Name: Isolamento delle cellule endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Scopri l'isolamento delle cellule endoteliali dalle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula. Questo metodo consente di studiare le risposte al flusso ematico disturbato e identificare nuove terapie per l'aterosclerosi.

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Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti da sovvenzioni del National Institutes of Health HL119798, HL095070 e HL139757 a HJ. HJ è anche supportato dalla Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. I servizi forniti dall'Emory Integrated Genomics Core (EIGC) sono stati sovvenzionati dalla Emory University School of Medicine e sono stati anche parzialmente supportati dalla Georgia Clinical and Translational Science Alliance del National Institutes of Health con il premio no. UL1TR002378. Il contenuto fornito sopra è di esclusiva responsabilità degli autori e non riflette le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

Tutte le procedure animali descritte di seguito sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Emory University. I topi C57BL / 6 non ipercolesterolemizzanti, abbinati all'età e al sesso sono stati utilizzati per mitigare la variazione dipendente dal sesso e compensare qualsiasi complicanza delle condizioni ipercolesterolemiche.
1. Chirurgia della legatura parziale della carotide (PCL)
NOTA: La legatura parziale dell'arteria carotide della LCA è stata effettuata come descritto in precedenza e dimostrato3.
<ol><li>Anestetizzare il topo mediante inalazione di isoflurano (5% di isofluorano in ossigeno per induzione e 1,5% dopo quello di mantenimento) durante tutta la procedura utilizzando un vaporizzatore anestetico. Posizionare il topo supino su un tampone isotermico Deltaphase per prevenire la perdita di calore corporeo durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Applicare un unguento oculare per prevenire la cheratite da esposizione e confermare la profondità dell'anestesia dall'assenza di risposta al pizzico della punta.</li>
	<li>Iniettare buprenorfina 0,05 mg/kg per via sottocutanea per gestire preventivamente il dolore. Disinfettare l'area epilata applicando e pulendo con soluzione di betadine e isopropanolo tre volte. Assicurarsi che il betadine sia l'ultimo passo per sterilizzare l'area chirurgica, partendo dal centro e finendo ai lati.</li>
	<li>Utilizzando tecniche asettiche, praticare un'incisione ventrale della linea mediana (~ 1 cm) nella regione del collo ed esporre il punto di diramazione LCA mediante dissezione smussata.</li>
	<li>Ligare la carotide interna sinistra, la carotide esterna e le arterie occipitali con sutura di seta 6-0; lasciare intatta l'arteria tiroidea superiore.</li>
	<li>Approssimare la pelle e chiudere l'incisione con colla tissutale e/o punti di sutura.</li>
	<li>Trasferire il mouse in una gabbia di recupero preriscaldata (mantenuta a 37 °C) e posizionarlo su un asciugamano pulito per un massimo di 1 ora per evitare l'ipotermia post-operatoria. NOTA: Nella nostra esperienza, una singola dose preventiva di buprenorfina (0,05 mg / kg) è di solito sufficiente per la gestione del dolore post-operatorio. Una dose ripetuta di buprenorfina può essere somministrata se l'animale è in difficoltà dopo le prime 24 ore. Se eseguita correttamente, non vi è mortalità associata a questa procedura e lo stress postoperatorio per il topo è minimo. I topi vengono riportati nelle rispettive gabbie e monitorati quotidianamente dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Preparare l'impostazione della perfusione.<ol><li>Utilizzare lo 0,9% di NaCl (soluzione salina normale) contenente 10 U/mL di eparina in una sacca per flebo. Aggancia la sacca IV a 244-274 cm (8-9 piedi) da terra o circa 122-152 cm (4-5 piedi) più in alto della tavola di dissezione. Attaccare l'ago a farfalla all'estremità della linea salina e lavare eventuali bolle d'aria dalla linea IV.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolamento delle arterie carotidi dopo il sacrificio
<ol><li>Sacrificare i topi per inalazione di CO2 seguendo il protocollo istituzionale IACUC.</li>
	<li>Spruzzare etanolo al 70% sulla pelle del topo e posizionarlo in posizione supina sul pannello di dissezione contenente asciugamani di carta adsorbenti. Fissare le zampe del mouse agli asciugamani adsorbenti sulla scheda di dissezione usando nastro adesivo o un ago da 21 G.</li>
	<li>Usando un paio di forbici sterili, rimuovere la pelle del topo partendo dall'addome e fino alla parte superiore del torace.</li>
	<li>Utilizzare un paio di forbici per aprire la parete addominale sotto la gabbia toracica mediante dissezione smussata.</li>
	<li>Usando le forbici, praticare con attenzione un'incisione lungo la lunghezza del diaframma e continuare attraverso le costole su entrambi i lati del torace fino a quando lo sterno può essere sollevato. Sollevare delicatamente lo sterno con un paio di pinze; Successivamente, rimuovere la gabbia toracica per esporre il cuore.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il timo e qualsiasi tessuto connettivo sopra il cuore per visualizzare i vasi principali.</li>
	<li>Recidere la vena cava con le forbici per consentire al sangue di uscire dalla circolazione chiusa.</li>
	<li>Inserire un ago a farfalla da 21 G collegato alla linea IV attraverso l'apice del cuore nel ventricolo sinistro e consentire la perfusione retrograda per 2-3 minuti con soluzione salina normale a temperatura ambiente. Assicurarsi che venga mantenuta una portata costante di soluzione salina normale mantenendo il sacchetto salino all'altezza di 8-9 piedi da terra. NOTA: I polmoni e il fegato diventano pallidi, indicando una perfusione ottimale. Per ogni mouse vengono utilizzati circa 20 ml di buffer di perfusione.</li>
	<li>Rimuovere la pelle dalla regione del collo e rimuovere tutto il grasso, i muscoli e i tessuti connettivi per esporre le arterie carotidi (Figura 1A). NOTA: Il resto della procedura viene eseguito al microscopio da dissezione.</li>
	<li>Regolare il campo visivo per individuare i siti di legatura. Utilizzando le forbici da microdissezione da 10 mm, praticare una piccola incisione sotto il sito di legatura nell'LCA per consentire la perfusione.</li>
	<li>Perfondere di nuovo per un ulteriore 1 minuto attraverso il ventricolo sinistro e assicurarsi che l'LCA sia ben perfuso e privo di tracce visibili di sangue.</li>
	<li>Utilizzare una pinza a punta fine e piccole forbici a molla per rimuovere con cura i tessuti peri-avventiziali che circondano le carotidi mentre la carotide è attaccata al corpo. NOTA: Prestare estrema attenzione a non spremere o allungare le arterie carotidi durante questa fase di pulizia, in quanto ciò può aumentare il numero di cellule non vitali. Se eseguita correttamente, la vitalità cellulare nella sospensione cellulare finale è solitamente >93%.</li>
</ol>3. Isolamento unicellulare arricchito di cellule endoteliali da carotidi di topi
NOTA: I reagenti descritti di seguito possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 °C fino all'uso: tamponi di lisi a nuclei singoli 1x e 0,1x con i reagenti elencati nella tabella 1; tampone di lavaggio a nuclei singoli con i reagenti elencati nella tabella 1; ricetta Nuclei Buffer a nucleo singolo con i reagenti elencati nella Tabella 1. Le scorte di lavoro di questi tamponi devono essere preparate seguendo il protocollo del fabbricante. Composizione tampone digestivo: collagenasi di tipo II 600 U/mL e DNasi I 60 U/mL in soluzione salina tamponata fosfato contenente fosfato (PBS) contenente siero bovino fetale (FBS).
<ol><li>Mentre le carotidi sono ancora attaccate, lavare l'esterno delle arterie carotidi con una normale soluzione salina per eliminare eventuali tracce di sangue.</li>
	<li>Utilizzando una siringa da insulina dotata di un ago da 29 G, iniettare ~ 50 μL del tampone digestivo nel lume dell'estremità distale dell'arteria carotide sinistra. Quando il tampone di digestione inizia a riempire l'arteria carotide, bloccare l'estremità prossimale della carotide con una micro-clip (Figura 1B). Introdurre ulteriori 15-20 μL di tampone digestivo nel lume e tagliare l'estremità distale per evitare il rilascio del tampone di digestione.</li>
	<li>Espiare con cautela le arterie carotidi dal topo (Figura 1B,C) e metterle in piatti da 35 mm contenenti una soluzione salina calda (a 37 °C) tamponata con Hepes. NOTA: assicurarsi che entrambi i morsetti siano posizionati saldamente. Se il morsetto si allenta, la soluzione di digestione può fuoriuscire dal lume e influenzare il conteggio delle cellule ottenuto. Se ciò accade, aggiungere un'ulteriore soluzione enzimatica usando una siringa da insulina dotata di un ago da 29 G dall'estremità aperta della carotide e fissare nuovamente il morsetto (Figura 1D). Se la soluzione tampone enzimatica perde di nuovo, è probabile che la carotide venga recisa durante il processo di espianto. In questo caso, scartare la carotide ed escludere il campione dallo studio. La manipolazione approssimativa ripetuta della carotide diminuirà la vitalità cellulare e la qualità della preparazione a singola cellula. Fare attenzione a identificare ed etichettare correttamente le arterie carotidi sinistra e destra.</li>
	<li>Incubare le carotidi espiantate per 45 minuti a 37 °C con oscillazione intermittente.</li>
</ol>4. Lavaggio delle arterie carotidi
<ol><li>Dopo aver completato la digestione enzimatica luminale, rimuovere l'arteria carotide insieme ai morsetti dal piatto da 35 mm. Rimuovere con attenzione ogni morsetto, facendo attenzione che il tampone di digestione non perda.</li>
	<li>Tenere delicatamente un'estremità dell'arteria carotide con una pinza fine sopra un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Inserire un ago da 29 G dotato di una siringa da insulina contenente 100 μL di tampone digestivo caldo (37 °C) nel lume con l'altra mano (Figura 1D).</li>
	<li>Lavare rapidamente il lume della carotide nel tubo della microcentrifuga. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 0,3 mL di FBS nel tubo da 1,5 mL. Posizionare il tubo sul ghiaccio. NOTA: Il lavaggio contiene le cellule della digestione enzimatica luminale. L'aggiunta di FBS e la riduzione della temperatura arrestano il processo di digestione enzimatica. Se il numero di cellule nella preparazione è elevato e contiene detriti o tessuto adiposo, l'uso di un filtro cellulare da 50 o 70 μm è altamente raccomandato per filtrare i detriti di tessuti indesiderati. Per aumentare la conta delle singole cellule, si raccomanda il lavaggio di più carotidi. Qui, per ottenere almeno 5.000 cellule, 10-12 carotidi sono state lavate e raggruppate come un unico campione.</li>
	<li>Centrifugare le celle a 500 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga dotata di rotore ad angolo fisso (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un tampone di digestione contenente il reagente di dissociazione cellulare (vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti a 37 °C per separare tutte le cellule in singole cellule. NOTA: Se il numero di celle nella preparazione è basso, aumentare la velocità della centrifuga fino a 2.000-3.000 × g per far girare le celle. Inoltre, l'utilizzo di provette da centrifuga da 0,5 ml facilita una migliore visualizzazione del pellet cellulare sul fondo del tubo.</li>
	<li>Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 0,15 mL di FBS nel tubo da 0,5 mL.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione monocella a 500 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga dotata di rotore ad angolo fisso, come al punto 4.4.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μL di soluzione di albumina sierica bovina (BSA) ghiacciata all'1% in PBS in una provetta da microcentrifuga da 0,2 ml. NOTA: L'utilizzo di provette da centrifuga da 0,2 ml migliora la visualizzazione del pellet monocellulare sul fondo del tubo.</li>
</ol>5. Analisi monocellulari e mononucleosi
<ol><li>Risospendere e inviare la preparazione a singola cellula per scRNAseq.<ol><li>Risospendere il pellet unicellulare con 100 μL di BSA ghiacciato all'1% in PBS in una provetta da 0,2 ml.</li>
		<li>Dopo aver risospeso le celle per l'incapsulamento a cella singola, procedere immediatamente per l'incapsulamento a cella singola e il codice a barre utilizzando un sistema di partizionamento e codifica a barre a cella singola basato sulla microfluidica (vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Prima di sottoporre i campioni al nucleo di genomica, contare e ispezionare i preparati monocellulari; garantire l'assenza di aggregati cellulari. NOTA: L'aggregazione di singole celle può essere ulteriormente minimizzata aumentando la quantità di BSA fino al 2%.</li>
	</ol></li>
	<li>Risospendere e inviare la preparazione a cella singola per scATACseq.<ol><li>Risospendere il pellet cellulare in 100 μL di 0,04% BSA in 1x PBS ghiacciato e centrifugare la sospensione monocellulare a 500 × g a 4 °C.</li>
		<li>Lisare la sospensione monocellulare con tampone di lisi 0,1x ghiacciato (Tabella 1) e incubare per 5 minuti su ghiaccio.</li>
		<li>Mescolare il lisato 10 volte con una pipetta P-20 e incubare per altri 10 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio refrigerato (Tabella 1) alle celle lisate e mescolare 5 volte utilizzando una pipetta. NOTA: Utilizzare un filtro cellulare da 70 μm per filtrare eventuali detriti dalla sospensione cellulare e trasferirli in un tubo da 2 ml.</li>
		<li>Centrifugare il lisato a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere i nuclei-pellet nel tampone nuclei diluiti (150 μL) (vedere la tabella dei materiali e la tabella 1). Contare e ispezionare i preparati a nucleo singolo utilizzando un emocitometro11.</li>
		<li>Inviare il campione di nuclei singoli al nucleo genomico per la trasposizione di nuclei singoli, il partizionamento dei nuclei, la preparazione della libreria e il sequenziamento. NOTA: Se il numero iniziale di cellule è basso, è comune osservare detriti lungo i nuclei. Pertanto, si consiglia di iniziare con un numero di celle elevato.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow%2C+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861(2010).</li>
<li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li>
<li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039(2014).</li>
<li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li>
<li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000(2013).</li>
<li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491(2020).</li>
<li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180(2021).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210(2019).</li>
</ol>

HJ è il fondatore di FloKines Pharma. Altri autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per isolare i preparati unicellulari dalle arterie carotidi del topo. L'influenza del d-flow sulle cellule endoteliali può essere accuratamente studiata se la chirurgia PCL viene eseguita correttamente. È fondamentale identificare correttamente i rami della carotide comune, come la carotide esterna, la carotide interna, l'arteria occipitale e l'arteria tiroidea superiore. La convalida dei modelli di flusso mediante ecografia convalida ulteriormente l'insorgenza...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Nicolas Villa-Roel1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments

Questo laboratorio ha precedentemente dimostrato che l'induzione del d-flow porta a uno sviluppo rapido e robusto dell'aterosclerosi nei topi iperlipidemici 1,2. Il nuovo modello murino di aterosclerosi indotta da d-flow è stato possibile utilizzando la chirurgia della legatura parziale della carotide (PCL) 3. La chirurgia PCL induce condizioni di flusso sanguigno basso e oscillatorio o d-flow nell'arteria carotide sinistra legata (LCA). Al contrario, l'arteria carotide destra controlaterale (RCA) continua ad affrontare un flusso laminare stabile (s-flow). In precedenza, per comprendere l'effetto del d-flow sulle cellule endoteliali, le arterie carotidi venivano sezionate dopo un intervento chirurgico di legatura parziale e lavate con un agente lisante a base di fenolo e guanidina isotiocianato (metodo di lavaggio del DNA / RNA luminale)2,4, che forniva RNA o DNA "pooled bulk" arricchiti con endotelio. Questi aggregati di RNA o DNA bulk sono stati quindi elaborati per studi trascrittomici o studi epigenomici sul metiloma del DNA, rispettivamente 4,5,6. Questi studi hanno contribuito a scoprire più geni sensibili al flusso e microRNA i cui ruoli nella biologia endoteliale e nell'aterosclerosi sono stati ampiamente studiati 4,6,7.
Tuttavia, nonostante l'arricchimento endoteliale, questi studi di massa RNA / DNA non hanno potuto distinguere il ruolo specifico di ciascun tipo di cellula nella parete arteriosa nell'aterosclerosi indotta da d-flow. Sono stati eseguiti studi di isolamento a singola cellula arricchita di endotelio (sc) e di sequenziamento di scRNA e scATAC per superare questa limitazione8. Per questo, i topi C57Bl6 sono stati sottoposti alla chirurgia PCL per indurre il d-flow nella LCA mentre utilizzavano l'RCA esposto al flusso s come controllo. Due giorni o due settimane dopo l'intervento chirurgico PCL, i topi sono stati sacrificati e le carotidi sono state sezionate e ripulite. Il lume di entrambe le LCA e RCA è stato infuso con collagenasi e sono stati raccolti i digesti di collagenasi luminale contenenti EC come frazione significativa e altre cellule arteriose. La sospensione a singola cellula (scRNAseq) o la sospensione a nucleo singolo (scATACseq) sono state preparate e codificate a barre con identificatori univoci per ogni cellula o nucleo utilizzando una configurazione genomica 10x. Gli RNA sono stati sottoposti alla preparazione della libreria di cDNA e sequenziati.
I set di dati scRNAseq e scATACseq sono stati elaborati utilizzando il software Cell Ranger Single-Cell e ulteriormente analizzati dai pacchetti Seurat e Signac R 9,10. Ad ogni cellula e nucleo è stato assegnato un tipo di cellula da queste analisi e raggruppato nel tipo di cellula in base ai geni marcatori e ai modelli di espressione genica unici. I risultati di scRNAseq e scATACseq hanno dimostrato che questi preparati unicellulari sono arricchiti con EC e contengono anche cellule muscolari lisce (SMC), fibroblasti e cellule immunitarie.
Ulteriori analisi hanno rivelato che la popolazione EC nella digestione luminale è altamente divergente e plastica (8 diversi cluster EC) e reattiva al flusso sanguigno. Ancora più importante, questi risultati hanno dimostrato che il d-flow riprogramma le EC da un fenotipo antinfiammatorio protetto dall'atero a fenotipi pro-aterogeni, tra cui la transizione pro-infiammatoria, endoteliale-mesenchimale, la transizione delle cellule staminali / progenitrici endoteliali e, più sorprendentemente, la transizione da cellule endoteliali a cellule immunitarie. Inoltre, i dati di scATACseq rivelano nuovi cambiamenti di accessibilità della cromatina dipendenti dal flusso e siti di legame del fattore di trascrizione in modo genomico, che costituiscono la base di diverse nuove ipotesi. La metodologia e il protocollo per la preparazione di singole cellule endoteliali per studi multi-omici a singola cellula dalle arterie carotidi di topo sono dettagliati di seguito.

<table><tbody><tr><td>Sostanze chimiche, peptidi e proteine ricombinanti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (grado per colture cellulari)</td><td>Corning</td><td>21040CMX12</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga LoBind da 1,5 mL per proteine</td><td>Eppendorf</td><td>022-43-108-1</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga da 15 mL - Rack in schiuma, sterile</td><td>Fablab</td><td>FL4022</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga SuperClear da 50 mL</td><td>Labcon</td><td>3191-335-028</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sutura di seta sterile</td><td>Covidien</td><td>s-1172 c2</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro cellulare, bianco, sterile, confezionato singolarmente</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione accutase, filtrato sterile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td>o</td></tr><tr><td>tampone ATAC equivalente (componente I della miscela di trasposizione)</td><td>10x Genomics</td><td>2000122</td><td></td></tr><tr><td>enzima ATAC (componente II della miscela di trasposizione)</td><td>10x Genomics</td><td>2000123/ 2000138</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Med-Vet International</td><td>RXBUPRENOR5-V</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Controller & Successivo Kit di accessori GEM</td><td>10X Genomics</td><td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>Cromo Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Cromo Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td><td>10X Genomics</td><td>1000175</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100502.5</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pinze da dissezione</td><td>Roboz Strumenti chirurgici Co</td><td>RS-5005</td><td></td></tr><tr><td>Dnase1</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga (modello da banco # 5425)</td><td>Eppendorf</td><td>22620444230VR</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino - Premium Select</td><td>R& D systems</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-24-11-Kit Rotore</td><td></td></tr><tr><td>HEPES soluzione salina tamponata</td><td>Millipore Sigma</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina (3/10 mL 29 G)</td><td>BD</td><td>305932</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson vet</td><td>789 313 89</td><td></td></tr><tr><td>MACs Filtri intelligenti (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 &micro; m)</td><td>&nbsp; Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina normale (0,9% cloruro di sodio)</td><td>Baxter International Inc</td><td>2B1323</td><td></td></tr><tr><td>Nuclei Buffer (20x)</td><td>10x Genomics</td><td>PN 2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Forbici piccole</td><td>Roboz Surgical Instruments Co</td><td>RS-5675</td><td></td></tr><tr><td>Micro clip in acciaio inox che applica pinze con serratura</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5480</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Tissue Mend II</td><td>Webster Veteinanry</td><td>07-856-7946</td><td></td></tr><tr><td>Tipo II Collagenasi</td><td>MP biomedicals</td><td>2100502.1</td><td></td></tr><tr><td>Deposited Data</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scATACseq FastQ files</td><td>NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>scRNAseq FastQ files</td><td>Adesione www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject NCBI</td><td># PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>Software e algoritmi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger 3.1.0</td><td>10X Genomics</td><td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td><td></td></tr><tr><td>Cicero</td><td>Pliner et al., 2018</td><td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td><td></td></tr> <tr><td>Ggplot2 v3.2.1</td><td>Hadley Wickham</td><td>https://cran.r-project.org</td><td></td></tr><tr><td>Harmony</td><td>Korsunsky et al., 2019</td><td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Schneider et al., 2012</td><td>https://imagej.nih.gov</td><td></td></tr><tr><td>Monocle 2.8.0</td><td>Qiu et al., 2017</td><td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td><td></td></tr><tr><td>R versione 3.6.2</td><td>R Foundation</td><td></td><td></td>https://www.r-project.org</tr><tr><td>Seurat 3.1.3</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/satijalab/seurat</td><td></td></tr><tr><td>Signac 0.2.5</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/timoast/signac</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria delle regioni arteriose esposte a flussi sanguigni disturbati (d-flow). Il D-flow regola l'espressione dei geni nell'endotelio a livello trascrittomico ed epigenomico, con conseguente risposta proaterogena. Recentemente, sono stati eseguiti studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) e test a singola cellula per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (scATACseq) per determinare i cambiamenti di accessibilità trascrittomica e cromatina a una risoluzione a singola cellula utilizzando il modello di legatura parziale della carotide (PCL) del topo. Poiché le cellule endoteliali (ECs) rappresentano una frazione minore delle popolazioni cellulari totali nella parete arteriosa, è stato utilizzato un metodo di digestione luminale per ottenere preparati monocellulari arricchiti con EC. Per questo studio, i topi sono stati sottoposti a chirurgia PCL per indurre il flusso d nell'arteria carotide sinistra (LCA) mentre utilizzavano l'arteria carotide destra (RCA) come controllo. Le arterie carotidi sono state sezionate due giorni o due settimane dopo l'intervento chirurgico PCL. Il lume di ciascuna carotide è stato sottoposto alla digestione della collagenasi e sono state ottenute singole cellule arricchite con endotelio o singoli nuclei. Questi preparati monocellulari e mononuclei sono stati successivamente codificati a barre utilizzando una configurazione microfluidica 10x Genomics. Le singole cellule e i singoli nuclei con codice a barre sono stati quindi utilizzati per la preparazione dell'RNA, la generazione della libreria e il sequenziamento su un sequenziatore di DNA ad alto rendimento. Dopo l'elaborazione bioinformatica, i set di dati scRNAseq e scATACseq hanno identificato vari tipi di cellule dalla digestione luminale, costituite principalmente da EC . Erano presenti anche cellule muscolari lisce, fibroblasti e cellule immunitarie. Questo metodo di arricchimento CE ha aiutato a comprendere l'effetto del flusso sanguigno sull'endotelio, che avrebbe potuto essere difficile con il metodo di digestione totale delle arterie. Il metodo di preparazione a singola cellula arricchito con EC può essere utilizzato per eseguire studi omici a singola cellula in topi EC-knockout e transgenici in cui l'effetto del flusso sanguigno su questi geni non è stato studiato. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata per isolare singole cellule arricchite di EC da espianti di arterie umane per eseguire studi meccanicistici simili.

Sono stati eseguiti interventi chirurgici di legatura parziale della carotide su 44 topi e l'inizio del flusso d nella LCA è stato convalidato eseguendo l'ecografia un giorno dopo l'intervento chirurgico di legatura parziale. La chirurgia di legatura parziale di successo provoca una riduzione della velocità del flusso sanguigno e inverte il flusso sanguigno (flusso disturbato) nella LCA3. Le arterie carotidi sono state sezionate a due giorni o due settimane dopo la legatura. Il lume di ci...

Presentiamo un metodo per isolare cellule e nuclei endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo esposte a condizioni di flusso stabili o disturbate per eseguire esperimenti omici a singola cellula.

Isolamento delle cellule endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

In un vaso sanguigno, il numero di cellule endoteliali è molto basso, il che rende difficile studiarle. Il nostro protocollo elimina questa limitazione e ci consente di studiare nuovi percorsi molecolari e terapie. Il nostro protocollo ci consente di ottenere campioni arricchiti endoteliali e studiare come il flusso disturbato acuto e cronico influisce su questo tipo di cellula.La capacità di studiare le cellule endoteliali in modo più dettagliato consente di definire i geni bersaglio, e quindi potenziali terapie per l'aterosclerosi che prendono di mira le cellule endoteliali. L'isolamento dell'arteria carotide è complicato e richiede pazienza ed esperienza. Per iniziare, preparare l'animale iniettando 0,05 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina per via sottocutanea.Sterilizzare l'area epilata usando Betadine e soluzione di isopropanolo tre volte. Fare un'incisione ventrale della linea mediana di circa un centimetro nella regione del collo. Quindi esporre il punto di diramazione LCA mediante dissezione smussata.Ligare la carotide interna sinistra, la carotide esterna e le arterie occipitali con 6-0 punti di sutura, lasciando intatta l'arteria tiroidea superiore. Chiudere l'incisione con colla di tessuto o punti di sutura. Trasferire il mouse in una gabbia di recupero preriscaldata mantenuta a 37 gradi Celsius.Posizionare il mouse su un asciugamano pulito per un massimo di un'ora per evitare l'ipotermia post-operatoria. Inserire un ago di calibro 21 nella linea IV collegata attraverso l'apice del cuore nel ventricolo sinistro. Lasciare la perfusione retrograda per due o tre minuti utilizzando soluzione salina normale a temperatura ambiente.Mantenere una portata costante applicando una pressione costante durante l'iniezione o l'utilizzo di una linea IV e mantenendo la sacca salina ad un'altezza di otto-nove piedi. Rimuovere la pelle dalla regione del collo con tutto il grasso, i muscoli e i tessuti connettivi per esporre le arterie carotidi. Quindi rimuovere i tessuti periavventiziali intorno alle carotidi lasciando la carotide attaccata al corpo.Fare un'incisione sotto il sito di legatura nella LCA per consentire la perfusione. Perfondere l'LCA attraverso il ventricolo sinistro per un altro minuto per rimuovere eventuali tracce di sangue. Lavare l'esterno delle arterie carotidi con una normale soluzione salina per rimuovere eventuali tracce di sangue.Utilizzare una siringa da insulina con un ago da 29 gauge per iniettare 50 microlitri di tampone digestivo nel lume dell'estremità distale dell'arteria carotide sinistra. Utilizzare una micro clip per bloccare l'estremità prossimale dell'arteria carotide piena di tampone digestivo. Aggiungere da 15 a 20 microlitri di tampone di digestione nel lume e tagliare l'estremità distale per evitare qualsiasi rilascio di tampone di digestione.Trasferire le arterie carotidi dal topo in piatti da 35 millimetri contenenti soluzione salina tamponata HEPES calda a 37 gradi Celsius. E incubarli per 45 minuti a 37 gradi Celsius con oscillazioni intermittenti. Rimuovere l'arteria carotide con i morsetti dal piatto di 35 millimetri dopo aver completato la digestione enzimatica luminale.Staccare accuratamente i morsetti, in modo che il tampone di digestione non perda. Tenere un'estremità dell'arteria carotide sopra un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di tampone di digestione caldo al lume inserendo un ago da 29 gauge dotato di una siringa da insulina.Lavare rapidamente il lume dell'arteria carotide nel tubo della microcentrifuga, quindi aggiungere 0,3 microlitri di FBS nel tubo per fermare la reazione. Posizionare il tubo della microcentrifuga sul ghiaccio. Centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, utilizzando una centrifuga dotata di rotore ad angolo fisso e scartare il surnatante.Risospendere le cellule nel tampone di digestione, contenente il reagente di dissociazione cellulare, e incubarle per cinque minuti a 37 gradi Celsius per separarle in singole cellule. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 0,15 millilitri di FBS al tubo da 0,5 millilitri e ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione ghiacciata all'1% BSA in PBS in una provetta da microcentrifuga da 0,2 millilitri.Per l'analisi a cella singola, risospendere il pellet con 100 microlitri di ghiaccio freddo 1% BSA in PBS in un tubo da 0,2 millilitri. Per l'analisi del singolo nucleo, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di 0,04% BSA in PBS ghiacciato e centrifugare la sospensione a singola cellula a 500G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scomporre la sospensione monocellulare con tampone di lisi ghiacciato e incubare per cinque minuti su ghiaccio.Mescolare il lisato con una pipetta P20 e incubare per altri 10 minuti. Successivamente, trasferire il lisato in un tubo da 0,5 millilitri. Lavare le celle con 500 microlitri di tampone e mescolarle con una pipetta.Quindi ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di nuclei in 150 microlitri del tampone nuclei diluiti. Contare i preparati di singoli nuclei usando un emocitometro.A seguito dello studio di sequenziamento di singoli nuclei, sono stati ottenuti nuclei singoli e singoli nuclei e visualizzati mediante microscopia a campo luminoso e a contrasto di fase. È stata anche dimostrata l'efficienza della preparazione di singoli nuclei dalla sospensione monocellulare. Dopo lo studio di sequenziamento dell'RNA a singola cellula, sono stati ottenuti vari parametri come la distribuzione dei geni per cellula, l'identificatore molecolare univoco per cellula, le letture mitocondriali per cellula e i dati di saturazione del sequenziamento.Per lo studio della sequenza ATAC a singola cellula, è stata osservata la distribuzione delle dimensioni dell'inserto, incluso il modello di banding del nucleosoma. È stato osservato anche il punteggio di arricchimento TSS normalizzato. Inoltre, il frammento percentuale legge nei picchi.Sono stati determinati i frammenti della regione di picco, il punteggio di arricchimento TSS, il rapporto delle letture nei siti genomici della lista nera e il rapporto del segnale dei nucleosomi. La digestione enzimatica è uno stress per le cellule, quindi è fondamentale mantenere i campioni sul ghiaccio ed eseguire la procedura il più rapidamente possibile. Possiamo usare questo metodo per ottenere e placcare le cellule endoteliali dai topi.Possiamo anche utilizzare questa tecnica per eseguire studi basati su Omix di massa. Questa tecnica ha aperto la strada allo studio dell'effetto del flusso sanguigno disturbato sulle cellule endoteliali in vivo in modo da una singola cellula.

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Questo descrive un intervento parziale legatura della carotide, che causa condizioni di flusso disturbato e lo sviluppo dell'aterosclerosi successivi (in due settimane) con intraplaque neo-vascolarizzazione (in quattro settimane) nel topo l'arteria carotide comune. Abbiamo anche descritto un nuovo metodo di isolamento di RNA dal dell'intima carotidea, fornendo RNA di elevata purezza endoteliali.

Un modello di Disturbed flusso indotta aterosclerosi carotidea in Arteria mouse da legatura parziale e un semplice metodo di isolamento dell&#39;RNA da Endotelio carotidea

Vi presentiamo una preparazione per la visualizzazione e la manipolazione di segnalazione del calcio in nativo, intatto microvascolari. Tubi endoteliali appena isolate da arterie di resistenza topo che forniscono muscolo scheletrico mantenere in vivo la morfologia e la segnalazione dinamica all'interno e tra le cellule vicine. Tubi endoteliali possono essere preparati da microvasi di altri tessuti e organi.

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Scopri l'isolamento delle cellule endoteliali dalle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula. Questo metodo consente di studiare le risposte al flusso ematico disturbato e identificare nuove terapie per l'aterosclerosi.

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