Modellazione di un sito attivo enzimatico utilizzando Molecular Visualization Freeware
December 25th, 2021
Un'abilità chiave nella modellazione biomolecolare è la visualizzazione e l'annotazione di siti attivi nelle proteine. Questa tecnica è dimostrata utilizzando quattro popolari programmi gratuiti per la visualizzazione macromolecolare: iCn3D, Jmol, PyMOL e UCSF ChimeraX.
Visualizzare macromolecole biologiche è un'abilità critica per studenti e professionisti delle scienze biologiche. In questo protocollo, dimostriamo come modellare il sito attivo dell'enzima glucochinasi utilizzando quattro programmi liberamente disponibili per la modellazione molecolare. Questo tutorial evidenzia diversi passaggi del protocollo per ogni programma, che include la selezione di ligandi legati e l'utilizzo dei ligandi per visualizzare aminoacidi e molecole d'acqua all'interno di cinque angstrom.
Le informazioni di supporto di questo manoscritto contengono un video dedicato per ogni programma, che descrive in dettaglio tutti i passaggi del protocollo con ulteriori spiegazioni. La struttura modellerà PDBID. 3FGU rappresenta il complesso catalitico dell'enzima glucochinasi.
Il sito attivo dell'enzima è legato a due dei suoi substrati, beta-D-glucosio, che ha dato l'identificatore BGC e uno ione magnesio, MG. Inoltre, questo analogo del substrato, un acido fosfo-amminofosforico, estere adenilato, ANP è legato al sito attivo della glucochinasi. Questo analogo non idrolizzabile dell'adenosina trifosfato, ATP impedisce che si verifichi la reazione di fosforilazione, che cattura il complesso del sito attivo pre-catalisi. L'interfaccia del programma di modellazione UCSF ChimeraX contiene menu a discesa, una barra degli strumenti, il visualizzatore della struttura e una riga di comando.
Inizieremo il protocollo con il passaggio 1.4, selezionando i residui all'interno di cinque angstrom per definire un sito attivo. Per selezionare i ligandi premere Ctrl Shift e fare clic su qualsiasi atomo o legame in ciascuno dei tre ligandi. Premere il tasto freccia SU fino a quando tutti e tre i ligandi non vengono evidenziati con un bagliore verde.
Definire la selezione per un utilizzo futuro facendo clic nel menu a discesa, selezionare definisci selettore, digitare ligandi per il nome della selezione e fare clic su OK. Ancora una volta, utilizzando il menu di selezione, selezionare la zona. Attiva o disattiva questo aspetto sui residui e assicurati che la casella superiore sia selezionata.
Fare clic su OK. Si noti che le parti del cartone animato all'interno di cinque angstrom di questi ligandi sono evidenziate. Per visualizzare le catene laterali come bastoncini e mostrare le molecole d'acqua del sito attivo, utilizzare il menu delle azioni dei legami atomici per mostrarle.
Oppure attivali con questi pulsanti qui. Per cancellare la selezione, fare clic in un punto qualsiasi dello spazio vuoto. Il risultato finale di questo protocollo dovrebbe essere un modello con il sito attivo della proteina e i ligandi mostrati come bastoncini colorati in modo contrastante.
Le principali interazioni di legame polare sono mostrate con linee tratteggiate e alcuni dei residui che formano i contatti sono etichettati. L'interfaccia iCn3D contiene menu a discesa, il visualizzatore della struttura e un registro dei comandi. Questa vista mostra i set di selezione e i menu popup di sequenza e annotazioni, che vengono visualizzati quando l'utente esegue i comandi che li richiedono.
Inizieremo il protocollo al passaggio 2.4, selezionando i residui all'interno di cinque angstrom per definire un sito attivo. Per selezionare i ligandi, utilizzare il menu a discesa Seleziona e fare clic su Seleziona su 3D, assicurarsi che il residuo sia controllato. Tenendo premuto il pulsante Alt su un PC o il pulsante di opzione su un Mac, fai clic sul primo ligando.
Quindi premere Ctrl e fare clic sui due ligani rimanenti per aggiungerli alla selezione. Salva la selezione utilizzando il menu a discesa, fai clic su seleziona, salva selezione, inserisci un nome e fai clic su Salva. Il menu a comparsa dei set di selezione apparirà ora con i tre ligandi selezionati.
Ora seleziona i residui all'interno di cinque angstrom dei ligandi. Utilizzare il menu a discesa selezionare per distanza. Nel menu a comparsa che appare, cambia la seconda lancia della voce con un raggio a cinque angstrom digitando nel blocco, fai clic su visualizza.
E quindi chiudi la finestra facendo clic sulla X nell'angolo in alto a destra. Salva il sito attivo dei cinque angstrom facendo clic sul menu a discesa, seleziona Salva selezione e usa la tastiera per inserire un nome. Quindi fare clic su Salva.
Ora create una nuova selezione che combini i due insiemi. Questi possono essere combinati nel menu a comparsa di alcuni set. Su un PC, fai clic sul controllo sui due set o su un clic del comando Mac.
Ancora una volta, fai clic sul menu a discesa, seleziona Salva selezione e digita un nuovo nome, quindi fai clic su Salva. Per mostrare interazioni come i legami idrogeno utilizzare il menu analisi e selezionare le interazioni. Saremo interessati solo ai legami idrogeno e ai ponti di sale qui.
Quindi deselezioneremo il resto di questi. Selezioneremo tre ligandi. E per il secondo set, i residui all'interno di cinque angstrom.
Fare clic su Interazioni di visualizzazione 3D e chiudere la finestra. Questo mostra alcuni dei residui che interagiscono, ma non mostra l'intero sito attivo di cinque angstrom. Per visualizzarlo verrà utilizzato nuovamente il menu seleziona set.
Fai clic su cinque angstrom completi e poi nel menu a discesa, fai clic su catene laterali di stile, bastoncini. Per applicare la colorazione CPK, fare clic sul menu a discesa del colore e fare clic su atomo. Il risultato finale del protocollo dovrebbe essere un modello che assomiglia a questo con il sito attivo della proteina e il ligando mostrato come bastoncini colorati in modo contrastante.
Importanti interazioni di legame sono mostrate con linee tratteggiate e tutti i residui all'interno di una delle selezioni create durante il protocollo sono etichettati. L'interfaccia Jmol contiene menu a discesa, una barra degli strumenti, il visualizzatore della struttura, un menu popup e la console Jmol contenente la riga di comando. Iniziamo il protocollo Jmol al passaggio 3.4, selezionando i residui all'interno di cinque angstrom per definire un sito attivo.
La console Jmol è il modo migliore per selezionare i residui all'interno di cinque angstrom. Digitare questo comando per selezionare i residui all'interno di cinque angstrom dei tre ligandi. Vengono selezionati 193 atomi, ma questi non rappresentano i residui di amminoacidi completi.
Per selezionarli, utilizzare il comando digitato, selezionare all'interno (gruppo, selezionato) e premere invio. Notate che vengono visualizzati ulteriori aloni di selezione. Per mostrare questi residui come bastoncini, fai clic con il pulsante destro del mouse per visualizzare il menu a comparsa, passa il mouse sopra lo stile, lo schema e quindi fai clic su stick.
Nota che ci sono ancora alcuni aloni vuoti qui. Queste sono le molecole d'acqua nel sito attivo. Per selezionare solo le molecole d'acqua, possiamo rieseguire questo comando e quindi modificarlo.
Fare clic all'interno della console, quindi utilizzare i tasti freccia su per trovare il comando e fare clic su Invio per eseguirlo nuovamente. Per visualizzare le molecole d'acqua come atomi, vogliamo rimuovere la selezione del ligando e della proteina. Digiteremo due comandi per farlo.
I nostri ligani sono considerati gruppi etero ma anche l'acqua è considerata tale. Quindi, all'interno di questo comando, dobbiamo definire che non stiamo rimuovendo l'acqua. Premere invio e ora vengono selezionate solo le molecole d'acqua.
Fare clic sul menu a discesa, passare il mouse sopra l'atomo e fare clic sul 20% del raggio di van der Waals. Lo ione magnesio verde è ancora mostrato come bastoncini. Più comunemente gli ioni sono mostrati come sfere.
Fare clic nella console Jmol e quindi digitare selezionare MG e quindi riempire lo spazio 50%I ligandi all'interno delle catene sono colorati in modo identico. Per distinguerli l'uno dall'altro, è utile ricolorare i ligandi. Nella console, eseguirò un comando multiriga, che ho copiato e incollato da un cheat sheet che approfondisco nel video supplementare di Jmol.
Il risultato di questo protocollo dovrebbe essere un modello che assomiglia a questo con il sito attivo della proteina mostrato come bastoncini. E i ligandi ci hanno mostrato bastoncini in una combinazione di colori più morbida. Le linee gialle indicano le interazioni di legame e i singoli residui sono etichettati come desiderato.
L'interfaccia PyMOL contiene menu a discesa, il visualizzatore della struttura, il pannello degli oggetti dei nomi e il menu dei controlli del mouse. Anche la riga di comando principale è etichettata in questa figura. Iniziamo il protocollo primordiale al passo 4.4, selezionando i residui all'interno di cinque angstrom per definire un sito attivo.
Per selezionare i ligandi clicca su ognuno di essi. Viene visualizzata una nuova selezione, che può essere rinominata facendo clic sul pulsante A. Usando la tastiera, elimina le lettere sele e digita i ligani al loro posto.
Premere invio. Possiamo usare questa selezione per definire l'area circostante. Inizia facendo clic sul pulsante A e seleziona la voce di menu duplicata.
In questa nuova selezione, sel01, fate clic su A e selezionate la voce di menu Rinomina. Utilizzando la tastiera, eliminare le lettere esistenti e digitare active. Questo sta ancora selezionando i nostri tre ligandi, quindi dovremo modificarlo di nuovo, usando il pulsante Azioni A.
Fare clic sul pulsante, selezionare Modifica ed espandere la selezione di cinque angstrom. Ora abbiamo catturato i ligandi e i residui all'interno di cinque angstrom. La S sul pulsante S sta per spettacolo.
Fare clic su questo per visualizzare la proteina in modi diversi. Mostreremo questa liquirizia come bastoncini. Fare clic nello spazio vuoto per cancellare la selezione.
Questo ha catturato gli amminoacidi all'interno di cinque angstrom ma non l'acqua. Possiamo di nuovo, duplicare la selezione e ora modificarla per selezionare solo l'acqua. Nelle azioni Pulsante A, duplica.
Viene visualizzata la selezione 2. Rinominiamo questo in acqua attiva. Questa volta useremo il pulsante A per modificare, intorno per selezionare gli atomi intorno alla nostra selezione.
Atomi all'interno di quattro angstrom. Questo ha selezionato l'acqua ma anche alcuni atomi delle catene laterali. Per modificarlo ulteriormente, utilizzare il pulsante A per modificare e limitare al solvente.
Ora possiamo vedere solo le molecole d'acqua illuminate. Sempre nel pulsante A, possiamo applicare un preset. Seleziona preset, palla e bastone e ora le molecole d'acqua vengono mostrate come sfere.
Il risultato finale del protocollo è un modello che assomiglia a questo con il sito attivo in ligandi mostrato come bastoncini colorati in modo contrastante. Le linee tratteggiate gialle mostrano le interazioni di legame polare e i singoli residui vengono etichettati utilizzando le selezioni create nel pannello degli oggetti dei nomi. Errori nell'esecuzione del protocollo possono portare a risultati non ottimali.
Ad esempio, l'intera proteina viene visualizzata come bastoncini. Per risolvere i problemi, l'utente dovrà prima nascondere la rappresentazione dello stick per l'intera struttura. E quindi visualizzare nuovamente la rappresentazione dello stick solo per l'oggetto chiamato attivo utilizzando il pulsante S.
Qui i modelli generati utilizzando ciascun programma sono mostrati fianco a fianco. Sebbene ci siano differenze nella visualizzazione dell'enzima, le stesse caratteristiche chiave e interazioni possono essere viste in ciascuno dei quattro modelli. Un utente interessato a padroneggiare uno dei programmi contenenti una riga di comando desidera imparare ad applicare e modificare i comandi digitati.
Come ho accennato nel protocollo Jmol, uno strumento utile è un cheat sheet di comando. Un file di testo normale contenente codici utilizzati di frequente a cui fare riferimento. Per diventare un utente avanzato, è utile capire quali parti del protocollo possono essere adattate e modificate.
Con la pratica questi protocolli possono essere applicati per modellare qualsiasi enzima attivo sito di interesse.
Panoramica
Questo articolo dimostra l'abilità di modellazione biomolecolare visualizzando il sito attivo dell'enzima glucochinasi utilizzando quattro programmi gratuiti: iCn3D, Jmol, PyMOL e UCSF ChimeraX. Il tutorial fornisce istruzioni passo-passo per modellare e annotare il sito attivo con ligandi legati.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Modellazione biomolecolare
- Visualizzazione delle proteine
- Analisi del sito attivo dell'enzima
Sfondo
- Comprendere le strutture proteiche è cruciale nelle scienze biologiche.
- I siti attivi sono essenziali per la funzione dell'enzima e l'interazione con i substrati.
- Sono disponibili vari strumenti software per visualizzare le macromolecole.
- Questo studio si concentra sulla glucochinasi, un enzima coinvolto nel metabolismo del glucosio.
Obiettivo dello studio
- Insegnare ai ricercatori come modellare efficacemente i siti attivi degli enzimi.
- Confrontare diversi strumenti di visualizzazione molecolare.
- Fornire una guida completa per selezionare e visualizzare ligandi e residui.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di iCn3D, Jmol, PyMOL e UCSF ChimeraX per la modellazione.
- Protocollo passo-passo per selezionare i residui entro cinque angstrom dai ligandi.
- Visualizzazione degli aminoacidi e delle molecole d'acqua in prossimità dei ligandi.
- Annotazione delle interazioni chiave e delle caratteristiche strutturali.
Principali risultati
- Modellazione di successo del sito attivo della glucochinasi con ligandi legati.
- Chiara visualizzazione delle interazioni tra l'enzima e i substrati.
- Dimostrazione delle capacità di ciascuno strumento software.
- Creazione di un video didattico dettagliato per ciascun programma.
Conclusioni
- Lo studio fornisce preziose intuizioni sulle tecniche di modellazione biomolecolare.
- Evidenzia l'importanza degli strumenti software nella biologia strutturale.
- I ricercatori possono visualizzare e analizzare efficacemente i siti attivi degli enzimi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Biomolecular visualization enables target validation by revealing structural determinants of ligand binding and enzyme function. Modeling active sites supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying structure-function relationships. This skill enhances predictive confidence in lead identification and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of ligand-binding interactions in the glucokinase active site.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying key amino acid residues and water molecules involved in substrate recognition.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing structural insights that inform target confidence and druggability assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological models for downstream screening by defining active site residues within five angstroms of bound ligands.
- Operational Value: Promotes assay standardization and reproducibility through consistent visualization of binding interactions across iCn3D, Jmol, PyMOL, and UCSF ChimeraX.
- Scalability: Enables platform reuse for screening campaigns by providing transferable protocols for modeling any enzyme active site of interest.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural insights to preclinical validation by maintaining consistency in active site modeling across workflows.
- Mechanistic De-risking: Highlights polar binding interactions and residue labeling to support structure-based design and lead optimization.
- Disease Relevance: Models human glucokinase, a key enzyme in glucose metabolism, relevant to diabetes and metabolic disorder target programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by enabling structural analysis of enzyme-ligand complexes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing how ligands bind to the glucokinase active site.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized selection and display of residues and water molecules in proximity to ligands.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs such as hydrogen bond visualization and residue labeling that aid in comparing ligand-binding modes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable framework for modeling enzyme active sites in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for modeling any enzyme active site, reducing redundant training and increasing cross-team consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in enzyme-ligand interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and cross-platform consistency in biomolecular visualization.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in early discovery, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and binding site accessibility.
Implementation Considerations
- Requires foundational knowledge in structural biology and protein-ligand interactions.
- Needs access to computational infrastructure capable of running iCn3D, Jmol, PyMOL, or UCSF ChimeraX.
- Demands cross-team standardization of visualization protocols to ensure consistent interpretation of active site models.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different enzyme systems or ligand types.
- Limited by user proficiency in command-line interfaces and selection tools across the four software platforms.
