Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi
July 1st, 2022
Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.
Protocollo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo dal topo. Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institution Animal Ethics Committee dell'Università di Medicina di Nanchino.One.Introduzione. Con l'aumento della ricerca sull'immunità tumorale, la domanda di cellule DC sta gradualmente aumentando.
Tuttavia, le DC sono rare in tutti i tessuti. Il metodo tradizionale di indurre principalmente la differenziazione del midollo osseo in DC è complicato e costoso. Due. Isolamento del midollo osseo e preparazione delle cellule BM Sacrifichiamo i topi e fissiamo sul tavolo operatorio del topo.
Tagliare la pelle dei muscoli esposti a sinistra e dell'arteria femorale. Non tagliare direttamente l'arteria femorale. Altrimenti, causerà forti emorragie e contaminerà il campo visivo.
Taglia tutti i muscoli intorno al femore. Allungare lentamente gli arti inferiori del topo verso l'esterno fino al prolasso della testa del femore e può essere osservato. Separare gli arti inferiori dal corpo.
Tagliare la zampa posteriore per ottenere un femore libero e completo. Rimuovere i muscoli usando una garza. Non strappare direttamente i muscoli.
Il femore dei topi è fragile. Mettere il femore al 75% di alcol per due o cinque minuti. Tre. Coltura per iniezione di BMDC Risciacquare l'alcol residuo con PBS.
Blocca la parte centrale e inferiore del femore con una pinza emostatica e blocca l'estremità inferiore del femore con un'altra pinza emostatica. Le pinze emostatiche vengono applicate letteralmente al femore e il femore viene rotto dalla linea epifisaria. Utilizzare una siringa da un ml per perforare la cavità del midollo osseo dalla linea epifisaria.
Utilizzare mezzo completo due parti lavare la cavità del midollo osseo fino a quando l'osso diventa bianco. Raccogliere fluidi di lavaggio. Integrando il mezzo completo contenente GM CSF / IL-4 a 24 ml e seme in un piatto a 6 pozzetti con 4 ml per pozzetto. Four.Risultati.
Dopo due giorni, sostituire tutti i mezzi contenenti GM-CSF/IL-4. Metà ha sostituito il mezzo completo contenente GM-CSF/IL-4, il quarto, il sesto e l'ottavo giorno. Il numero di cellule ha raggiunto un picco il settimo giorno e poi è diminuito gradualmente.
Le cellule DC hanno formato un gran numero di sinapsi mostrando una tipica morfologia di cellule DC mature. Le analisi submetriche di flusso mostrano che il rapporto di CD11c ha imposto ciò che il 71% il sesto giorno, l'ampio rapporto aumenta al 96,1% il 10 ° giorno. L'espressione di CD11c, CD80 e MSC2, è aumentata gradualmente con l'aumentare del tempo di coltivazione. Cinque.Conclusione.
In breve, abbiamo stabilito un protocollo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo dai topi, che richiede solo 10 minuti per separare le cellule del midollo osseo. Un numero elevato di DC ad alta purezza è stato raccolto dopo sei-sette giorni di coltura con 10ng per ml, GM-CSF e IL-4.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo di topi ad alta purezza. Il protocollo prevede una coltura di 7 giorni con GM-CSF/IL-4.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Le cellule dendritiche (DC) sono cruciali per la ricerca sull'immunità tumorale.
- Le DC sono rare nei tessuti, rendendo difficile il loro isolamento.
- I metodi tradizionali per la differenziazione delle DC sono complessi e costosi.
- Questo studio mira a semplificare il processo di generazione delle DC dal midollo osseo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo economico per isolare le DC.
- Migliorare l'efficienza della generazione di DC dal midollo osseo dei topi.
- Supportare la ricerca sull'immunità tumorale fornendo DC ad alta purezza.
Metodi utilizzati
- Isolamento del midollo osseo dai topi.
- Coltura delle cellule del midollo osseo con GM-CSF/IL-4.
- Valutazione della purezza e della vitalità cellulare.
- Approvazione da parte del Comitato Etico Animale Istituzionale.
Risultati principali
- Isolamento con successo di DC derivate dal midollo osseo ad alta purezza.
- Efficienza dimostrata del nuovo protocollo.
- Potenziale di applicazione più ampia nella ricerca sull'immunità tumorale.
- Riduzione del tempo e dei costi rispetto ai metodi tradizionali.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è un'alternativa praticabile per la generazione di DC.
- Questo approccio può facilitare ulteriori ricerche in immunologia.
- Studi futuri potrebbero esplorare applicazioni in vari contesti terapeutici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the bottleneck in dendritic cell supply for immunology and tumor immunity research by providing an economical, high-yield method for isolating bone marrow-derived dendritic cells from mice. It enables scalable generation of phenotypically characterized DCs with reduced reagent consumption and hands-on time, supporting early-stage target validation and mechanistic studies in immunotherapy pipelines. The approach improves predictive confidence in preclinical models by delivering a reproducible, disease-relevant system for evaluating immune modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell function in antigen presentation and T-cell activation pathways.
- Operational Value: Reduces cost and complexity of DC generation using standardized GM-CSF/IL-4 differentiation.
- Scientific Value: Supports functional target validation through phenotypic characterization of CD11c, CD80, and MHC II expression over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-purity dendritic cell populations (80%-95% CD11c+) suitable for standardized immune assays.
- Operational Value: Yields up to 2.7 x 107 cells per mouse, enabling high-throughput screening formats.
- Scientific Value: Provides a consistent biological system for assessing compound effects on dendritic cell maturation and immune function.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates a disease-relevant system for modeling dendritic cell responses in tumor immunity contexts.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of immunomodulatory agents with defined cellular inputs.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking dendritic cell phenotype to functional outcomes in co-culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a renewable source of dendritic cells for immune-focused assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on dendritic cell-dependent immune pathways and target engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular outputs for assessing immunomodulatory activity.
- Analytics: Enables flow cytometry-based measurement of CD11c, CD80, and MHC II as maturation readouts.
- Translational Research: Connects in vitro dendritic cell generation to preclinical models of immune activation and tolerance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for dendritic cell production across immunology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through phenotypically defined dendritic cell inputs.
- Operational Value: Reduces time and cost via 10-minute bone marrow harvest and low cytokine dosing (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable dendritic cell models for immunotherapy screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates using standardized immune effector cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow isolation and aseptic cell culture techniques.
- Depends on access to 6-well plates, hemolytic forceps, and flow cytometry for phenotypic validation.
- Necessitates standardization of cytokine concentration and medium exchange schedule across users.
- Involves adaptation considerations when translating to other mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the 7–10 day culture window and associated decline in cell viability post-peak.
