Name: Un sistema di cellule a tripla coltura che modella la barriera emato-encefalica umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Scopri un sistema di coltura tripla che modella la barriera emato-encefalica umana con cellule endoteliali, periciti e astrociti. Questo metodo consente di studiare il trasporto di nanoparticelle e valutare strategie di drug delivery cerebrale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è concesso dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 764958, nell'ambito del progetto NANOSTEM, una rete di formazione innovativa Marie Skłodowska-Curie (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Questo studio è finanziato dal «Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais» (Fellowship to Clémence Deligne), dalla "Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l'Enfant et de l'adolescent" (SFCE), dall'Association "l'étoile de Martin" e dall'Association "Cassandra contre la leucémie".

Il protocollo è stato approvato dal Ministero francese dell'istruzione superiore e della ricerca (riferimento: CODECOH DC2011-1321) e dal comitato di revisione sperimentale locale (Béthune Maternity Hospital, Beuvry, Francia). Per ottenere le cellule endoteliali (CE), è stato ottenuto il consenso scritto e informato dei genitori del donatore per raccogliere il sangue del cordone ombelicale, in conformità con la legislazione francese. I periciti sono forniti dal professor Takashi Kanda (Dipartimento di Neurologia e Neuroscienze Cliniche, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Ube, Giappone) che sono stati isolati secondo il riferimento19. Gli astrociti primari della corteccia cerebrale umana vengono acquistati da un fornitore commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Coltura cellulare
<ol><li>Coltura di cellule endoteliali NOTA: Le cellule endoteliali (ECs) derivano da cellule staminali ematopoietiche CD34+ isolate dal sangue del cordone ombelicale umano, secondo il metodo descritto da Pedroso et al.20. Il fenotipo endoteliale delle EC è descritto in Pedroso et al.20.
	<ol><li>Coltivare EC umane utilizzando il terreno di coltura delle cellule endoteliali integrato con il 5% di siero fetale di vitello (FCS), lo 0,5% di gentamicina e l'1% di integratore di crescita delle cellule endoteliali (ECM) (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Per la subcoltura di EC di subcoltura, due giorni prima della messa a punto del modello, ricoprire un piatto con 10 ml di gelatina al 2% per 15 minuti a 37 °C e quindi sostituirlo con 20 ml di ECM caldo. Scongelare un flaconcino di EC contenente 1 milione di cellule (le cellule sono state contate manualmente come descritto al punto 2.3.3 prima del congelamento delle cellule) nel piatto di coltura cellulare preverniciato.</li>
		<li>Dopo 3 ore a 37 °C, rinnovare il terreno e mantenere le celle fino alla presa della tricoltura in atmosfera umidificata all'interno di un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO 2 e il 21% di O2.</li>
	</ol></li>
	<li>Coltura di periciti NOTA: I periciti sono isolati dal cervello umano secondo il protocollo pubblicato da Shimizu et al.19, la cui procedura di isolamento segue il metodo pubblicato da Kanda et al.21 con modifiche.<ol><li>Coltivare i periciti utilizzando il terreno Eagle modificato di Dulbecco integrato con 4,5 g / L di glucosio (DMEM HG), 10% di FCS, 1% di penicillina / streptomicina e 1% di L-glutammina (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Per la subcoltura dei periciti, cinque giorni prima della messa a punto del modello, ricoprire due piatti con 8 ml/piatto di 100 μg/ml di soluzione di collagene di tipo I in acido acetico 0,02 N per 1 ora a temperatura ambiente (RT) e quindi lavare due volte con RT DMEM HG. Scongelare un flaconcino di periciti contenenti 1 milione di cellule in un tubo conico contenente 10 mL di mezzo caldo e centrifugare la sospensione per 5 minuti a 190 x g a 20 °C.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 10 ml di terreno caldo e seminarlo nelle piastre di coltura cellulare pre-rivestite preriempite con 15 ml di mezzo/piatto caldo. Il terreno viene rinnovato dopo 3 giorni e le cellule vengono mantenute fino alla presa della tricoltura in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO 2 e il 21% di O2.</li>
	</ol></li>
	<li>Coltura di astrociti<ol><li>Coltivare gli astrociti utilizzando un terreno di coltura con il 20% di FCS, l'1% di integratore per la crescita degli astrociti e l'1% di soluzione di penicillina / streptomicina (AM) (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Per la subcoltura degli astrociti, una settimana prima dell'impostazione del modello, rivestire un matraccio per coltura cellulare T75 con 10 mL di 2 μg/cm2 di poli-L-lisina (PLL) per 1 ora a 37 °C e lavare due volte con acqua sterile RT. Scongelare un flaconcino di astrociti contenente 1 milione di cellule in 20 ml di terreno caldo e semi nel matraccio di coltura cellulare T75 pre-rivestito. NOTA: Le fiale di cellule ottenute commercialmente confermano la presenza di ~ 1 milione di cellule, quindi il conteggio delle cellule non è stato eseguito qui.</li>
		<li>Mantenere le celle in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO 2 e il 21% di O2. Il mezzo viene rinnovato dopo 24 h e poi ogni 2 giorni fino all'impostazione della tricoltura.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Impostazione del modello di tripla cultura
NOTA: l'assemblaggio dei tre tipi di celle viene eseguito lo stesso giorno. Il giorno prima dell'impostazione della tricoltura, eseguire il rivestimento di collagene di tipo I sui filtri a inserto ripristinati (vedi Tabella dei materiali) e seminare gli astrociti nei pozzetti prerivestiti in PLL di una piastra a 12 pozzetti.
<ol><li>Semina di astrociti nei pozzi<ol><li>Rivestire i pozzetti con 500 μL di soluzione di 2 μg/cm 2 PLL, come descritto al punto 1.3.2.</li>
		<li>Lavare le cellule una volta con 10 mL di tampone fosfato caldo soluzione salina - senza calcio e magnesio 1X (1X PBS-CMF) (Tabella 1) prima di incubare per 3 minuti a 37 °C con 10 mL di soluzione calda al 20% di tripsina/EDTA (T/E) e staccare meccanicamente le cellule dal pallone. Trasferire la sospensione in un tubo conico contenente 5 mL di FCS caldo non diluito. NOTA: Secondo il protocollo22 del fornitore, la raccolta di astrociti può essere ottimizzata posizionando il pallone nell'incubatore per 1 minuto e picchiettando il pallone per completare il distacco. Le cellule rimanenti devono essere raccolte con 5 mL di soluzione di neutralizzazione T/E e poste nel tubo conico contenente FCS.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 20 °C a 190 x g.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di AM caldo. Contare le cellule diluendo 20 μL della sospensione cellulare in 80 μL di 1X PBS-CMF utilizzando una camera di conteggio manuale al microscopio (vedere Tabella dei materiali). Piastra circa 40.000 celle/cm2 in ciascun pozzetto preverniciato PLL in un volume di 1,5 ml di AM caldo.</li>
	</ol></li>
	<li>Semina di periciti sui filtri di inserimento invertiti<ol><li>Aggiungere 250 μL di soluzione di collagene di tipo I (100 μg/ml) sui filtri dell'inserto invertiti, posti alla periferia di un piatto coperto alto 25 mm (vedi Tabella dei materiali) usando una pinzetta sterile. Lasciare il rivestimento per 1 ora a RT in condizioni sterili. NOTA: Il piatto utilizzato deve essere sufficientemente alto da garantire il mantenimento della sterilità quando si è all'esterno della cappa ed evitare il contatto tra le soluzioni sul filtro rovesciato e il coperchio del piatto.</li>
		<li>Rimuovere accuratamente la soluzione di collagene di tipo I con una pipetta di vetro collegata a un sistema di aspirazione. Lavare due volte con 250 μL di RT DMEM HG e quindi rimuovere accuratamente tutta la soluzione dai filtri di inserimento. Lasciare i filtri dell'inserto rivestito a RT in condizioni sterili fino alla semina delle cellule. NOTA: Durante la procedura di rivestimento, fare attenzione a non toccare il filtro per evitare danni alla membrana. Una volta rivestiti con collagene di tipo I, i filtri dell'inserto possono essere conservati durante la notte presso RT.</li>
		<li>Il giorno dell'impostazione della tricoltura, lavare i periciti due volte con 10 ml di 1X PBS-CMF caldo e incubare le cellule con 2 ml di tripsina calda. Monitorare l'azione della tripsina osservando le cellule al microscopio. Una volta che le cellule iniziano a staccarsi, rimuovere la tripsina e aggiungere 5 ml di ECM caldo prima della dissociazione meccanica.</li>
		<li>Contare le cellule diluendo 20 μL della sospensione cellulare in 80 μL di 1X PBS-CMF utilizzando una camera di conteggio manuale al microscopio e seminare 44.500 cellule/cm 2 sui filtri per inserti invertiti preverniciati in un volume di 250 μL. Conservare i filtri inserto in un incubatore umidificato a 37 °C per 3 ore sotto il 5% di CO 2 e il 21% di O 2.</li>
		<li>Capovolgere con attenzione i filtri degli inserti utilizzando una pinzetta sterile in una piastra a 12 pozzetti contenente 1,5 ml di ECM/pozzetto caldo. I filtri di inserimento sono ora pronti per essere rivestiti sull'altro lato.</li>
	</ol></li>
	<li>Semina delle cellule endoteliali sui filtri degli inserti<ol><li>Rivestire il lato superiore dei filtri a inserto con 500 μL di idrogel a base di matrice extracellulare (1/48 v/v) (vedi Tabella dei materiali). Dopo 1 ora, in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO 2 e il 21% di O2, lavare una volta con 500 μL di RT DMEM HG.</li>
		<li>Lavare una volta con 10 ml di 1X PBS-CMF caldo e incubare le cellule con 2 ml di tripsina calda. Una volta che le cellule iniziano a staccarsi, rimuovere la tripsina e aggiungere 5 ml di ECM caldo prima della dissociazione meccanica.</li>
		<li>Contare le cellule diluendo 20 μL della sospensione cellulare in 80 μL di 1X PBS-CMF utilizzando una camera di conteggio manuale al microscopio e seminare le EC ad una densità di 71.500 cellule/cm2 sui filtri a inserto preverniciato in un volume di 500 μL di ECM caldo.</li>
		<li>Sostituire AM con 1,5 ml di ECM/pozzetto caldo e quindi trasferire i filtri di inserimento seminati (EC + periciti) sui pozzetti contenenti gli astrociti.</li>
		<li>Collocare i sistemi di celle di tricoltura in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO 2 e il 21% di O2.</li>
	</ol></li>
	<li>Mantenimento della coltura a tripla cellula per l'induzione delle proprietà della BEE NOTA: Per l'induzione delle proprietà BBB nelle CE, sono necessari 6 giorni di tripla coltura.<ol><li>Rinnovare il mezzo a giorni alterni fino al giorno 6, togliendo con cura il mezzo dallo scomparto superiore e inferiore utilizzando una pipetta di vetro collegata con un sistema di aspirazione.</li>
		<li>Sostituire rapidamente con ECM caldo in un volume di 500 μL nel compartimento superiore e 1,5 ml nel compartimento inferiore e rimettere le celle in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO 2 e il 21% di O2.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Validazione del fenotipo della BBB
NOTA: Dopo 6 giorni di tripla coltura, il tempo necessario per indurre il fenotipo BBB nelle CE, il modello umano di BBB è pronto per gli esperimenti. L'integrità fisica delle cellule endoteliali simili al cervello (BLEC) viene visualizzata dalla colorazione in immunofluorescenza delle proteine TJ valutate utilizzando il saggio di permeabilità ai marcatori di integrità della BBB. La validazione del fenotipo della BEE include anche l'analisi dell'espressione genica/proteica e la funzionalità delle pompe di efflusso secondo la procedura descritta in Deligne et al.,23. I periciti e gli astrociti sono visualizzati dai rispettivi marcatori di colorazione secondo la procedura descritta in Deligne et al. 202023.
<ol><li>Colorazione con immunofluorescenza<ol><li>Fissare i filtri di inserimento e gli astrociti in metanolo/acetone ghiacciato (50/50 v/v) per 1 minuto e lavare due volte con RT 1X PBS-CMF.</li>
		<li>Separare accuratamente il filtro dall'inserto tagliando la membrana usando un bisturi. Eseguire immunocitochimica sulla membrana e sui pozzetti di fondo secondo Deligne et al.23. NOTA: Per la fase di blocco, utilizzare 250 μL di buffer di blocco SEA BLOCK (vedere la tabella dei materiali) per 30 minuti su RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggio di integrità della BBB<ol><li>Valutare l'integrità fisica dei BREC mediante un test di permeabilità utilizzando marcatori di integrità BBB con diversi pesi molecolari, come la fluoresceina di sodio (NaF) e il destrano 20 kDa (FD20) (vedi Tabella dei materiali). NOTA: L'esperimento può essere eseguito secondo la procedura descritta in Deligne et al.23.</li>
	</ol></li>
	<li>Funzionalità della pompa di efflusso<ol><li>Valutare la funzionalità della glicoproteina P (P-gp) e della proteina di resistenza al cancro al seno (BCRP) misurando l'accumulo intracellulare di Rhodamine 123 (R123) con e senza Elacridar, un inibitore della P-gp e del BCRP (vedere Tabella dei materiali). NOTA: L'esperimento può essere eseguito secondo la procedura descritta in Deligne et al.23.</li>
	</ol></li>
	<li>Espressioni geniche e proteiche<ol><li>Eseguire la raccolta di campioni di geni e proteine su ghiaccio dopo un rapido lavaggio con Ringer HEPES (RH) a freddo (Tabella 1) delle cellule. Prima della raccolta del campione EC, raschiare via i periciti dai filtri a inserto invertito20.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Trasporto di nanogel
NOTA: Per stimare il passaggio di nanogel polimerici (NG) dal compartimento luminale a quello abluminale del modello BLEC di tricoltura, sono stati aggiunti 0,1 mg/ml di soluzione NG al giorno 6 sul compartimento luminale per 24 ore. I NG studiati sono stati marcati fluorescentmente idrogel a base di N-isopropilacrilammide (NIPAM) con una dimensione media di 8-10 nm (vedi Tabella dei materiali).
<ol><li>Pesare la polvere di nanogel e solubilizzarla in ECM ad una concentrazione di 1 mg/ml. Sonicare la soluzione per 10 minuti e filtrare utilizzando un filtro PTFE da 0,2 μm. NOTA: Preparare una nuova soluzione NG il giorno dell'esperimento.</li>
	<li>Cambiare il mezzo nel compartimento luminale e aggiungere 50 μL di soluzione di NGs nel compartimento superiore per una concentrazione finale di 0,1 mg/ml. NOTA: Eseguire una diluizione di 1:10 dalla soluzione originale.</li>
	<li>Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere le aliquote dai compartimenti luminale (20 μL) e abluminale (200 μL) e posizionarle in una piastra nera da 96 pozzetti.</li>
	<li>Quantificare la fluorescenza utilizzando un lettore multiplo fluorescente (vedi Tabella dei materiali) con una piastra nera a 96 pozzetti utilizzando l'impostazione delle lunghezze d'onda di eccitazione/emissione a 477/540 nm. Calcolare la percentuale di attraversamento riferita alla soluzione di lavoro iniziale aggiunta al tempo = 0 h (t0)6,15. NOTA: Per preparare la piastra a 96 pozzetti per la misurazione della fluorescenza, aggiungere 200 μL di soluzione dal compartimento abluminale e 20 μL di soluzione dal compartimento luminale e la preparazione t0 (aggiungere 180 μL di ECM per ottenere un volume finale di 200 μL). Includi anche una curva di calibrazione e uno spazio vuoto sulla piastra di lettura. Parametri strumentali: Metodo di rilevamento - Fluorescenza, Posizione ottica - Top, Tipo di lettura - Endpoint, Lunghezza d'onda di eccitazione - 477 nm, Lunghezza d'onda di emissione - 540 nm, Sensibilità - 100, Agitazione - Doppio orbitale per 5 s.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37, 13-25 (2010).</li>
<li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%3A+Important+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (4), 20190062(2020).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (3), 437-449 (2013).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+central+nervous+system+by+polymeric+nanoparticles%3A+What+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 71, 2-14 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Mehta, A., Tong, Z., Esser, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+W+%22L.Advanced+science%22">L.Advanced science</a>. 8 (10), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2003937(2021).</li>
<li>Vashist, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogels+as+potential+drug+nanocarriers+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Nanogels as potential drug nanocarriers for CNS drug delivery.</a> Drug Discovery Today. 23 (7), 1436-1443 (2018).</li>
<li>Lombardo, S. M., Schneider, M., Türeli, A. E., Günday Türeli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+for+crossing+the+BBB+with+nanoparticles%3A+The+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+Journal+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Key for crossing the BBB with nanoparticles: The rational design.</a> Beilstein Journal of Nanotechnology. 11, 866-883 (2020).</li>
<li>Bernardo-Castro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+nanoparticles+for+the+different+phases+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Therapeutic nanoparticles for the different phases of ischemic stroke.</a> Life. 11 (6), Basel, Switzerland. 482(2021).</li>
<li>Salinas, Y., Castilla, A. M., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+L-proline+based+thermoresponsive+and+pH-switchable+nanogel+as+a+drug+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An L-proline based thermoresponsive and pH-switchable nanogel as a drug delivery vehicle.</a> Polymer Chemistry. 9 (17), 2271-2280 (2018).</li>
<li>Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+crosslinked+nanogels%3A+An+NMR+study+of+the+effect+of+monomer+reactivity+on+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure.</a> Polymers. 11 (2), 353(2019).</li>
<li>Preman, N. K., Jain, S., Johnson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9DSmart%E2%80%9D+polymer+nanogels+as+pharmaceutical+carriers%3A+A+versatile+platform+for+programmed+delivery+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">”Smart” polymer nanogels as pharmaceutical carriers: A versatile platform for programmed delivery and diagnostics.</a> ACS Omega. 6 (8), 5075-5090 (2021).</li>
<li>Cuggino, J. C., Blanco, E. R. O., Gugliotta, L. M., Alvarez Igarzabal, C. I., Calderón, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+biological+barriers+with+nanogels+to+improve+drug+delivery+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Crossing biological barriers with nanogels to improve drug delivery performance.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 307, 221-246 (2019).</li>
<li>Basso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-based+drug+delivery+nanosystems+for+the+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Gels%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-based drug delivery nanosystems for the treatment of brain tumors.</a> Gels. 4 (3), Basel, Switzerland. 62(2018).</li>
<li>Harilal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+blood-brain+barrier%3A+A+hard+nut+to+crack+in+the+transportation+of+drug+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Revisiting the blood-brain barrier: A hard nut to crack in the transportation of drug molecules.</a> Brain Research Bulletin. 160, 121-140 (2020).</li>
<li>Papadimitriou, S. A., Robin, M. P., Ceric, D., O'Reilly, R. K., Marino, S., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+polymeric+nanovehicles+for+neural+stem+cell+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Fluorescent polymeric nanovehicles for neural stem cell modulation.</a> Nanoscale. 8 (39), 17340-17349 (2016).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+blood-brain+barrier+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).</li>
<li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+in+vitro+techniques+for+blood-brain+barrier+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An overview of in vitro techniques for blood-brain barrier studies.</a> Methods in Molecular Medicine. 89, 307-324 (2003).</li>
<li>Shimizu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+pericytes+modify+the+blood-nerve+barrier+function+and+tight+junctional+molecules+through+the+secretion+of+various+soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve pericytes modify the blood-nerve barrier function and tight junctional molecules through the secretion of various soluble factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (1), 255-266 (2011).</li>
<li>Pedroso, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival%2C+vascular+differentiation+and+wound+healing+potential+of+stem+cells+co-cultured+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells.</a> PLoS One. 6 (1), 16114(2011).</li>
<li>Kanda, T., Iwasaki, T., Yamawaki, M., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+bovine+endothelial+cells+of+endoneurial+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of bovine endothelial cells of endoneurial origin.</a> Journal of Neuroscience Research. 49 (6), 769-777 (1997).</li>
<li>Data sheet on human astrocytes culture. Technical resources from ScienCell. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources">https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources</a> (2021).</li>
<li>Deligne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+in+vitro+blood-brain+tumor+barrier+model+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+to+better+understand+the+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Development of a human in vitro blood-brain tumor barrier model of diffuse intrinsic pontine glioma to better understand the chemoresistance.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 37(2020).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), 99733(2014).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+physiology+to+disease+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From physiology to disease and back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
<li>Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+Physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Heymans, M., Figueiredo, R., Dehouck, L., Francisco, D., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Bruggmann, R., Engelhardt, B., Winter, P., Gosselet, F., Maxime, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+brain+pericytes+in+blood-brain+barrier+formation+and+maintenance%3A+A+transcriptomic+study+of+co-cultured+human+endothelial+cells+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Contribution of brain pericytes in blood-brain barrier formation and maintenance: A transcriptomic study of co-cultured human endothelial cells derived from hematopoietic stem cells.</a> Fluids Barriers CNS. 17, 48(2020).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models of the Blood-Brain Barrier.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 265, 75-110 (2021).</li>
<li>Hoheisel, D., Nitz, T., Franke, H., Wegener, J., Hakvoort, A., Tilling, T., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+reinforces+the+blood-brain+properties+in+a+serum+free+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 247 (2), 312-315 (1998).</li>
<li>Drolez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+relevant+in+vitro+blood-brain+barrier+model+to+investigate+pro-metastatic+features+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Selection of a relevant in vitro blood-brain barrier model to investigate pro-metastatic features of human breast cancer cell lines.</a> PloS One. 11 (3), 0151155(2016).</li>
<li>Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Förster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+role+of+astrocytes+in+an+in+vitro+stroke+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352(2014).</li>
<li>Mysiorek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B1+activation+protects+brain+capillary+endothelial+cells+from+oxygen-glucose+deprivation-induced+hyperpermeability+in+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects brain capillary endothelial cells from oxygen-glucose deprivation-induced hyperpermeability in the blood-brain barrier.</a> Current Neurovascular Research. 6 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Culot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+protection+as+a+possible+mechanism+for+the+protective+effects+of+NXY-059+in+preclinical+models%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular protection as a possible mechanism for the protective effects of NXY-059 in preclinical models: An in vitro study.</a> Brain Research. 1294, 144-152 (2009).</li>
<li>Vandenhaute, E., Drolez, A., Sevin, E., Gosselet, F., Mysiorek, C., Dehouck, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+co-culture+in+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+use+in+cancer+research%3A+Maintaining+an+appropriate+endothelial+monolayer+for+the+assessment+of+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adapting co-culture in vitro models of the blood-brain barrier for use in cancer research: Maintaining an appropriate endothelial monolayer for the assessment of transendothelial migration.</a> Laboratory Investigation. 96 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+Blood-Brain+Barrier+endothelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology.</a> BMC Neuroscience. 12, 40(2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Il trattamento delle malattie cerebrali rimane una sfida considerando la difficoltà dei farmaci di superare la BBB per raggiungere i loro obiettivi cellulari e molecolari nel parenchima cerebrale.
Lo sviluppo di farmaci per le malattie cerebrali mostra attualmente un basso tasso di successo poiché la maggior parte dei farmaci che mostrano risultati promettenti nei modelli preclinici non hanno mostrato alcun beneficio quando utilizzati in clinica. Seguendo la "regola delle 3R", che mira a ridurre il numero di animali utilizzati per la sperimentazione, vengono sviluppati modelli in vitro della BBB per studiare le patologie cerebrali e prevedere la penetrazione cerebrale dei farmaci29. I modelli in vitro di BBB sono stati sviluppati principalmente utilizzando cellule animali e sono diventati più sofisticati per migliorare la rilevanza dei risultati ottenuti16. Uno dei progressi significativi nell'uso delle cellule umane, che porta innegabili nuove intuizioni e maggiore specificità, a livello cellulare e molecolare, per studiare i meccanismi delle malattie umane16. Tuttavia, lo sviluppo di modelli pertinenti richiede di considerare il miglioramento delle impostazioni del modello in vitro della BBB e le conoscenze che ne derivano, grazie ai modelli animali. Quindi, è necessario considerare la complessità dell'architettura della BEE e l'importanza delle comunicazioni cellula-cellula per studiare la BBB in condizioni fisiologiche e patologiche30.
Il protocollo qui presentato descrive un metodo per impostare un modello umano completo di BBB in vitro comprendente i tre principali tipi di cellule della BEE, senza limitazioni di accesso al tessuto cerebrale. Come sistema a cellule multiple, l'induzione e il mantenimento delle proprietà della BEE, senza l'uso artificiale di composti di serraggio, ma invece indotti dalle comunicazioni cellula-cellula, sono più fisiologicamente rilevanti e in linea con l'induzione in vivo delle proprietà della BEE31. Pertanto, il rispetto della cronologia del protocollo è di primaria importanza per il successo del protocollo. Inoltre, i tempi di incubazione durante l'impostazione della tripla coltura e una volta assemblati i tre tipi di cellule rappresentano i principali passaggi critici del protocollo.
Le proprietà BBB nelle EC sono indotte dalla co-coltura con periciti, come descritto per il modello di co-coltura24. Quindi, la coltura di periciti sul retro del filtro inserto è il punto più critico e richiede di seguire rigorosamente il protocollo a rischio di non avere abbastanza periciti per l'induzione delle proprietà della BEE. Prima di tutto, durante la procedura di rivestimento e anche la semina cellulare, bisogna fare attenzione a non avere il coperchio della capsula di Petri a contatto con il rivestimento e anche il mezzo una volta che le cellule sono seminate per garantire un buon rivestimento del filtro e non perdere cellule (passaggi 2.2.1 e 2.2.4). Inoltre, una volta seminati i periciti, è essenziale attendere il tempo indicato per l'attacco dei periciti (punto 2.2.4) prima di invertire il filtro di inserimento per il rivestimento e la semina delle EC sull'altro lato (punti 2.2.5 e 2.3). Una volta seminato, sono necessari sei giorni per indurre le proprietà della BEE attraverso le comunicazioni cellula-cellula (fase 2.4).
Il modello è convalidato in termini di permeabilità limitata (associata all'impostazione delle giunzioni strette) poiché le EC del modello di tripla coltura mostrano valori di permeabilità ai marcatori di integrità della BEE simili al modello di co-coltura convalidato e misurati anche in modelli animali o umani convalidati 16,27,32. Inoltre, la validazione di un modello in vitro di BBB richiede, oltre alla limitata permeabilità, la reattività ad altri tipi cellulari della NVU e l'espressione di recettori e trasportatori funzionali16. Inoltre, il modello è riproducibile e produce più filtri e pozzetti per eseguire numerose analisi (espressione genica e proteica, colorazione fluorescente, test di tossicità) su ciascun tipo di cellula separatamente senza richiedere un metodo di selezione cellulare.
Il modello è stato sviluppato utilizzando un filtro di dimensioni dei pori da 0,4 μm per avere un tipo di cella su ciascun lato del filtro inserto. Il sistema di filtraggio a inserto ha permesso lo studio delle comunicazioni cellula-cellula in condizioni fisiologiche trasferendole su astrociti ben contenenti. La presenza di astrociti nel sistema rappresenta un valore aggiunto rispetto alla co-coltura iniziale in vitro modello24. Infatti, considerando l'importanza degli astrociti nella fisiologia della BEE, questo terzo tipo di cellula consente un'ulteriore comprensione delle comunicazioni cellula-cellula all'interno della BBB. Inoltre, il sistema di coltura a tripla cellula può essere studiato anche in condizioni patologiche come l'ictus, in cui gli astrociti svolgono un ruolo essenziale33,34,35. Inoltre, il design di BLEC / periciti su entrambi i lati del filtro inserto può essere facilmente posizionato su altri tipi di cellule per imitare condizioni patologiche come il cancro al cervello23.
La dimensione dei pori del filtro dell'inserto può portare limitazioni con alcuni esperimenti, come la trasmigrazione cellulare attraverso la BBB. Tuttavia, lo sviluppo del modello con una dimensione dei pori più grande richiede l'adattamento del protocollo per garantire la formazione di un monostrato fisiologico di EC e non di strati multipli, che non è fisiologicamente rilevante per imitare la BBB36.
L'applicabilità del modello è stata dimostrata utilizzando l'esperimento di trasporto NGs che mostra la possibilità di fare esperimenti di trasporto utilizzando un sistema multicellulare. Tuttavia, si dovrebbe essere consapevoli delle difficoltà nell'avere un composto o una molecola di controllo per l'esperimento di trasporto, condividendo proprietà comparabili con i NG poiché ogni nanostruttura presenta un insieme unico di proprietà (peso molecolare, carica, forma, proprietà fisiche, formazione di corona proteiche).
Una limitazione del modello è l'assenza di sforzo di taglio, che ha dimostrato di influenzare la differenziazione delle EC e l'espressione delle proteine TJ37. Tuttavia, lo sviluppo di un sistema fluidico che imita il capillare cerebrale è impegnativo considerando la complessità dell'aggiunta di una parte fluidica, che richiede un dispositivo specifico, in un sistema a più cellule. Inoltre, il particolare dispositivo di solito non è disponibile in commercio e non consente molte repliche, rendendo così i sistemi fluidici meno adatti per l'uso ad alta produttività.
In sintesi, questo triplo sistema di coltura costituito da cellule umane riproduce in vitro l'architettura della BBB. Consente la generazione di molti inserti che possono essere utilizzati per uno screening approfondito dei composti.

La BBB, localizzata a livello delle cellule endoteliali capillari cerebrali (ECs), controlla e regola l'accesso al parenchima cerebrale, che è cruciale per mantenere l'omeostasi cerebrale e la funzione delle cellule neurali 1,2. Tuttavia, nel caso della patologia cerebrale, la mancanza di accesso al parenchima cerebrale rappresenta un vero ostacolo allo sviluppo di strategie terapeutiche.
Le EC della BBB possiedono un complesso insieme di proprietà, tra cui proteine a giunzione stretta (TJ), che sigillano lo spazio intercellulare, associate a un sistema di pompe di eflusso, trasportatori specifici e recettori, che controllano la via transcellulare 1,2,3. Inoltre, tutte queste proprietà sono indotte e mantenute, grazie alle comunicazioni con i periciti incorporati nella membrana basale della BEE EC e gli astrociti, le cui estremità dei piedi circondano i capillari cerebrali 1,2,3. Quindi, studiare la BBB in vitro è una sfida considerando la complessità della sua architettura e le comunicazioni tra i diversi tipi di cellule che costituiscono l'unità neurovascolare (NVU)2. Inoltre, i diversi tipi di cellule sono cruciali per l'induzione e il mantenimento delle proprietà della BEE e di conseguenza influenzano la previsione dell'incrocio attraverso la BBB. Diverse strategie per la somministrazione di farmaci al cervello sono già state testate utilizzando un ampio pannello di tattiche per aggirare le proprietà limitate della BBB4. Più recentemente, con il progresso delle nanotecnologie, vengono sviluppati nuovi materiali per applicazioni come vettori di farmaci 5,6. Oltre al loro carico più elevato, alla ridotta tossicità e all'aumento della biodisponibilità dei farmaci, questi nuovi nanomateriali possono essere funzionalizzati per una strategia di cavallo di per attraversare la BEE e colpire specificamente le cellule nel parenchima 5,6. Tra i diversi tipi di nanomateriali valutati, i nanogel hanno attirato una notevole attenzione, principalmente grazie alle loro proprietà colloidali e alla capacità di adattare la struttura chimica per introdurre proprietà sensibili agli stimoli 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
I modelli in vitro sono ora sviluppati per studi preclinici che utilizzano cellule umane per prevedere la penetrazione cerebrale dei farmaci16. Sono disponibili diverse impostazioni di questi modelli, dai monostrati di EC cerebrali ai sistemi cellulari multipli16. Considerando l'importanza delle cellule NVU nell'induzione e nel mantenimento della BEE e la risposta coordinata all'ambiente patologico, i modelli in vitro di BBB devono considerare tutti questi protagonisti per migliorare la rilevanza della previsione 2,17.
Il metodo attuale descrive la creazione di un modello in vitro di tripla coltura della BBB umana, che è completamente sviluppato con cellule umane per studiare specifici meccanismi cellulari e molecolari umani. Per essere fisiologicamente rilevante, il modello è costituito dai tre principali attori cellulari della BEE (ECs, periciti e astrociti) necessari per indurre e mantenere le proprietà della BEE, senza l'uso di composti di serraggio e mostrando un insieme di proprietà richieste per essere considerato come un modello in vitro di BBB16,18. Il modello è impostato in una configurazione che delimita il compartimento sanguigno e cerebrale, adatta per studi preclinici sul trasporto di farmaci e particelle per prevedere la penetrazione cerebrale. L'utilità del modello è illustrata misurando il trasporto di nanogel polimerici.

<table><tbody><tr><td><forte>Coltura cellulare</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno astocitario (AM)</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Integratore per la crescita degli astrociti</td><td>ScienCell&nbsp;</td>Il <td>supplemento per la crescita degli astrociti 1852 è fornito nel set AM.</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari 100 mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430293</td><td>100 mm x 20 mm; piatto utilizzato per lo scongelamento di EC e PC prima dell'impostazione della tricoltura</td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare 150 mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430599</td><td>L'altezza di queste piastre (25 mm) consente la semina dei PC nell'inserto rovesciato per l'impostazione del modello di tricoltura.</td></tr><tr><td>Collagene I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Coda di ratto&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle</td><td>Medium Gibco</td><td>31600-083</td><td>Integratore</td></tr> per <tr><td>la crescita delle cellule endoteliali</td><td>in polvere ScienCell&nbsp;</td><td>L'integratore per</td><td>la crescita delle cellule endoteliali 1051 è fornito nel set ECM.</td></tr><tr><td>Terreno cellulare endoteliale (ECM)</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G2500</td><td>2% gelatina da pelle suina in PBS-CMF</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>BiochromA6</td><td>A-2712</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Merck</td><td>1002891000</td><td></td></tr><tr><td>Corteccia cerebrale umana Astrociti</td><td>ScienCell&nbsp;</td>Camera di conteggio delle cellule <td>Malassez 1800-SC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>vWR</td><td>HECH40453702</td><td>Il conteggio è stato eseguito manualmente.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Idrogel a base di matrice extracellulare</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>La soluzione 0503</td><td>di penicillina/streptomicina è fornita nei set ECM e AM.</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0413</td><td></td></tr><tr>Sistema<td>Steritop</td><td>Millipore</td><td>SCGPT0SRE</td><td>0,22 &micro; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Inserto Transwell&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>0,4 & micro; filtro in policarbonato m pore&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di neutralizzazione tripsina/EDTA</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0113</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina/EDTA</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0103</td><td></td></tr><tr><td>Immunocitochimica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEA BLOCK tampone bloccante</td><td>ThermoScientific</td><td>37527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anticorpo secondario di topo</td><td>Thermofisher</td><td>A11031</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anticorpo secondario di coniglio</td><td>Thermofisher</td><td>A11036</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-claudina-5</td><td>InVitrogen</td><td>34-1600</td><td>Diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-desmina</td><td>Abcam</td><td>ab6322</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo primario della proteina acida fibrillare gliale</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Fattore di crescita derivato dalle piastrine-&beta; anticorpo primario</td><td>Abcam</td><td>ab51090</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-VE-caderina</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Zona Occludens-1 anticorpo primario</td><td>InVitrogen</td><td>61-7300</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPI</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Espressione genica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,933,250</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetto multipiastra</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>iSCRIPT Biorad</td><td></td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>foglio sigillante&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td>Espressione proteica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Laemli Sample Buffer</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td>Add 50 &micro; L di bMercaptoetanolo a 950 &micro; L di tampone Laemmli e conservare a -20°C. Diluire 1:1 con il campione proteico per il saggio.</td></tr><tr><td>Anticorpo primario della proteina di resistenza al cancro al seno</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>Pre-trattamento 15 minuti a RT sotto agitazione; diluizione 1:1000, O.N. a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-claudina-5</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>Pre-trattamento 5 minuti a 95 gradi C; diluizione 1:1000, O.N. a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Anti-Glucose Transporter 1 anticorpo primario</td><td>Millipore</td><td>07-1401</td><td>Pre-trattamento 5 minuti a 95 gradi C; diluizione 1:1000, O.N. a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo</td><td>Dako</td><td>P0447</td><td>Diluizione 1:5000 in TBS-Tween</td></tr><tr><td>Anti-glicoproteina anti-glicoproteina primaria</td><td>Genetex</td><td>GTX23364</td><td>Pre-trattamento 15 minuti a RT sotto agitazione; diluizione 1:400, 3 ore a RT</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>Diluizione 1:8000 in TBS-Tween</td></tr><tr><td>Anti-Transferrin Receptor anticorpo primario</td><td>Abcam</td><td>ab84036</td><td>Pre-trattamento 5 minuti a 95&deg; C; diluizione 1:1000, O.N. a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Anti-Zona occludens-1 anticorpo primario</td><td>Abcam</td><td>ab216880</td><td>Pre-trattamento 5 minuti a 95&deg; C; diluizione 1:1000, O.N. a 4 gradi; </td></tr><tr><td>C Criterio TGX Gel&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>5678083</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Solution</td><td>Amersham&nbsp;</td><td>RPN2236</td><td>Soluzione di rivelazione per tenere al buio</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosspatasi 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosspatasi 3</td><td>Sigma</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Standard proteici</td><td>Biorad</td><td>161-0373</td><td>Marcatori di peso molecolare</td></tr><tr><td>RIPA 10x</td><td>Millipore</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>Biorad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-Glycine</td><td>Biorad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>BBB integrity assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluorescein</td><td>Ampresco</td><td>0681</td><td>&lambda; es= 490 nm; &lambda; em= 525 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Elacridar</td><td>Sigma</td><td>SML0486</td><td>GF120918</td></tr><tr><td>FITC-Destrano 20 kDa</td><td>Sigma</td><td>FD-20S</td><td>&lambda; es= 490 nm; &lambda; em=&nbsp; 525 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Rodamina 123</td><td>Sigma</td><td>R8004</td><td>&lambda; es= 501 nm; &lambda; em= 538 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>SynergyTM H1&nbsp;</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>Lettore multipiastra fluorescente</td></tr><tr><td>Nanogel Transport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Terumo</td><td>SS+01T1</td><td>1 mL siringa&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro</td><td>FisherScientific</td><td>15161499</td><td>0,2 &; micro; m Filtro a membrana in PTFE,</td></tr><tr><td>idrogel a base di N-isopropilacrilammide (NIPAM) di 15 mm di diametro. &nbsp;</td><td></td><td></td><td>I nanogel (NG) utilizzati nello studio sono forniti dal nostro collaboratore presso la Queen Mary University di Londra, Dipartimento di Chimica. Gli NG sono marcati in modo covalente con una molecola fluorescente (&lambda; es= 477 nm; &lambda; em= 540 nm). Gli NG vengono liofilizzati e spediti in polvere, in questo stato sono stabili a temperatura ambiente per un lungo periodo di tempo.</td></tr></tbody></table>

un sistema di cellule a tripla coltura che modella la barriera emato-encefalica umana

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

La somministrazione di farmaci al cervello rimane una sfida a causa delle proprietà altamente specifiche e restrittive della barriera emato-encefalica (BBB), che controlla e limita l'accesso al parenchima cerebrale. Tuttavia, con lo sviluppo delle nanotecnologie, sono stati sviluppati grandi pannelli di nuovi nanomateriali per migliorare la somministrazione di farmaci, evidenziando la necessità di microsistemi in vitro affidabili per prevedere la penetrazione cerebrale nell'ambito dei saggi preclinici. Ecco un metodo semplice per impostare un sistema microfisiologico per modellare la BBB utilizzando esclusivamente cellule umane. Nella sua configurazione, il modello consiste in una tripla coltura che include cellule endoteliali simili al cervello (BLEC), periciti e astrociti, i tre principali attori cellulari della BEE necessari per indurre e regolare le proprietà della BEE in modo più fisiologico senza la necessità di stringere i composti. Il modello sviluppato in un formato a piastra a 12 pozzetti, pronto dopo 6 giorni di tripla coltura, è caratterizzato da proprietà fisiche, espressioni geniche e proteiche e utilizzato per la misurazione del trasporto di nanogel polimerici. Il modello può essere utilizzato per una vasta gamma di esperimenti in condizioni sane e patologiche e rappresenta un valido strumento per valutazioni precliniche del trasporto di molecole e particelle, nonché del traffico intercellulare e intracellulare.

Impostazione del modello BBB della tripla cultura umana Il protocollo richiesto per l'impostazione del modello umano di BBB in vitro è descritto in Figura 1 e comprende passaggi successivi il cui ordine deve essere rigorosamente rispettato. In primo luogo, i tre tipi di cellule vengono coltivati singolarmente in piastre di coltura cellulare (Figura 1A) prima di essere assemblati in un sistema di filtri a inserto. L'impostazione della tripla coltura inizia con la semina del primo tipo di cellula, gli astrociti, nel pozzetto inferiore pre-rivestito. Il giorno seguente, i periciti e le EC vengono seminati rispettivamente sulle superfici abluminali e luminali pre-rivestite del filtro inserto. Il filtro dell'inserto viene quindi trasferito sugli astrociti. Il modello viene mantenuto in coltura per 6 giorni, il tempo necessario per indurre le proprietà BBB in EC, con un rinnovo del terreno a giorni alterni secondo il modello di co-coltura brevettato24. Le EC vengono quindi rinominate come BLEC (Figura 1B).
Caratterizzazione del modello umano di BBB Il modello di coltura a tripla cellula è stato caratterizzato per la presenza di un insieme di proprietà specifiche della BBB. Prima di tutto, i dati immunocitochimici hanno confermato l'espressione di marcatori convenzionali come il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine β (PDGFR-β)25,26 e la desmina per i periciti e la proteina acida fibrillare gliale (GFAP)26 per gli astrociti (Figura 2A). Quindi, dopo i 6 giorni di coltura con i periciti e gli astrociti, il monostrato di BLEC, visualizzato con la colorazione di giunzione aderente di VE-Cadherin, mostra una localizzazione continua delle proteine TJ, Claudin-5 e ZO-1, ai bordi cellulari (Figura 2A). La configurazione dei TJ è correlata con bassi coefficienti di permeabilità paracellulare misurati utilizzando marcatori di integrità BBB a basso peso molecolare, cioè NaF (376 Da)16,27 e ad alto peso molecolare, cioè FD20 (20 kDa)27, come mostrato in Figura 2B. I valori misurati sono comparabili con i modelli in vitro BBB convalidati utilizzando la fonte esatta di EC23,24,28. Complessivamente, questi risultati evidenziano la bassa permeabilità paracellulare del monostrato BLEC a tripla coltura, che è caratteristico della BBB in vivo. Inoltre, l'accumulo intracellulare di R123 nei BLEC ha mostrato un aumento significativo della presenza dell'inibitore della pompa di efflusso Elacridar 23,24 rispetto alla condizione di controllo con la sua assenza (Figura 2C). Ciò indica la presenza di molecole attive della pompa di eflusso, vale a dire P-gp e BCRP, nei BLEC.
Per caratterizzare ulteriormente i BLEC, sono stati studiati l'espressione genica e il livello proteico delle caratteristiche chiave della BBB (Figura 3). I dati ottenuti con il modello di tripla coltura sono stati confrontati con il modello di co-coltura validato e brevettato costituito da EC e periciti24 utilizzati come modello di controllo. Gli astrociti rappresentano il terzo tipo di cellula aggiunto nel modello di co-coltura iniziale nel modello di tripla coltura. Quindi, l'analisi dell'espressione genica (Figura 3A) dei BLEC a tripla coltura, confrontata con i BLEC di co-coltura, ha mostrato il mantenimento dell'espressione di caratteristiche chiave della BBB come le proteine TJ (claudina-5 e zonula occludens-1) e le pompe di efflusso (P-gp e BCRP), e la sovraregolazione della maggior parte dei trasportatori BBB studiati (trasportatore del glucosio 1) e dei recettori (recettore della transferrina). I dati di quantificazione delle proteine (Figura 3B) sono risultati essere in linea con i risultati trascrizionali. Nel complesso, questi dati supportano l'induzione positiva delle proprietà della BBB nello strato BLEC a tripla coltura simile al modello di co-coltura convalidato. Complessivamente, il modello di tripla coltura mostra le proprietà fisiche e metaboliche richieste per un sistema microfisiologico in vitro per modellare la BBB.
Applicabilità alle strategie di somministrazione di farmaci - misurazione del trasporto di nanogel Per valutare la possibilità di utilizzare il modello di tripla coltura per studiare nuove strategie di consegna del cervello, è stato valutato il trasporto di NG neutri basati su NIPAM marcati con fluorescenza 6,15. Al tempo 0, i NG sono stati collocati nel compartimento luminale ad una concentrazione di 0,1 mg/ml (Figura 4A). Dopo 24 ore di incubazione, il 5,82% dei NG è stato trovato nel compartimento abluminale (Figura 4B), dimostrando la loro capacità di attraversare i BLEC.
I risultati dimostrano l'idoneità del modello a misurare la permeabilità di composti piccoli e grandi, come descritto con i marcatori di integrità, e valutare il trasporto di nanomateriali come i GN polimerici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione dei passaggi critici per l'impostazione del modello in vitro di tripla coltura della BEE umana. (A) Immagini a contrasto di fase delle tre componenti cellulari del modello BEE: cellule endoteliali (EC), periciti (PC) e astrociti (AC). Barra di scala = 250 μm. (B) Timeline schematica e illustrativa per l'impostazione del modello in vitro di BBB umana a tripla coltura. La casella evidenziata rappresenta la procedura di rivestimento per il filtro dell'inserto invertito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig02.jpg"> Figura 2: Valutazione delle proprietà del modello BBB a tripla coltura. (A) Immagini immunocoloranti rappresentative dei marcatori distintivi per i BLEC (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 e VE-Cadherin: Ve-Cadh), periciti (Platelet-Derived Growth Factor Receptor-β: PDGFR-β e desmina) e astrociti (Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP). Barra di scala = 10 μm. (B) Permeabilità paracellulare dei BREC ai marcatori fluorescenti di integrità della BBB, fluoresceina di sodio (NaF, 376 Da, Pe: 0,61 ± 0,062) e FITC-destrano (FD20, 20 kDa, Pe: 0,04 ± 0,005). N = 3; n = 9. La funzionalità media ± SEM. (C) La funzionalità di P-gp e BCRP nelle EC è stata valutata quantificando R123 intracellulare con (124,2% ± 3,39%) e senza (100% ± 8,79%) Elacridar. N = 4; n = 12. Media ± SEM. p = 0,017 utilizzando un test t spaiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig03.jpg"> Figura 3: Valutazione dell'espressione genica BLEC e del livello proteico di marcatori distintivi nel modello di tripla coltura rispetto al modello BBB di co-coltura. (A) Espressione genica di proteine a giunzione stretta (Claudin-5: CLD5 e Zona Occludens-1: ZO1), trasportatori (Glucose Transporter-1: GLUT1, P-glycoprotein: PGP e Breast Cancer Resistance Protein: BCRP) e grandi recettori molecolari (Transferrin Receptor: TRFR), normalizzati dall'espressione di RPLP0. N = 3; n = 9. (B) Livello proteico di proteine a giunzione stretta (CLD5 e ZO1), trasportatori (GLUT1, PGP e BCRP) e recettori di grandi molecole (TRFR), normalizzati dall'espressione di β-actina. N = 3; n = 9. Media ± SEM. Per (A) e (B), i valori&gt;1 corrispondono a livelli più elevati di espressione genica o proteica nel modello di tripla coltura. La linea rossa corrisponde ad un valore di 1 dove il livello di espressione (geni o proteine) dei due modelli è equivalente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig04.jpg"> Figura 4: Misurazione del trasporto di nanogel nel modello di tripla coltura. (A) Rappresentazione schematica del saggio di trasporto del nanogel. (B) Percentuale di trasporto di nanogel dopo 24 ore di incubazione nel modello di tripla coltura (5,82% ± 0,09%). N = 2; n = 6. Media ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2" rowspan="2">Nome del buffer</td>
			<td colspan="3">Composizione</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Nota</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Peso molecolare</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Tampone fosfato soluzione salina, senza calcio e magnesio</td>
			<td rowspan="5">PBS-CMF</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8 g/L</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="5">Aggiungere tutto il composto in acqua sterile e attendere la completa solubilizzazione. Il pH della soluzione ottenuta deve essere compreso tra 7,3 e 7,4. Filtrare la soluzione con una membrana da 0,22 μm e conservare la soluzione sterile a 4 °C.</td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>0,2 g/L</td>
			<td>74.55</td>
		</tr><tr><td>KH2PO4</td>
			<td>0,2 g/L</td>
			<td>136.09</td>
		</tr><tr><td>NaHPO4-12 H2O</td>
			<td>2,87 g/L</td>
			<td>358.14</td>
		</tr><tr><td>Acqua</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="8">Ringer HEPES</td>
			<td rowspan="8">RH</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8,8 g/L</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="8">Aggiungere tutto il composto in acqua sterile e attendere la completa solublizzazione. Regolare il pH a 7,4 (pH della soluzione iniziale intorno a 6,8). Filtrare la soluzione con una membrana da 0,22 μm e conservare la soluzione sterile a 4 °C.</td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>0,387 g/L</td>
			<td>74.55</td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0,244 g/L</td>
			<td>110.99</td>
		</tr><tr><td>MgCl 2 6H2 O</td>
			<td>0,0406 g/L</td>
			<td>203.3</td>
		</tr><tr><td>NaHCO3</td>
			<td>0,504 g/L</td>
			<td>84.1</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>1,19 g/L</td>
			<td>238.3</td>
		</tr><tr><td>Glucosio</td>
			<td>0,504 g/L</td>
			<td>180.16</td>
		</tr><tr><td>Acqua</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione dei diversi buffer utilizzati nel protocollo.

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire un modello umano di barriera emato-encefalica (BBB) in vitro . Le cellule endoteliali e i periciti sono seminati su ciascun lato di un filtro inserto (compartimento sanguigno) e gli astrociti sono seminati nel pozzetto inferiore (compartimento cerebrale). Il modello caratterizzato è stato utilizzato per esperimenti di trasporto di nanoparticelle.

Un sistema di cellule a tripla coltura che modella la barriera emato-encefalica umana

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

La somministrazione di farmaci al cervello è rimasta una sfida. Lo sviluppo di grandi pannelli di nuovi nanomateriali per migliorare la consegna al cervello evidenzia la necessità di un vero microsistema in vitro per prevedere la penetrazione cerebrale nell'ambito dei saggi preclinici. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di ghiacciare gli effettivi cellulari del dolore libero della barriera ematoencefalica all'interno dello stesso sistema consentendo le comunicazioni cellulari necessarie per l'induzione del fenotipo della barriera ematoencefalica.Inoltre, ogni tipo di cellula può essere isolato separatamente per ulteriori analisi molecolari. Il modello può essere utilizzato per una vasta gamma di esperimenti in condizioni sane e patologiche e rappresenta un valido strumento per le valutazioni precliniche dei trasporti di molecole e particelle, nonché del traffico intercellulare e intracellulare. A dimostrare la procedura saranno la Dott.ssa Clemence Deligne e la Dott.ssa Eleonora Rizzi.Inizia codificando i pozzetti con 500 microlitri di due microgrammi per centimetro quadrato Soluzione di poli-L-lisina. Incubare durante la notte o per un minimo di un'ora a 37 gradi Celsius e rimuovere accuratamente la soluzione di poli-L-lisina con una pipetta di vetro collegata a un sistema di aspirazione. Quindi risciacquare due volte con acqua sterile.Per raccogliere gli astrociti, lavare prima gli astrociti una volta con 10 millilitri di 1X PBS CMF caldo. Incubarli per tre minuti con 10 millilitri di soluzione calda al 20% di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno. Staccare meccanicamente le celle dal pallone e trasferire la sospensione in un tubo conico contenente cinque millilitri di FCS caldo non diluito.Centrifugare la sospensione a 190 volte G per cinque minuti a 20 gradi Celsius. Risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno astrocitario caldo, quindi diluire 20 microlitri della sospensione cellulare con 80 microlitri di 1X PBS CMF. Contare le cellule usando una camera di conteggio manuale al microscopio.Piastra circa 40.000 cellule per centimetro quadrato in ogni poli-L-lisina pre-codificato bene in un volume di 1,5 millilitri di mezzo astrocitario caldo. Posizionare i filtri dell'inserto invertiti alla periferia di un piatto coperto alto 25 millimetri e aggiungere 250 microlitri di collagene tipo una soluzione ai filtri dell'inserto. Incubare a temperatura ambiente per un'ora.Quindi rimuovere con attenzione la soluzione di collagene di tipo uno con una pipetta di vetro collegata a un sistema di aspirazione. Lavare due volte con 250 microlitri di DMEM ad alto glucosio a temperatura ambiente e rimuovere accuratamente tutta la soluzione dai filtri dell'inserto. Lavare i periciti due volte con 10 millilitri di 1X PBS CMF caldo e incubare le cellule con due millilitri di tripsina calda.Osservare le cellule al microscopio per monitorare l'azione della tripsina. Quando le cellule iniziano a staccarsi, rimuovere la tripsina, quindi aggiungere cinque millilitri di mezzo basale a cellule endoteliali calde o ECM alle cellule e avviare la dissociazione meccanica. Diluire 20 microlitri della sospensione cellulare con 80 microlitri di 1X PBS CMF e contare le cellule utilizzando una camera di conteggio manuale al microscopio come mostrato in precedenza.Seme 44, 500 cellule per centimetro quadrato sui filtri di inserto invertiti precodificati in un volume di 250 microlitri. Mantenere i filtri dell'inserto in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per tre ore sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno. Utilizzare pinzette sterili per ripristinare attentamente i filtri di inserimento in una piastra a 12 pozzetti contenente 1,5 millilitri di ECM caldo per pozzetto.I filtri di inserimento sono ora pronti per essere rivestiti sull'altro lato. Rivestire il lato superiore e i filtri inserto con 500 microlitri di idrogel a base di matrice extracellulare. Posizionare i filtri inserto in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno per un'ora.Lavarli una volta con 500 microlitri di DMEM ad alto glucosio a temperatura ambiente. Lavare la coltura cellulare endoteliale una volta con 10 millilitri di CMF caldo 1X PBS e incubare le cellule con due millilitri di tripsina calda. Rimuovere la tripsina quando le cellule iniziano a staccarsi, quindi aggiungere cinque millilitri di ECM caldo e avviare la dissociazione meccanica.Diluire 20 microlitri della sospensione cellulare con 80 microlitri di 1X PBS CMF e contare le celle utilizzando una camera di conteggio manuale. Seminare le cellule endoteliali a una densità di 71.500 cellule per centimetro quadrato sui filtri di inserimento precodificati in un volume di 500 microlitri di ECM caldo. Sostituire il terreno astrocitario con 1,5 millilitri di ECM caldo per pozzetto.Quindi trasferire i filtri di inserimento seminati nei pozzetti contenenti gli astrociti. Posizionare i sistemi di celle di tricoltura in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno. Rimuovere con cautela il mezzo dallo scomparto superiore e inferiore utilizzando una pipetta di vetro collegata a un sistema di aspirazione.Sostituire il mezzo con ECM caldo in un volume di 500 microlitri nello scomparto superiore e 1,5 millilitri nello scomparto inferiore. Rinnovare il mezzo a giorni alterni fino al sesto giorno ripetendo la stessa procedura. Infine rimettere le celle in incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno.I dati immunocitochimici hanno confermato l'espressione di marcatori convenzionali come il recettore beta del fattore di crescita derivato dalle piastrine e la desmina per i periciti e la proteina acida fibrillare gliale per gli astrociti. Quindi, dopo sei giorni di coltura con i periciti e gli astrociti, il monostrato di cellule endoteliali simili al cervello o BLEC visualizzati con la colorazione di giunzione aderente di Ve-Cadherin mostra una localizzazione continua delle proteine TJ CLD5 e Z-01 ai bordi cellulari. La permeabilità paracellulare di BLECS ai marcatori di integrità fluorescenti della BBB, alla fluoresceina di sodio e al destrano FITC è mostrata qui.L'accumulo intracellulare di R123 nei BLEC ha mostrato un aumento significativo della presenza dell'inibitore della pompa di efflusso Elacridar rispetto alla condizione di controllo con la sua assenza. Ciò indica la presenza di molecole attive della pompa di efflusso vale a dire glicoproteina P e proteina di resistenza al cancro al seno o BCRP nei BLEC. L'espressione genica di proteine a giunzione stretta, trasportatori e recettori di grandi molecole normalizzati dall'espressione di RPLP0 sono mostrati qui.Qui, i valori maggiori di uno corrispondono a una maggiore espressione genica nel modello di tripla coltura. La linea rossa corrisponde a un valore di uno in cui il livello di espressione dei due modelli è equivalente. L'immagine rappresentativa mostra il livello proteico delle proteine a giunzione stretta, trasportatori, in recettori molecolari di grandi dimensioni normalizzati dall'espressione della beta actina.È stato valutato il trasporto di nano gel polimerici neutri a base di NIPAM marcati con fluorescenza. Al tempo zero, nano gel polimerici sono stati collocati nel compartimento luminale ad una concentrazione di 0,1 milligrammi per millilitro. Dopo 24 ore di incubazione, il 5,82% dei nano gel polimerici sono stati trovati nel compartimento abluminale dimostrando la loro capacità di attraversare i BLEC.Il corretto rivestimento e semina dei periciti sul filtro invertito è fondamentale. Importante è il mantenimento della sterilità e dell'integrità delle strutture per evitare la contaminazione del sistema di coltura cellulare.

a-triple-culture-cell-system-modeling-the-human-blood-brain-barrier

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video dimostra la co-coltura di cellule cerebrali umane di periciti, astrociti ed endoteli. Ogni strato cellulare viene formato separatamente e poi coltivato insieme, creando un sistema a tre strati che imita la disposizione cellulare della barriera...

Sviluppo di un modello di coltura a tripla cellula della barriera emato-encefalica umana

Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Lo scopo di questo studio era di convalidare la riproducibilità di un modello in vitro BBB coinvolge un singenici ratto co-coltura delle cellule endoteliali e astrociti. Il monostrato di cellule endoteliali presentato TEER alta e bassa permeabilità LY. Espressione di proteine ​​TJ specifici, sono state valutate le risposte funzionali ai infiammazione e la funzionalità dei trasportatori e recettori.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

Le cellule epiteliali del plesso coroideo (CP) formano la barriera sangue-liquido cerebrospinale (BCSFB). Un modello in vitro del BCSFB impiega cellule di papilloma del plesso coroideo umano (HIBCPP). Questo articolo descrive la coltura e l'infezione basolaterale delle cellule HIBCPP utilizzando un sistema di filtri per colture cellulari.

Un Coroide Plesso epiteliali modello cellulare della Barriera Fluid Sangue umano-cerebrospinale per studiare l&#39;infezione batterica dal lato basolaterale

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

Presentiamo un saggio di fluorescenza per dimostrare che Lucifero Giallo (LY) è un marcatore robusto per determinare l'apparente permeabilità paracellulare dei monostrati cellulari hCMEC/ D3, un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana. Abbiamo usato questo saggio per determinare la cinetica di una formazione di monostrato confluente nelle cellule hCMEC/D3 coltivate.

Lucifero Giallo - Un Robusto Indicatore di Permeabilità Paracellulare in un Modello Cellulare della Barriera Sangue-Cervello Umano

Qui presentiamo un protocollo che descrive l'impostazione di un cellulo in BBB (barriera ematoencefalica)-cultura di poliestere membrana porosa Minibrain inserire il sistema al fine di valutare il trasporto di biomolecole o agenti infettivi attraverso un Bee umano e loro impatto fisiologico sulle cellule cerebrali adiacenti.

Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello

La barriera emato-encefalica umana previene selettivamente la penetrazione di molecole idrofile e patogeni nel cervello. Diverse patologie, tra cui meningite e delirio postoperatorio, sono associate a una maggiore permeabilità della barriera emato-encefalica. Qui, descriviamo un modello di coltura cellulare endoteliale per testare la permeabilità della barriera mediante attraversamento microbico.

Analisi della permeabilità della barriera sangue-encefalica attraverso l'attraversamento microbico attraverso le cellule endoteliali microvascolari

Qui, descriviamo il metodo per stabilire un modello di coltura cellulare tripla della barriera emato-encefalica basato su cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello umano, astrociti e periciti. Questo modello multicellulare è adatto per studi di disfunzione delle unità neurovascolari durante l'ictus ischemico in vitro o per lo screening di farmaci candidati.

Un triplo modello di coltura cellulare primaria della barriera emato-encefalica umana per lo studio dell'ictus ischemico in vitro

Questo rapporto fornisce protocolli per l'assemblaggio, la coltura cellulare e i saggi sulla piattaforma μSiM per la costruzione di modelli di barriera emato-encefalica.

Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

Scopri un sistema di coltura tripla che modella la barriera emato-encefalica umana con cellule endoteliali, periciti e astrociti. Questo metodo consente di studiare il trasporto di nanoparticelle e valutare strategie di drug delivery cerebrale.

Un sistema di cellule a tripla coltura che modella la barriera emato-encefalica umana

Esplora altri video