-27 senza insulina. Incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Giorno 2<ol>
<li>Per indurre la specifica del mesoderma cardiaco, rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 contenente integratore B-27 senza insulina e 3 μM Wnt-C59 per una concentrazione finale del pozzo di 2 μM Wnt-C59. Incubare per 48 ore a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Giorno 4<ol>
<li>Rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco con integratore B-27 senza insulina. Incubare per 48 ore a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Giorno 6<ol>
<li>Rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 con supplemento B-27. Incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Giorno 7<ol>
<li>Per indurre la differenziazione proepiardiale, rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco contenente integratore B-27 e 3 μM CHIR99021 per una concentrazione finale del pozzo di 2 μM CHIR99021. Incubare per 1 ora a 37 °C, 5% CO2.</li>
			<li>Rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco contenente supplemento B-27. Incubare per 48 ore a 37 °C, 5% CO2. NOTA: Si consiglia maggiore cautela in questo secondo cambio medio il giorno 7 poiché gli organoidi sono più inclini al movimento a causa dei cambiamenti dei media.</li>
			<li>Dal giorno 7 in poi fino alla raccolta o al trasferimento per analisi o sperimentazioni, eseguire cambi di mezzo ogni 48 ore rimuovendo 166 μL di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco contenente supplemento B-27. NOTA: gli organoidi sono pronti per l'analisi e la sperimentazione al giorno 15, a meno che le fasi di sviluppo precedenti non siano di interesse. Possono essere coltivati oltre il giorno 15 per esperimenti di coltura o maturazione a lungo termine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi organoide
<ol><li>Trasferimento di organoidi interi (vivi o fissi) NOTA: per il trasferimento di organoidi vivi, assicurarsi che le punte delle pipette utilizzate siano sterili.<ol>
<li>Tagliare la punta di una punta della pipetta P200 a 5-10 mm dall'apertura della punta, con conseguente ampia apertura di ~ 2-3 mm di diametro.</li>
		<li>Inserire la punta direttamente nel pozzetto a fondo tondo contenente l'organoide in modo che la pipetta sia completamente verticale (perpendicolare alla piastra). Assicurarsi che lo stantuffo della pipetta sia già premuto completamente prima di inserire la punta nel mezzo.</li>
		<li>Rilasciare lentamente lo stantuffo della pipetta, occupando abbastanza mezzo (100-200 μL) per raccogliere l'organoide.</li>
		<li>Trasferire l'organoide in mezzo alla destinazione target (ad esempio, per il fissaggio, l'imaging dal vivo, la registrazione elettrofisiologica, la nuova coltura di piastre).</li>
	</ol></li>
	<li>Organoidi di fissaggio NOTA: il fissaggio e la colorazione degli organoidi possono essere eseguiti sia nella piastra di coltura a 96 pozzetti che nei tubi di microcentrifuga. La paraformaldeide (PFA) deve essere maneggiata solo in una cappa aspirante.<ol>
<li>Per la fissazione in tubi microcentrifuga, trasferire organoidi vivi in tubi separati con 1-8 organoidi per tubo. NOTA: Non superare gli 8 organoidi per tubo.</li>
		<li>Rimuovere con cura e scartare il più possibile il mezzo dal tubo senza toccare gli organoidi.</li>
		<li>Aggiungere il 4% di PFA a ciascun tubo o pozzetto (300-400 μL per tubo di microcentrifuga e 100-200 μL per pozzetto di una piastra da 96 pozzetti). Incubare a temperatura ambiente per 30-45 min. NOTA: i tempi di incubazione superiori a 1 ora possono richiedere passaggi di recupero dell'antigene e non sono raccomandati.</li>
		<li>Scartare in modo sicuro il PFA senza disturbare gli organoidi. Eseguire 3 lavaggi con DPBS integrato con 1,5 g/L di glicina (DPBS/Gly), utilizzando lo stesso volume utilizzato per il PFA al 4%, aspettando 5 minuti tra un lavaggio e l'altro. Rimuovere DPBS/Gly e procedere all'immunocolorazione o ad altre analisi o aggiungere DPBS e conservare a 4 °C per un uso futuro fino a 2 settimane. NOTA: la conservazione di organoidi fissi per più di 2 settimane può causare degradazione e contaminazione dei tessuti e non è raccomandata.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione immunofluorescente a tutto monte<ol>
<li>Aggiungere 100 μL di soluzione di bloccante/permeabilizzazione (10% di siero d'asino normale + 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) + 0,5% di Triton X-100 in 1x DPBS) a ciascun pozzetto o tubo contenente gli organoidi fissi. Incubare a temperatura ambiente durante la notte su uno shaker. NOTA: Non superare gli 8 organoidi per tubo.</li>
		<li>Rimuovere con cura e scartare il più possibile la soluzione bloccante senza toccare gli organoidi. Esegui 3 lavaggi con DPBS, aspettando 5 minuti tra un lavaggio e l'altro.</li>
		<li>Preparare la soluzione anticorpale primaria (1% di siero d'asino normale + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) con gli anticorpi primari desiderati alle concentrazioni raccomandate. Incubare a 4 °C per 24 ore su uno shaker.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione ed eliminare il più possibile la soluzione anticorpale senza toccare gli organoidi. Esegui 3 lavaggi con DPBS, aspettando 5 minuti tra un lavaggio e l'altro.</li>
		<li>Preparare una soluzione anticorpale secondaria (1% di siero d'asino normale + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) con gli anticorpi secondari desiderati alle concentrazioni raccomandate. Se gli anticorpi sono marcati in modo fluorescente, incubare a 4 °C al buio (ad esempio, coperto da un foglio di alluminio) per 24 ore su uno shaker.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione ed eliminare il più possibile la soluzione anticorpale senza toccare gli organoidi. Esegui 3 lavaggi con DPBS, aspettando 5 minuti tra un lavaggio e l'altro.</li>
		<li>Preparare vetrini con perline (90-300 μm di diametro) montate in un mezzo di montaggio (vedi tabella dei materiali) vicino ai bordi della slitta dove verrà posizionato il coperchio con gli organoidi. NOTA: Si consiglia di lasciare asciugare il mezzo di montaggio attorno alle perline prima di procedere; questo impedirà alle perline di muoversi. Vedere la Figura 2.</li>
		<li>Trasferire gli organoidi colorati utilizzando una punta di pipetta tagliata sul vetrino, tra le perline, assicurando la spaziatura per evitare il contatto tra gli organoidi una volta sul vetrino. Utilizzare l'angolo di una salvietta da laboratorio arrotolata per rimuovere con cura il liquido in eccesso intorno all'organoide.</li>
		<li>Coprire gli organoidi con un mezzo di compensazione del fruttosio-glicerolo (la soluzione di compensazione del fruttosio-glicerolo è al 60% (vol/vol) e 2,5 M di fruttosio)37 utilizzando 120-150 μL del mezzo di montaggio-clearing per vetrino. NOTA: si consiglia di utilizzare una punta della pipetta tagliata quando si lavora con il mezzo di montaggio-clearing in quanto è molto viscoso.</li>
		<li>Passare il coperchio sopra la slitta con gli organoidi coperti con la soluzione di montaggio-clearing e premere lentamente il coperchio sopra la diapositiva, assicurandosi che gli organoidi si trovino tra le perline montate.</li>
		<li>Sigillare il perimetro del coverslip sulla diapositiva usando lo smalto per unghie top coat. Lasciare asciugare la diapositiva al buio a temperatura ambiente per 1 ora. Conservare a 4 °C al buio per la conservazione a lungo termine.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging transitorio del calcio in organoidi cardiaci vivi NOTA: Secondo le istruzioni del produttore, Fluo4-AM è stato ricostituito in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di soluzione madre di 0,5 mM. Fluo4-AM è stato aggiunto direttamente al pozzetto organoide nella piastra a 96 pozzetti.<ol>
<li>Eseguire 2 lavaggi sugli organoidi utilizzando il mezzo RPMI 1640.<ol>
<li>Rimuovere 166 μL del mezzo esaurito dal pozzo.</li>
			<li>Aggiungere 166 μL di mezzo RPMI 1640 riscaldato, rimuovere 166 μL di mezzo e aggiungere 166 μL di mezzo RPMI 1640 fresco. NOTA: I lavaggi vengono eseguiti per rimuovere il materiale di scarto e i detriti cellulari. Due terzi del mezzo vengono rimossi dai pozzetti durante i lavaggi per evitare di disturbare gli organoidi sul fondo del pozzo prima del saggio funzionale.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere Fluo4-AM medium agli organoidi.<ol>
<li>Aggiungere Fluo4-AM ricostituito in DMSO a RPMI 1640 contenente supplemento B-27 per preparare una soluzione da 1,5 μM.</li>
			<li>Rimuovere 166 μL di mezzo dal pozzo.</li>
			<li>Aggiungere 166 μL di 1,5 μM Fluo4-AM in RPMI 1640 contenente integratore B-27 per una concentrazione finale del pozzo di 1 μM. Incubare a 37 °C, 5% CO2 per 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire 2 lavaggi come nel passaggio 3.4.1.</li>
		<li>Aggiungere 166 μL di RPMI 1640 contenente supplemento B-27 al pozzo.</li>
		<li>Utilizzando una punta tagliata di una punta per pipetta P200, trasferire l'organoide in una capsula di Petri con fondo di vetro (ad esempio, vetro di copertura a 8 pozzetti con vetro di copertura ad alte prestazioni #1.5) con 100-200 μL di mezzo. NOTA: Vedere paragrafo 3.1 sul trasferimento di organoidi interi.</li>
		<li>Immagina che gli organoidi vivano al microscopio con una camera a temperatura e CO2 controllata a 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Registra diversi video di 10-20 s in varie posizioni attraverso l'organoide, mostrando l'aumento e la diminuzione dei livelli di intensità di fluorescenza quando il calcio entra ed esce dalle cellule. NOTA: per le registrazioni ad alta risoluzione, si consiglia di registrare a una velocità di 10 fps o superiore; Si consigliano 50 fps.</li>
		<li>Analizza i video utilizzando un software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ) selezionando le regioni di interesse e misurando i livelli di intensità nel tempo.</li>
		<li>Normalizza le registrazioni di intensità usando ΔF/F0 rispetto al tempo in millisecondi e traccia.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+drug-induced+cardiotoxicity+using+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cardiac+cellular+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).</li>
<li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+genome+reorganization+during+human+cardiogenesis+reveal+an+RBM20-dependent+splicing+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.</a> Nature Communications. 10 (1), 1538(2019).</li>
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<li>Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Organoids+and+Engineered+Heart+Tissues%3A+Novel+Tools+for+Modeling+Human+Cardiac+Biology+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease.</a> Biomolecules. 1277, (2021).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

I recenti progressi nei cardiomiociti derivati da cellule staminali umane e in altre cellule di origine cardiaca sono stati utilizzati per modellare lo sviluppo del cuore umano22,24,25 e la malattia26,27,28 e come strumenti per lo screening di terapie29,30 e agenti <sup class="...

I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono il tipo più comune di difetto congenito nell'uomo e colpiscono circa l'1% di tutti i nati vivi1,2,3. Nella maggior parte dei casi, le ragioni dei CHD rimangono sconosciute. La capacità di creare modelli di cuore umano in laboratorio che assomigliano molto al cuore umano in via di sviluppo costituisce un significativo passo avanti per studiare direttamente le cause alla base dei CHD negli esseri umani piuttosto che in modelli animali surrogati.
L'epitome dei modelli tissutali cresciuti in laboratorio sono gli organoidi, costrutti cellulari 3D che assomigliano a un organo di interesse per la composizione cellulare e la funzione fisiologica. Gli organoidi sono spesso derivati da cellule staminali o cellule progenitrici e sono stati utilizzati con successo per modellare molti organi come il cervello4,5, il rene6,7, l'intestino8,9, il polmone10,11, il fegato12,13 e il pancreas14,15 , solo per citarne alcuni. Recenti studi sono emersi dimostrando la fattibilità della creazione di organoidi cardiaci auto-assemblanti per studiare lo sviluppo del cuore in vitro. Questi modelli includono l'utilizzo di cellule staminali embrionali di topo (mESC) per modellare lo sviluppo cardiaco precoce16,17 fino alla specifica atrioventricolare18 e cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) per generare organoidi cardiaco-endodermici multi-strato germinale19 e cardioidi camerati20 con composizione cellulare altamente complessa.
Questo documento presenta un nuovo protocollo di modulazione WNT in 3 fasi per generare hHO altamente complessi in modo efficiente ed economico. Gli organoidi sono generati in piastre a 96 pozzetti, risultando in un sistema scalabile e ad alta produttività che può essere facilmente automatizzato. Questo metodo si basa sulla creazione di aggregati hPSC e sull'innesco di fasi di sviluppo della cardiogenesi, tra cui la formazione di mesoderma e mesoderma cardiaco, la specifica del primo e del secondo campo cardiaco, la formazione di organi proepiardici e la specifica atrioventricolare. Dopo 15 giorni di differenziazione, gli hHO contengono tutte le principali linee cellulari presenti nel cuore, camere interne ben definite, camere atriali e ventricolari e una rete vascolare in tutto l'organoide. Questo sistema organoide cardiaco altamente sofisticato e riproducibile è in grado di studiare analisi strutturali, funzionali, molecolari e trascrittomiche nello studio dello sviluppo cardiaco e delle malattie e dello screening farmacologico.

<table><tbody><tr><td>Anticorpi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Asino anti-topo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Asino anti-coniglio</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Asino anti-topo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21203</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Asino anti-coniglio</td><td>Invitrogen</td><td>A-21207</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Asino anti-capra</td><td>Invitrogen</td><td>A32849</td><td>1:200</td></tr><tr><td>HAND1</td><td>Abcam</td><td>ab196622</td><td>Coniglio; 1:200</td></tr><tr><td>HAND2</td><td>Abcam</td><td>ab200040</td><td>Coniglio; 1:200</td></tr><tr><td>NFAT2</td><td>Abcam</td><td>ab25916</td><td>Coniglio; 1:100</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>DSHB</td><td>P2B1</td><td>Coniglio; 1:50</td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td>Topo; 1:200</td></tr><tr><td>THY1</td><td>Abcam</td><td>ab133350</td><td>Coniglio; 1:200</td></tr><tr><td>TJP1</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-19090</td><td>Capra; 1:250</td></tr><tr><td>VIM</td><td>Abcam</td><td>ab11256</td><td>Capra; 1:250</td></tr><tr><td>WT1</td><td>Abcam</td><td>ab89901</td><td>Coniglio; 1:200</td></tr><tr><td>Terreni e reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>NC9464543</td><td>reagente per dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338AC010</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B-27 (Meno insulina)</td><td>Integratore Gibco</td><td>A1895601</td><td>per colture cellulari senza insulina</td></tr><tr><td>Integratore B-27 Integratore</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Integratore per colture cellulari</td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Bioworld</td><td>50253966</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck</td><td>442310</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-Fruttosio</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>terreno per cellule staminali pluripotenti (PSC) contenente l'1% penicillina-streptomicina</td></tr><tr><td>Fluo4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Millipore Sigma</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>Corning</td><td>CB40230</td><td>Matrice extracellulare della membrana basale (BM-ECM)</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Millipore Sigma</td><td>S30-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>MP Biomedicals</td><td>IC15014601</td><td>Polvere disciolta in tampone PBS - utilizzare al 4%</td></tr> <tr><td>di penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>soluzione tampone fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>soluzione tampone fosfato (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>73155</td><td>90 & micro; m</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>NC0729236</td><td>reagente di dissociazione per hPSC</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1045</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione blu di tripano</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Terreno di montaggio</td><td>Vector Laboratories</td><td>H170010</td><td></td></tr><tr><td>WNT-C59</td><td>Selleck</td><td>NC0710557</td><td></td></tr><tr><td>altre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02682002</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon da 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1495970C</td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche da 2 mL</td><td>Corning</td><td>13-700-500</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di reagenti da 50 mL Fisherbrand</td><td></td><td>13681502</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a fondo piatto a 6 pozzetti Corning</td><td></td><td>0720083</td><td></td></tr><tr><td>Vetro con coperchio a camera a 8 pozzetti con vetro di copertura ad alte prestazioni #1,5</td><td>Cellvis</td><td>C8-1,5H-N Micropiastre</td><td></td></tr><tr><td>trasparenti a 96 pozzetti con attacco ultra basso</td><td>Costar</td><td>07201680</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image software di elaborazione</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>06-666</td><td>salviette da laboratorio</td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>24 x 50 mm N. 1.5</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Cell Counter</td><td>Orflo Technologies</td><td>&nbsp; MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta per conteggio cellule Moxi Z &ndash; Tipo M</td><td>Orflo&nbsp; Tecnologie</td><td>MXC001</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanale</td><td>Fisherbrand</td><td>FBE1200300</td><td>30-300 &; L</td></tr><tr><td>Olympus cellVivo</td><td>Olympus</td><td></td><td>per Caclium Imaging, analisi con Imagej</td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 Centrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004261</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Mixer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-687-717</td><td></td></tr><tr><td>Top Coat Nail Varish</td><td>Seche Vite</td><td></td><td>Può acquistare da qualsiasi supermercato</td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi cardiaci umani auto-assemblanti derivati da cellule staminali pluripotenti

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

La capacità di studiare lo sviluppo cardiaco umano in salute e malattia è fortemente limitata dalla capacità di modellare la complessità del cuore umano in vitro. Lo sviluppo di piattaforme simili a organi più efficienti in grado di modellare fenotipi complessi in vivo , come organoidi e organi su chip, migliorerà la capacità di studiare lo sviluppo e le malattie del cuore umano. Questo documento descrive un protocollo per generare organoidi cardiaci umani (hHO) altamente complessi mediante auto-organizzazione utilizzando cellule staminali pluripotenti umane e attivazione graduale del percorso di sviluppo utilizzando inibitori di piccole molecole. I corpi embrioidi (EB) sono generati in una piastra a 96 pozzetti con fondo tondo e pozzi di attacco ultra-bassi, facilitando la coltura in sospensione di costrutti individualizzati.
Gli EB subiscono la differenziazione in hHO mediante una strategia di modulazione del segnale Wnt in tre fasi, che prevede un'attivazione iniziale della via Wnt per indurre il destino del mesoderma cardiaco, una seconda fase di inibizione Wnt per creare linee cardiache definitive e una terza fase di attivazione Wnt per indurre tessuti d'organo proepiardici. Questi passaggi, eseguiti in un formato a 96 pozzetti, sono altamente efficienti, riproducibili e producono grandi quantità di organoidi per corsa. L'analisi mediante imaging a immunofluorescenza dal giorno 3 al giorno 11 della differenziazione rivela le specifiche del primo e del secondo campo cardiaco e tessuti altamente complessi all'interno degli hHO al giorno 15, incluso il tessuto miocardico con regioni di cardiomiociti atriali e ventricolari, nonché camere interne rivestite di tessuto endocardico. Gli organoidi presentano anche un'intricata rete vascolare in tutta la struttura e un rivestimento esterno di tessuto epicardico. Da un punto di vista funzionale, gli hHO battono in modo robusto e presentano una normale attività del calcio come determinato dall'imaging dal vivo Fluo-4. Nel complesso, questo protocollo costituisce una solida piattaforma per studi in vitro in tessuti cardiaci simili a organi umani.

Per ottenere hHO auto-organizzante in vitro, abbiamo modificato e combinato i protocolli di differenziazione precedentemente descritti per la differenziazione monostrato 2D di cardiomiociti21 e cellule epicardiche22 utilizzando modulatori di pathway Wnt e per organoidi precardiac 3D16 utilizzando i fattori di crescita BMP4 e Activin A. Utilizzando il protocollo di differenziazione EB e hHO a piastre a 96 pozzetti descritto qui e mostrato nel...

Qui, descriviamo un protocollo per creare organoidi cardiaci umani rilevanti per lo sviluppo (hHO) in modo efficiente utilizzando cellule staminali pluripotenti umane mediante auto-organizzazione. Il protocollo si basa sull'attivazione sequenziale dei segnali di sviluppo e produce tessuti cardiaci umani altamente complessi e funzionalmente rilevanti.

Generazione di organoidi cardiaci umani auto-assemblanti derivati da cellule staminali pluripotenti

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Questo protocollo ci consente di creare una complessa struttura 3D che ricorda da vicino il cuore umano in via di sviluppo in un modo semplice ed economico, che è riproducibile attraverso le linee cellulari. Consiste in un unico protocollo con tre fasi di differenziazione, che dà origine a tutti i tipi di cellule del cuore, comprese le camere e una rete vascolare. Questa tecnica ci consente di modellare una vasta gamma di malattie cardiovascolari umane e di selezionare trattamenti farmacologici efficaci.Grazie alla natura ad alta produttività del suo design. Questo metodo è utile per studiare il cuore umano in via di sviluppo e le malattie comunemente associate ad esso. Uno di questi sono difetti cardiaci congeniti.Questo protocollo richiede competenze di base per la coltura cellulare. Raccomandiamo un pipettaggio attento e delicato e una manipolazione delicata degli organoidi. Inizia creando corpi embrioidi o EB due giorni prima della differenziazione.Lavare HPSC subconfluenti con DBPS per almeno 10 secondi. Quindi aspirare il DPBS. Aggiungere un millilitro di ACUTA a temperatura ambiente e picchiettare delicatamente la piastra circa cinque volte al minuto per tre-cinque minuti per indurre il distacco, controllando al microscopio.Quindi aggiungere un millilitro di mezzo PSC e Thias Avin o Thias per fermare la reazione. Pipettare il mezzo su e giù nel pozzo, due o tre volte per generare una singola sospensione cellulare e raccogliere le cellule. Quindi trasferire la sospensione a cella singola in un tubo centrifuga e girare per cinque minuti a 300 volte G.Aspirare il surnatante e ri-spendere le cellule in un millilitro di mezzo PSC e Thias.Diluire le cellule in DPBS. Contare le cellule usando un contatore cellulare o un cistometro emodale e diluire le cellule in mezzo PSC con Thias ad una concentrazione di 100.000 cellule per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di sospensione di celle diluite a ciascun pozzetto di una piastra a fondo rotondo ultra basso da 96 pozzetti.Centrifugare la piastra a 100 volte G per tre minuti e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore rimuovere con cura 50 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 200 cucciolate di terreno PSC fresco, caldo a 37 gradi Celsius per un volume di 250 microlitri per pozzetto. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Rimuovere 166 microlitri o due terzi del mezzo da un lato di ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 contenenti integratore B27 senza insulina, sei 990211 di allegria micromolare, 0,875 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenetica ossea quattro e 1,5 nanogrammi per millilitro di Activin A.Incubate per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore rimuovere 166 microlitri di mezzo da un lato di ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco con supplemento di B27 senza insulina. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Per indurre la specifica del mesoderma cardiaco il secondo giorno, rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640, contenenti integratore B27 senza insulina e tre micromolari Wnt-C59 e continuare l'incubazione per 48 ore. Il quarto giorno, rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco con integratore di B27 senza insulina, quindi incubare altre 48 ore. Il sesto giorno, rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzo e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 con supplemento B27.Per questo e tutti i successivi cambiamenti dei media, utilizzare il supplemento B27 con insulina, incubare per altre 24 ore. Il settimo giorno, la coltura cellulare è pronta per la differenziazione pro epicardica. Rimuovere 166 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco contenente supplemento B27 e tre cheer micromolari 99021.Quindi in incubazione per un'ora, dopo un'ora rimuovere la piastra dall'incubatore, rimuovere 166 microlitri di mezzo da un lato di ciascun pozzetto e aggiungere 166 microlitri di RPMI 1640 fresco contenente integratore B27 continuare l'incubazione per altre 48 ore. Ripeti questo processo ogni 48 ore fino al ritiro. Gli organoidi sono pronti per analisi e sperimentazioni il giorno 15 Per trasferire l'intero organoide, tagliare la punta di una pipetta P200, da cinque a 10 millimetri dall'apertura con un diametro di circa due o tre millimetri.Premere lo stantuffo della pipetta e inserire la punta verticalmente nel pozzetto del fondo rotondo con l'organoide. Assorbire circa 100-200 microlitri di mezzo sufficiente per raccogliere gli organoidi e trasferirli alla destinazione target. Prima che gli EBS di differenziazione appaiano come masse sferiche nere, il processo di differenziazione inizia il giorno zero con l'attivazione di un percorso Wnt e l'aggiunta del fattore di crescita per esattamente 24 ore.Inoltre la modifica di Wnt C59 il secondo giorno comporta l'allargamento dell'organoide da circa 200 micrometri a un massimo di un millimetro. Gli organoidi cardiaci umani hanno iniziato a battere già il sesto giorno e il 100% degli organoidi ha mostrato un battito visibile entro il giorno 10. Le immagini ad alto ingrandimento dell'organoide del settimo giorno hanno rivelato che la maggior parte delle cellule che esprimono la mano uno erano cardiomiociti in origine e la mano due erano cellule non miosite dal secondo Heartfield, cellule progenitrici.I trascritti di RNA sia per la mano uno che per la mano due sono stati espressi dal terzo giorno in poi nei dati di sequenziamento dell'RNA. I marcatori FHF sono stati altamente espressi durante i giorni tre e 11 mentre il marcatore SF è stato più altamente espresso dopo il giorno 13. La colorazione di immunofluorescenza ha rivelato la presenza di vari lignaggi di cellule cardiache umane che compongono il cuore umano.Come il tessuto miocardico ed epicardico, le cellule endocardiche, le cellule endoteliali e i fibroblasti cardiaci. I marcatori che esprimono le linee cellulari di cui sopra sono stati osservati anche nei profili di espressione genica dell'RNA SAC. L'imaging del calcio vivo di singole cellule in organoidi interi è stato utilizzato per misurare la funzione elettrofisiologica degli organoidi.L'intensità di fluorescenza del fluo-4 variava nel tempo a causa dell'uscita di ingresso del calcio dalla cellula che rivela potenziali d'azione regolari. Le mappe di calore che mostrano le intensità di calcio su una regione ad alto ingrandimento dell'organoide, mostrano una maggiore intensità dovuta ai transitori di calcio e alle singole cellule. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che gli EB e gli organoidi successivi non sono attaccati al fondo della piastra e ci sposteremo con la rimozione oltre ai supporti che richiedono modifiche attente ai supporti.Gli organoidi possono essere coltivati per periodi di tempo più lunghi introdotti alle tecniche di maturazione, o anche esposti a stimoli esterni, come il condizionamento meccanico o elettrico, e persino fattori di stress come le tossine. Questa tecnica consente l'accesso a stadi di sviluppo del cuore fetale umano che sono altrimenti inaccessibili nella ricerca, aprendo la strada a nuove intuizioni sullo sviluppo del cuore e sull'eziologia della malattia.

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