Drosofila Comportamento di evitamento passivo come nuovo paradigma per studiare l'apprendimento avversivo associativo

Questo protocollo descrive un semplice test comportamentale che consente di studiare l'apprendimento associativo avverso e il consolidamento della memoria nelle mosche, compresi gli effetti delle interazioni dell'ambiente genico. Il test qui presentato è una procedura semplice, riproducibile ed economica per studiare i meccanismi di memoria che possono essere facilmente assemblati con poche forniture disponibili. Questo test potrebbe fornire informazioni sui meccanismi di base alla base dell'apprendimento e dei disturbi della memoria derivanti da varie manipolazioni genetiche, farmacologiche e dietetiche.

A dimostrare questa procedura saranno Morgan Tedder e Steven Bradley, studenti universitari del mio laboratorio. Per iniziare, praticare un foro di quattro millimetri perpendicolarmente a circa quattro millimetri dal fondo all'interno di un tubo di coltura in polipropilene da 14 millilitri. Rimuovere la parte superiore del tubo di coltura per creare un frammento inferiore di 45 millimetri utilizzato come compartimento inferiore.

Tagliare la parte superiore di una punta della pipetta da 1000 microlitri per creare un frammento di 12 millimetri. Inserire il frammento nel foro di quattro millimetri del tubo di coltura come banchina di carico per trasferire le mosche. Tagliare un pezzo di tubo in vinile trasparente da 15 millimetri e inserire il compartimento inferiore e superiore dalle estremità opposte nel tubo.

Fissare l'assieme verticalmente utilizzando un morsetto regolabile a due poli. Posizionare il compartimento superiore fissato verticalmente con tubi d'urto. Collegare i tubi d'urto con uno stimolatore elettrico per generare scosse elettriche.

Usando un blocco ghiacciato, immobilizzare le mosche di tre o quattro giorni e trasferirle in fiale separate con il cibo 24 ore prima dell'esperimento. Assegnare un codice a tutte le fiale come descritto nel manoscritto di testo. Aspirare delicatamente una mosca nell'aspiratore della bocca aspirando aria.

Deposita la mosca soffiando leggermente nella banchina di carico e avvia immediatamente un timer e un cronometro di un minuto. Accendere lo stimolatore e fornire una scossa elettrica quando la mosca entra nel tubo di shock. Premere il cronometro per registrare la prima latenza.

Se la mosca rientra nel tubo d'urto, fornire ulteriori urti. Utilizzando un conteggio o un contatore basato su Arduino, registra il numero di shock durante una prova di un minuto. Trasferire delicatamente la mosca nel flaconcino al termine di una prova di un minuto.

Registrare la latenza, il numero di shock ricevuti e qualsiasi cambiamento significativo nel comportamento. Utilizzando il 70% di etanolo, pulire il compartimento inferiore e l'ammortizzatore. Pulire con un fazzoletto detergente privo di lanugine e asciugarlo con un asciugacapelli.

Ripeti la prova con la mosca successiva. Pulire il compartimento inferiore con acqua e detergente inodore dopo aver completato l'esperimento. Utilizzando il 70% di etanolo, pulire il compartimento inferiore e ammortizzatore e asciugare all'aria durante la notte.

Ripetendo il processo di cui sopra dopo 24 ore, eseguire una seconda prova. In una sequenza simile, prova le mosche. Dopo aver eseguito un test di evitamento passivo nelle mosche maschio di Drosophila melanogaster, i risultati hanno dimostrato che la latenza aumenta, il numero di shock diminuisce, dimostrando che le mosche hanno imparato l'associazione tra il compartimento superiore e una scossa elettrica.

La distribuzione della frequenza ha rivelato che la maggior parte delle mosche entra nel compartimento superiore e riceve da uno a tre shock nel primo studio. Entro la quarta prova, la maggior parte delle mosche non entra nel compartimento superiore e riceve zero shock. Negli esperimenti successivi, la durata della prova è stata ridotta a un minuto perché la distribuzione della frequenza per le latenze ha mostrato chiaramente che se la mosca non entra nel compartimento superiore entro 60 secondi nella prima prova, di solito non entra affatto.

Gli esperimenti di test di evitamento passivo sono stati ripetuti in mosche maschio e femmina di Drosophila simulans. I risultati hanno dimostrato che le mosche erano efficaci nell'apprendere il comportamento di evitamento passivo, come evidente dai cambiamenti nelle distribuzioni di frequenza per latenze e shock nelle mosche maschili e femminili. Il confronto tra latenze e numero di shock tra maschio e femmina non ha rivelato differenze statisticamente significative.

Tuttavia, le mosche femmine hanno ricevuto un po 'più di shock in ogni prova. L'analisi degli attacchi di toelettatura nelle prove due e tre ha rivelato che la durata totale della toelettatura diminuisce significativamente nelle mosche femminili dalla prima alla terza prova. Ciò suggerisce che le mosche sperimentano uno stress comportamentale parallelo ai comportamenti ansiosi dei roditori.

Il confronto tra gli effetti della dieta occidentale e dell'esercizio di volo sul comportamento di evitamento passivo mostra che la dieta occidentale diminuisce la latenza e aumenta il numero di shock indicando che la dieta occidentale compromette l'apprendimento associativo avversivo nelle mosche. Al contrario, l'esercizio di volo ha mitigato l'effetto negativo della dieta occidentale. Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di non stressare le mosche.

Le mosche stressate entrerebbero nel compartimento superiore troppo rapidamente o non entrerebbero affatto. Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti nelle stesse condizioni ambientali e alla stessa ora del giorno. Questa tecnica offre ai ricercatori un nuovo semplice test che può essere utilizzato per sezionare i meccanismi intrinseci di apprendimento e consolidamento della memoria nelle mosche.