Identificazione della fonte delle proteine secrete nel rene mediante iniezione di brefeldina A

La nostra tecnica ci consente di identificare la fonte e il contributo relativo delle cellule produttrici di citochine nei reni danneggiati. L'uso della Brefeldina A per prevenire la secrezione proteica ci consente di raccogliere maggiori informazioni sulle cellule che producono citochine negli organi solidi, come il tipo di cellula e lo stato di queste cellule.

Il nostro protocollo dovrebbe essere facilmente adattabile a molti sistemi di organi. Poiché la brefeldina A è una piccola molecola permeabile alle cellule, dovrebbe inibire la secrezione nella maggior parte dei tipi di cellule, consentendo il rilevamento di citochine e altre proteine secrete.

L'iniezione del coccige è il passaggio tecnicamente più impegnativo perché il coccige del topo è piuttosto piccolo. Si consiglia di esercitarsi in questo passaggio prima di eseguire il nostro protocollo sugli animali da esperimento.

[Istruttore] Inizia mettendo la gabbia per metà e per metà fuori dal termoforo per 10 minuti per assicurarti che i topi siano caldi. Dopo aver posizionato il topo in un dispositivo di contenzione, disinfettare la coda utilizzando tre volte un tampone di iodio povidone e alcol . Tieni la coda orizzontalmente e visualizza le vene laterali della coda. Quindi inserire un ago calibro 28, mantenendo l'ago e la siringa paralleli alla vena verso la direzione della testa. Iniettare 200 microlitri della soluzione BFA da 1,25 milligrammi per millilitro. La vena dovrebbe diventare chiara quando il sangue viene sostituito con la soluzione iniettabile. Quindi rimuovere l'ago e premere delicatamente la coda fino a quando l'emorragia non si ferma. Rimetti i topi nella gabbia e monitorali per ulteriori sanguinamenti o segni di angoscia. Utilizzare una siringa da 20 millilitri e perfondere il topo con 10-20 millilitri di PBS attraverso il ventricolo sinistro a una velocità di flusso da due a quattro millilitri al minuto fino a quando il perfusato diventa limpido. Rimuovere i reni tenendo l'arteria renale e la vena vicino alla papilla e tagliando il vaso sul lato lontano dal rene. Quindi rimuovere delicatamente la capsula renale staccandola a mano o con un paio di pinze sterili sottili. Utilizzare un pennarello barriera idrofobico e delineare le sezioni di tessuto mantenendo una distanza di almeno cinque millimetri dal tessuto al contorno della barriera idrofobica. Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone bloccante contenente il 3% di siero d'asino e lo 0,1% di tritoni in albumina di siero bovino all'1% TBS sulla parte superiore della sezione. Incubare a temperatura ambiente per un'ora in una camera umidificata. Diluire gli anticorpi primari con PBS alla concentrazione appropriata. Per rilevare le citochine, diluire gli anticorpi diretti contro TGF beta one, PDGF-D o CTGF in 50 microlitri di PBS. Aggiungere l'anticorpo primario anti-alfa SMA coniugato con Cy3 alla soluzione di anticorpo primario a diluizioni 1:200 per marcare i miofibroblasti. Rimuovere il tampone di blocco e aggiungere gli anticorpi primari alla sezione, assicurandosi che non fuoriesca dal contorno idrofobico circolare. Incubare per una notte a quattro gradi Celsius in una camera umidificata. Rimuovere la camera umidificata dall'incubatrice e lavare i vetrini con PBS tre volte per cinque minuti. Successivamente, diluire gli anticorpi secondari appropriati da uno a 200 con PBS. Incubare i campioni con 50 microlitri di soluzioni di anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Rimuovere i vetrini dalla camera umidificata e lavare con PBS per cinque minuti. Lectina diluita di loto tetragonolobus coniugata con fluoresceina in PBS con calcio e magnesio ad una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Quindi incubare i tessuti con 50 microlitri di soluzione LTL per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata. Rimuovere i vetrini dalla camera umidificata e lavarli con PBS con calcio e magnesio per cinque minuti. Incubare i tessuti con 50 microlitri di DAPI per colorare i nuclei di DNA per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare una volta con PBS. Aggiungere 20 microlitri di reagente di montaggio antisbiadimento al fazzoletto per montare i vetrini coprioggetti, quindi posizionare lentamente il vetrino coprioggetti. Attendere 24 ore affinché il reagente antidissolvenza si solidifichi prima di eseguire l'imaging. Accendi il microscopio invertito con un tavolino XY automatizzato e seleziona l'obiettivo 20x. Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio e individuare la sezione di tessuto. Quindi apri il software di acquisizione delle immagini e fai clic su live per aprire la finestra di visualizzazione live. Trova la sezione di tessuto assicurandoti che sia a fuoco. Fare clic sul menu di acquisizione e selezionare Scansiona immagine grande. Imposta l'area da scansionare spostando il tavolino utilizzando il joystick verso la parte più a sinistra della sezione del tessuto, quindi fai clic sulla freccia sinistra. Ripetere l'operazione per i segmenti di tessuto superiore, destro e inferiore. Fare clic sul menu di acquisizione e assicurarsi che la casella di controllo per l'acquisizione multicanale sia selezionata. Per acquisire immagini multicanale, fare clic sulla scheda lambda, fare clic su ciascun canale e impostare il tempo di esposizione su un livello in cui la colorazione è evidente senza saturare alcuna parte dell'immagine. Ripetere l'operazione per ogni canale da raccogliere. Quindi fare clic su Scansione. Aprire il software di acquisizione delle immagini e fare clic su File. Quindi fare clic su Apri e selezionare l'immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra dell'immagine e scegliere ROI poligonale. Delinea il ROI con uno strumento a mano libera. Quindi delineare le cellule tubulari LTL positive o le cellule interstiziali alfa SMA positive. Fare clic sulla scheda di misurazione e quindi sulla soglia. Impostare i limiti di soglia superiore e inferiore regolando i cursori su entrambi i lati dell'area del segnale positivo. Quindi fare clic sulla scheda ROI. Infine fare clic sull'icona di esportazione per salvare i valori. Utilizza il software per fogli di calcolo per calcolare le percentuali dell'area del segnale positivo per area del ROI.

[Presentatore] Le vescicole TGF beta positive il terzo giorno dopo la somministrazione di cisplatino o soluzione salina sono mostrate nelle immagini rappresentative. Le vescicole TGF beta positive sono osservate nei PTC marcati con LTL nei reni trattati con cisplatino in presenza di BFA. Tuttavia, queste vescicole non sono state osservate nei reni illesi o non trattati con BFA.

[Istruttore] La modifica ha rivelato un aumento dell'area beta positiva al TGF con il trattamento con BFA nel danno renale acuto indotto da cisplatino. Analogamente al TGF beta, anche le vescicole PTGF-D o CTGF positive si accumulano con il trattamento BFA nell'AKI indotta da cisplatino. La quantificazione ha dimostrato che anche le aree PDGF-D positive e CTGF positive erano significativamente aumentate con BFA Nelle cellule tubulari prossimali LTL positive l'iniezione di BFA non ha aumentato significativamente i livelli plasmatici di BUN il terzo giorno dopo l'iniezione di cisplatino. Vescicole TGF beta positive sono state osservate nelle cellule interstiziali marcate con alfa SMA nel cisplatino AKI con trattamento BFA. La modifica ha rivelato che le aree beta positive al TGF nell'area alfa SMA positiva erano significativamente aumentate con il trattamento BFA in cisplatino AKI. Analogamente alle vescicole TGF beta positive, anche le vescicole CTGF positive aumentano con il trattamento BFA. La quantificazione ha dimostrato che il trattamento con BFA ha aumentato il rapporto tra l'area positiva per CTGF e l'area positiva per l'alfa SMA nell'AKI indotta da cisplatino. Rispetto al danno indotto dal cisplatino, le vescicole TGF-beta positive nei PTC erano molto più piccole nella fase cronica dell'AA. C'era una minima colorazione positiva nei PTC LTL positivi. Tuttavia, l'intensità del segnale di TGF beta nella molecola di danno renale uno PTC positivo è stata aumentata con il trattamento BFA. Il livello medio di intensità del TGF beta era tre volte superiore con l'iniezione di BFA rispetto a quello senza BFA.

Il passaggio più critico è garantire che l'iniezione della vena caudale abbia successo. Un'iniezione fallita avrebbe alterato i risultati. Quindi, per favore, cerca i segni di successo, come la vena che diventa chiara con l'iniezione, e per favore cerca i segni di fallimento, come il gonfiore sopra le code.

L'iniezione di Brefeldin A potrebbe essere combinata con una serie di saggi, tra cui il western blot o la citometria a flusso, per valutare la produzione di citochine su scala di organo o di singola cellula.

Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di identificare nuove citochine secrete dalle cellule epiteliali renali che in precedenza si pensava provenissero da altri tipi di cellule. Può essere utilizzato per risolvere dibattiti di lunga data sul contributo di specifici tipi di cellule al danno.