Misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione utilizzando la microscopia a cellule vive
November 1st, 2021
Questo protocollo ha lo scopo di misurare i parametri dinamici (protrusioni, retrazioni, volant) delle sporgenze ai margini delle celle di diffusione.
Il test di protrusione del bordo cellulare ha dimostrato di essere direttamente correlato alla migrazione cellulare. Pertanto può essere utilizzato come metodo preliminare per identificare proteine critiche e meccanismi di segnalazione coinvolti nella motilità cellulare. Il metodo è veloce, semplice, economico e non richiede l'etichettatura fluorescente o l'utilizzo di un costoso microscopio fluorescente.
A dimostrare la procedura sarà Michal Gendler, uno studente del mio laboratorio. Aggiungere due millilitri di una normale soluzione di acido cloridrico al centro di un piatto con fondo di vetro e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare il piatto tre volte con due millilitri di PBS.
Diluire la fibronectina a 10 microgrammi per millilitro di concentrazione in PBS e aggiungere 200 microlitri della soluzione diluita alla parabola centrale di vetro. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Preparare la soluzione 1%BSA e PBS e passarla attraverso un filtro da 0,2 micrometri.
Denaturare la soluzione incubando a 70 gradi Celsius per 30 minuti in un bagno d'acqua preriscaldato. Lavare il piatto inferiore in vetro rivestito con due millilitri di PBS tre volte. Aggiungere due millilitri di soluzione BSA denaturata e incubare il piatto a 37 gradi Celsius per un'ora.
Lavare il piatto di vetro con due millilitri di PBS tre volte. Prima di 16-18 ore di esperimento a 0,7 milioni di cellule per piastra di coltura tissutale di 10 centimetri di diametro per raggiungere il 70-80% di confluenza. Il giorno successivo, aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina alla piastra di coltura tissutale e incubare per due o tre minuti fino a quando le cellule si staccano.
Aggiungere cinque millilitri del mezzo per inattivare la tripsina. Usando un emacitometro, conta le cellule e la piastra 20.000 cellule in due millilitri del mezzo completo in un piatto inferiore. Quindi incubare il piatto con cellule placcate in un'incubatrice per 15 minuti.
Accendere l'unità di riscaldamento e impostarla a 37 gradi Celsius un'ora prima dell'imaging. Inoltre, accendere l'unità di anidride carbonica e impostarla al 5% 10 minuti prima dell'imaging. Accendere il microscopio e la fotocamera.
Accendere il computer e aprire il software di acquisizione del microscopio. Impostare l'ingrandimento su un contrasto di fase dell'obiettivo secco 40X. Imposta la durata totale del filmato su 10 minuti con un intervallo di tempo di cinque secondi.
Dopo 15 minuti di incubazione, posizionare il piatto di fondo di vetro con cellule aderenti in un adattatore e fissarlo. Inserire l'adattatore con la parabola nelle fessure dello stadio del microscopio. Togliere il coperchio del piatto, posizionare il coperchio dell'anidride carbonica e aprire la valvola dell'anidride carbonica.
Individuare una cella appropriata per l'imaging. Avviare l'acquisizione del filmato dopo essersi concentrati sulla cella. Per eseguire l'analisi dell'immagine, selezionare lo strumento dritto nel software di analisi delle immagini e creare otto linee di 20 unità arbitrarie perpendicolari alle sporgenze in una disposizione radiale ogni 45 gradi, tra cui lamella e bordo della cella.
Nella barra degli strumenti principale, vai all'immagine, seleziona Stacks e quindi fai clic su Reslice per generare un'immagine del kymograph che descrive il movimento di singoli punti all'interno della membrana cellulare. Utilizzando le immagini del kymograph, estrarre e contare manualmente il numero di sporgenze, retrazioni e volant in ciascuna delle otto regioni della cella contrassegnate dalle linee della griglia. Questi numeri rappresentano la frequenza di sporgenze, retrazioni e volant per 10 minuti.
Determinare la persistenza, la distanza e la velocità della protrusione mediante l'analisi della chimografia. Per determinare la distanza di protrusione, disegnate la linea perpendicolare dalla base della protrusione al picco più alto della protrusione. Premere M per misurare la lunghezza della linea in pixel e assicurarsi che il rapporto pixel/micrometro sia noto per convertire la lunghezza in micrometri.
La quantificazione di sporgenze, reazioni e volant è stata eseguita manualmente per 10 minuti e la frequenza media ottenuta per sporgenze e retrazioni è stata di 5,1 e 2,1 per volant. Il kymograph rappresentativo aveva una distanza di protrusione di circa 4,8 micrometri e un tempo di protrusione di circa 0,6 minuti. Viene rappresentato un esempio di cella che deve essere esclusa dall'analisi.
L'analisi della chimografia ha rivelato che la cellula non era presente nella sua fase di diffusione e non ha mostrato alcuna chiara protrusione della membrana. La cosa più importante è scegliere le cellule corrette per l'imaging. Una cellula corretta dovrebbe essere nella sua fase di diffusione e non dovrebbe toccare altre cellule per evitare la comunicazione e la segnalazione cellula-cellula.
Il metodo può essere utilizzato come strumento preliminare per testare la dinamica citoscheletrica che coinvolge la motilità cellulare prima di decidere di eseguire più risultati richiedendo saggi di migrazione cellulare.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo studio presenta un test di protrusione del bordo cellulare per indagare i parametri dinamici delle cellule in diffusione, incluse protrusioni, retrazioni e ruffle. Questo metodo è particolarmente significativo in quanto è correlato alla migrazione cellulare, aiutando nell'identificazione di proteine critiche e meccanismi di segnalazione coinvolti nella motilità cellulare.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Migrazione cellulare
- Motilità cellulare
- Dinamica citoscheletrica
Contesto
- Esiste una correlazione tra le protrusioni del bordo cellulare e la migrazione cellulare.
- Il test è semplice, economico e non richiede marcatura fluorescente.
- Comprendere le protrusioni può fornire informazioni sul comportamento cellulare e sui meccanismi che guidano la motilità.
Metodi utilizzati
- Test di protrusione del bordo cellulare
- Cellule adesive su un piatto con fondo di vetro
- Analisi di kimografia per valutare le protrusioni
Risultati principali
- La frequenza media delle protrusioni era di 5,1 ogni 10 minuti, con ruffle a 2,1.
- L'analisi di kimografia ha rivelato una distanza di protrusione di circa 4,8 micrometri.
- È stata identificata l'importanza di scegliere cellule appropriate nella fase di diffusione per risultati accurati.
Conclusioni
- Lo studio introduce un test accessibile per valutare la dinamica della motilità cellulare.
- Questo metodo serve come strumento di valutazione preliminare prima di intraprendere test di migrazione più complessi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Cell-edge protrusion dynamics serve as an early, predictive readout of cell motility, enabling rapid assessment of cytoskeletal regulators before committing to resource-intensive migration assays. This method supports target validation by linking molecular perturbations to functional membrane dynamics, providing mechanistic de-risking in discovery workflows. Its label-free, cost-effective design facilitates high-throughput screening of signaling pathways relevant to wound healing, immune response, and cancer metastasis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures protrusion frequency, persistence, distance, and velocity to interrogate therapeutic hypotheses on actin regulators and motility pathways.
- Operational Value: Enables rapid, label-free screening of protein knockdowns or inhibitors affecting cytoskeletal dynamics.
- Predictive Value: Correlates protrusion dynamics with cell migration, supporting go/no-go decisions based on early phenotypic readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative kymograph-derived metrics (protrusion count, distance, velocity) for standardized comparison across experimental conditions.
- Operational Value: Uses phase-contrast microscopy and accessible image analysis tools, reducing dependency on specialized equipment or fluorescent probes.
- Scalability: Supports multi-condition testing via radial sampling of eight membrane regions per cell, enhancing data robustness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges molecular target modulation to functional cellular behavior in disease-relevant systems like fibroblasts or immune cells.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from altered protrusion dynamics rather than secondary cytotoxicity or adhesion defects.
- Biomarker Alignment: Protrusion parameters can serve as translational biomarkers when linked to in vivo motility or invasion phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic validation, acting as a bridge between biochemical screening and functional cell-based assays.
- Discovery Biology: Tests how genetic or pharmacological manipulations of actin regulators (e.g., Arp2/3, cofilin, Rho GTPases) impact protrusion dynamics as a proxy for motility.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., protrusions per 10 minutes, protrusion velocity) that enable comparison across compound libraries or genetic screens.
- Analytics: Kymography provides temporal and spatial resolution of membrane dynamics, allowing extraction of kinetic parameters critical for mechanistic modeling.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by validating that target hits produce consistent protrusion phenotypes in primary or disease-relevant cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost platform for repeated use across projects investigating cell motility in development, inflammation, or oncology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking molecular perturbations to quantifiable membrane dynamics.
- Operational Value: Eliminates need for fluorescent labeling and expensive imaging hardware, lowering assay barrier and increasing accessibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering targets early using a predictive, phenotypic anchor to cell migration.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concordance between protrusion dynamics and migratory potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, kymograph generation, and manual or semi-automated protrusion analysis.
- Depends on phase-contrast microscopy and image analysis software capable of reslice and kymograph generation.
- Necessitates standardization of cell seeding density, substrate coating (fibronectin/BSA), and environmental controls (37°C, 5% CO2) for reproducibility.
- Requires training to identify appropriate spreading-phase cells and avoid confluent or contacting cells that confound protrusion measurements.
- Limited to 2D substrate-associated spreading; may not fully capture 3D invasion or confined migration phenotypes.
