Name: Protocollo economico ed efficiente per lisolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Scopri un protocollo economico ed efficiente per isolare e coltivare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo di topi utilizzando GM-CSF/IL-4. Questo metodo riduce tempi e costi per la ricerca in immunologia tumorale.

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Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 e TJWJ202021QN034).

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università medica di Nanchino.
1. Isolamento del midollo osseo e preparazione delle cellule BM
<ol><li>Sacrificare topi C57BL/6 (18-22 g, 6-8 settimane) tramite asfissia di CO2 . Fissare il mouse sul tavolo operatorio del mouse. Disinfettare le superfici con il 70% di etanolo.</li>
	<li>Tagliare la pelle della gamba per esporre i muscoli e l'arteria femorale. Blocca e strappa l'arteria femorale usando due pinze, quindi tira l'estremità prossimale verso l'addome. NOTA: Non tagliare direttamente l'arteria femorale. Altrimenti, causerà sanguinamento eccessivo e contaminerà il campo visivo.</li>
	<li>Taglia tutti i muscoli intorno al femore.</li>
	<li>Allungare lentamente gli arti inferiori del topo verso l'esterno fino a quando non si sente il suono della lussazione dell'articolazione dell'anca e il prolasso della testa del femore è visibile.</li>
	<li>Separare gli arti inferiori dal corpo usando le forbici lungo l'interno della testa del femore.</li>
	<li>Tagliare le zampe posteriori dall'estremità dell'articolazione del ginocchio per ottenere un femore libero e completo.</li>
	<li>Rimuovere i muscoli attaccati al femore usando una garza. NOTA: Non strappare direttamente i muscoli. Il femore dei topi è delicato, la sua integrità deve essere mantenuta.</li>
	<li>Immergere il femore in alcool al 75% per 2-5 minuti.</li>
</ol>2. Cultura di induzione della BMDC
<ol><li>Risciacquare l'alcol residuo con PBS. Utilizzare una pinza emostatica per bloccare la parte centrale e inferiore del femore e un altro set per bloccare l'estremità inferiore del femore. Le pinze emostatiche vengono applicate lateralmente al femore e il femore viene separato dalla linea epifisaria. NOTA: La linea epifisaria non è facilmente visibile fino a quando il femore non si frattura. Questo e i passaggi successivi vengono tutti eseguiti in un ambiente sterile.</li>
	<li>Utilizzare una siringa da 1 mL (ago: 0,6 mm x 25 mm) per penetrare nella cavità del midollo osseo dalla rottura della linea epifisaria e ruotare l'ago per penetrare nella testa del femore e attraverso la cavità del midollo osseo. Pulsare e lavare la cavità del midollo osseo utilizzando 1 mL del mezzo completo contenente GM-CSF / IL-4 fino a quando l'osso diventa bianco. NOTA: terreno di coltura completo: 10% FBS, 1% penicillina-streptomicina, 55 μM β-mercaptoetanolo, 10 ng/ mL GM-CSF e 10 ng / mL IL-4.</li>
	<li>Sospendere tutte le cellule in 24 mL di terreno di coltura completo (~5 x 105 cellule/mL). Dopo la miscelazione, tutto il mezzo è stato seminato su una piastra a 6 pozzetti con 4 ml / pozzetto, quindi incubato a 37 ° C con il 5% di CO2 per 2 giorni. NOTA: Non è necessario lisare gli eritrociti.</li>
	<li>Sostituire tutto il mezzo dopo 2 giorni con un mezzo contenente GM-CSF/IL-47. Al quarto, sesto e ottavo giorno, sostituire metà del mezzo con il mezzo completo contenente 10 ng / mL GM-CSF / IL-4. NOTA: In questa fase, le cellule sospese come eritrociti e linfociti vengono rimosse.</li>
	<li>Scatta foto ogni giorno per registrare la crescita cellulare. A partire dal sesto giorno, raccogliere un pozzetto di cellule al giorno per contare il numero di cellule e rilevare l'espressione di CD11c, CD80 e MHC II 6,7.</li>
</ol>3. Rilevazione citometrica a flusso dell'espressione di CD11c, CD80 e MHC II
<ol><li>Dopo aver lavato i DC con PBS, risospendere 1 x 106 cellule in 100 μL di tampone FACS, aggiungere 0,5 μg di anticorpo CD16/32 anti-topo e incubare per 10 minuti sul ghiaccio per bloccare siti di antigene non specifici.</li>
	<li>Aggiungere 1 μg di Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg di PE-CD80 e 0,04 μg di anticorpi APC-MHC II e incubare sul ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare a 1.000 x g per 3 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4%, fissare per 30 minuti a 4 °C e sospendere in 300 μL di tampone FACS.</li>
	<li>Eseguire la citometria a flusso.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li>
<li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786(2021).</li>
<li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+ontogeny%3A+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited%3A+both+CD8alpha%28-%29+and+CD8alpha%28%2B%29+dendritic+cells+are+generated+from+CD4%28low%29+lymphoid-committed+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).</li>
<li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%3A+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li>
<li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li>
<li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li>
<li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li>
<li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate%3A+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li>
</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse e di non avere nulla da rivelare.

Gli esseri umani e i topi hanno diversi sottoinsiemi dc, tra cui DC classici (cDC, inclusi cDC1 e cDC2s), DC plasmacitoidi (pDC) e DC derivati da monociti (MoDC)9,10,11. È generalmente accettato che i cDC1 regolano le risposte dei linfociti T citotossici (CTL) ai patogeni intracellulari e al cancro e i cDC2 regolano le risposte immunitarie a patogeni extracellulari, parassiti e allergeni12. Un numero sign...

Le cellule dendritiche (DC) sono le più potenti cellule che presentano l'antigene (APC) per attivare le cellule T naïve e indurre risposte specifiche dei linfociti T citotossici (CTL) contro malattie infettive, malattie allergiche e cellule tumorali 1,2,3. Le DC sono il collegamento primario tra immunità innata e immunità adattativa e svolgono un ruolo essenziale nella difesa immunologica e nel mantenimento della tolleranza immunitaria. Negli ultimi 40 anni, molti ricercatori hanno cercato di definire i sottoinsiemi di DC e le loro funzioni nell'infiammazione e nell'immunità. Secondo questi studi, le DC si sviluppano lungo le linee mieloidi e linfoidi dalle cellule del midollo osseo. I vaccini contro i tumori hanno raggiunto traguardi significativi negli ultimi anni e hanno un futuro promettente. Meccanicamente, i vaccini tumorali modulano la risposta immunitaria e prevengono la crescita tumorale attivando i linfociti T citotossici utilizzando antigeni tumorali. Il vaccino a base di DC svolge un ruolo importante nell'immunoterapia tumorale ed è stato identificato come una delle terapie antitumorali più promettenti 1,4. Inoltre, i DC sono stati ampiamente utilizzati nella sperimentazione di nuovi farmaci a bersaglio molecolare e inibitori del checkpoint immunitario5.
I ricercatori hanno urgente bisogno di un numero elevato di DC ad alta purezza per studiare ulteriormente il ruolo dei DC. Tuttavia, le DC sono rare in vari tessuti e sangue, rappresentando solo l'1% delle cellule del sangue negli esseri umani e negli animali. La coltura in vitro di cellule dendritiche del midollo osseo (BMDC) è un metodo importante per ottenere grandi quantità di cellule DC. Nel frattempo, il protocollo Lutz per la generazione di DC dal midollo osseo è stato ampiamente utilizzato dai ricercatori6. Sebbene il protocollo sia efficace nell'ottenere cellule DC, è complesso e costoso, comportando l'aggiunta di alte concentrazioni di citochine e la lisi dei globuli rossi.
In questo studio, riportiamo un metodo per isolare quasi tutte le cellule del midollo osseo dal midollo osseo di topo (BM) e indurre la differenziazione in BMDC dopo 7-9 giorni di incubazione in vitro, con una concentrazione inferiore di GM-CSF e IL-4. Questa procedura richiede solo 10 minuti per raccogliere quasi tutte le cellule del midollo osseo e per sospenderle in un mezzo completo. In breve, forniamo un metodo di coltivazione efficiente ed economico per BMDC in questa ricerca.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC-MHC II</td><td>Biolegend</td><td>116417</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD80</td><td>Biolegend</td><td>104707</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>Percp/cy5.5-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117327</td><td></td></tr><tr><td>PRMI-1640</td><td>Thermo</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante GM-CSF</td><td>Solarbio</td><td>P00184</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante IL-4</td><td>Solarbio</td><td>P00196</td><td></td></tr><tr><td>TruStain Fc PLUS (anti-topo CD16/32) Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>156603</td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

La domanda di cellule dendritiche (DC) sta gradualmente aumentando con l'avanzare della ricerca immunologica. Tuttavia, le DC sono rare in tutti i tessuti. Il metodo tradizionale per isolare le DC prevede principalmente l'induzione della differenziazione del midollo osseo (BM) nelle DC iniettando grandi dosi (>10 ng / mL) di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi / interleuchina-4 (GM-CSF / IL-4), rendendo la procedura complessa e costosa. In questo protocollo, utilizzando tutte le cellule BM coltivate in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, dopo 3-4 scambi di semicoltura, sono state raccolte fino a 2,7 x 107 cellule CD11c+ (DC) per topo (due femori) con una purezza dell'80%-95%. Dopo 10 giorni in coltura, l'espressione di CD11c, CD80 e MHC II è aumentata, mentre il numero di cellule è diminuito. Il numero di cellule ha raggiunto il picco dopo 7 giorni di coltura. Inoltre, questo metodo ha richiesto solo 10 minuti per raccogliere tutte le cellule del midollo osseo e un numero elevato di DC è stato ottenuto dopo 1 settimana di coltura.

Le cellule 1 x 10 7-1,7 x 107 sono state estratte da due femori e sono state nuovamente sospese in 24 ml di terreno prima di essere piantate in una piastra a 6 pozzetti (Figura 1A). Dopo 2 giorni, le cellule non aderenti sono state rimosse cambiando completamente il terreno di coltura. Prima di cambiare il mezzo, è stato osservato un numero significativo di cellule sospese (Figura 1B). Dopo 3 giorni di coltura, iniziarono a formarsi colonie...

Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Protocollo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo dal topo. Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institution Animal Ethics Committee dell'Università di Medicina di Nanchino.One.Introduzione. Con l'aumento della ricerca sull'immunità tumorale, la domanda di cellule DC sta gradualmente aumentando.Tuttavia, le DC sono rare in tutti i tessuti. Il metodo tradizionale di indurre principalmente la differenziazione del midollo osseo in DC è complicato e costoso. Due. Isolamento del midollo osseo e preparazione delle cellule BM Sacrifichiamo i topi e fissiamo sul tavolo operatorio del topo.Tagliare la pelle dei muscoli esposti a sinistra e dell'arteria femorale. Non tagliare direttamente l'arteria femorale. Altrimenti, causerà forti emorragie e contaminerà il campo visivo.Taglia tutti i muscoli intorno al femore. Allungare lentamente gli arti inferiori del topo verso l'esterno fino al prolasso della testa del femore e può essere osservato. Separare gli arti inferiori dal corpo.Tagliare la zampa posteriore per ottenere un femore libero e completo. Rimuovere i muscoli usando una garza. Non strappare direttamente i muscoli.Il femore dei topi è fragile. Mettere il femore al 75% di alcol per due o cinque minuti. Tre. Coltura per iniezione di BMDC Risciacquare l'alcol residuo con PBS.Blocca la parte centrale e inferiore del femore con una pinza emostatica e blocca l'estremità inferiore del femore con un'altra pinza emostatica. Le pinze emostatiche vengono applicate letteralmente al femore e il femore viene rotto dalla linea epifisaria. Utilizzare una siringa da un ml per perforare la cavità del midollo osseo dalla linea epifisaria.Utilizzare mezzo completo due parti lavare la cavità del midollo osseo fino a quando l'osso diventa bianco. Raccogliere fluidi di lavaggio. Integrando il mezzo completo contenente GM CSF / IL-4 a 24 ml e seme in un piatto a 6 pozzetti con 4 ml per pozzetto. Four.Risultati.Dopo due giorni, sostituire tutti i mezzi contenenti GM-CSF/IL-4. Metà ha sostituito il mezzo completo contenente GM-CSF/IL-4, il quarto, il sesto e l'ottavo giorno. Il numero di cellule ha raggiunto un picco il settimo giorno e poi è diminuito gradualmente.Le cellule DC hanno formato un gran numero di sinapsi mostrando una tipica morfologia di cellule DC mature. Le analisi submetriche di flusso mostrano che il rapporto di CD11c ha imposto ciò che il 71% il sesto giorno, l'ampio rapporto aumenta al 96,1% il 10 ° giorno. L'espressione di CD11c, CD80 e MSC2, è aumentata gradualmente con l'aumentare del tempo di coltivazione. Cinque.Conclusione.In breve, abbiamo stabilito un protocollo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo dai topi, che richiede solo 10 minuti per separare le cellule del midollo osseo. Un numero elevato di DC ad alta purezza è stato raccolto dopo sei-sette giorni di coltura con 10ng per ml, GM-CSF e IL-4.

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Immunologia e Infezioni

Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Questo video descrive un protocollo per la generazione di cellule dendritiche - cellule chiave che presentano l'antigene che attivano le cellule T - dal midollo osseo di un topo adulto.

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Si descrive un protocollo per l'isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.

Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

Qui presentiamo un protocollo che genera grandi quantità di monociti murini da midollo osseo eterogeneo per applicazioni traduzionali. Rispetto ad altri, questo nuovo metodo aiuta a ridurre il numero di animali sacrificati e abbassa i costi evitando metodi costosi come la separazione cellulare magnetica ad alto gradiente (MACS).

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

Esistono sottogruppi distinti di cellule dendritiche come popolazioni rare negli organi linfoidi, e quindi sono difficili da isolare in numero e purezza sufficienti per esperimenti immunologici. Qui descriviamo un metodo ad alta efficienza e ad alta resa per l'isolamento di tutti i principali sottogruppi attualmente noti di cellule dendritiche spleniche di topo.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.

Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Qui, descriviamo le condizioni di coltura in vitro , l'isolamento e l'aumento della generazione di vescicole extracellulari (EV) da Echinococcus granulosus. Le piccole vescicole extracellulari sono state caratterizzate dalla diffusione dinamica della luce e dalla microscopia elettronica a trasmissione. L'assorbimento da parte delle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo e la loro modulazione fenotipica sono stati studiati mediante microscopia confocale e citometria a flusso.

Isolamento e captazione delle cellule dendritiche di piccole vescicole extracellulari da Echinococcus granulosus

Vi presentiamo il nostro sito ottimizzato high-throughput protocollo nucleofection come un modo efficace di trasfezione delle cellule dendritiche umane primarie derivate da monociti sia con DNA plasmidico o siRNA senza provocare la maturazione delle cellule. Abbiamo inoltre fornire le prove per il silenziamento del gene siRNA successo mirati RIG-I, sia a livelli di mRNA e proteine.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Scopri un protocollo economico ed efficiente per isolare e coltivare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo di topi utilizzando GM-CSF/IL-4. Questo metodo riduce tempi e costi per la ricerca in immunologia tumorale.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

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