Name: Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Impara a preparare insetti axenici da uova sterilizzate e allevare larve con foglie di pioppo da coltura tissutale per studiare le interazioni microbiota-intestino negli insetti non modello.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (31971663) e dal Young Elite Scientists Sponsorship Program di CAST (2020QNRC001).

1. Allevamento di insetti
<ol><li>Mantenere la popolazione di P. versicolora in una camera di crescita a 27 °C e 70 ± 5% di umidità relativa con un fotoperiodo di 16 ore di luce/8 ore di buio. Mettili in scatole di plastica perforate con carta assorbente bagnata piastrellata e dai loro da mangiare rami di pioppo freschi. Spruzzare acqua pulita sulla carta assorbente per mantenere l'umidità e cambiare i rami ogni due giorni.</li>
	<li>Isolare gli adulti per l'ovodeposizione dopo la pupa. Dai loro da mangiare foglie tenere per ottenere più uova.</li>
	<li>Raccogli le uova appena deposte (entro 24 ore). Posizionare le uova su carta assorbente umida per 60 ore per preparare le larve axeniche. NOTA: le uova appena deposte si schiuderanno dopo ~ 72 h. Il momento migliore per sterilizzare le superfici delle uova è il giorno prima della schiusa; altrimenti, il numero di uova schiuse con successo diminuirà.</li>
</ol>2. Coltivazione di pioppi senza germi
<ol><li>Preparare le soluzioni stock di Acido acetico (NAA) medio Murashige e Skoog (MS) e 1 mg/mL di acido acetico α-naftalene (NAA) (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>In una cappa di biosicurezza, aggiungere 50 μL di soluzione madre NAA da 1 mg/mL a 500 mL di MS medium, agitare per mescolare bene e versare ~ 50 mL per contenitore di coltura tissutale e attendere la solidificazione.</li>
	<li>Preparare bisturi, lampada alcolica e pinza; sterilizzare i bisturi e le pinze nella fiamma della lampada ad alcool nella cappa di biosicurezza.</li>
	<li>Tagliare segmenti di stelo di 3-4 cm con gemme apicali o gemme laterali da piantine di pioppo a ~ 1 mese di crescita (piantine coltivate con tessuto privo di germi) e inserirli nel terreno di coltura, uno o due segmenti di gambo per contenitore.</li>
	<li>Incubare questi segmenti di stelo in una camera di crescita a 25 °C e 50 ± intensità luminosa di 10 cd con un fotoperiodo di 16 ore di luce/8 ore di buio per circa 30 giorni. Usa le foglie prive di germi per nutrire le larve asferiche.</li>
</ol>3. Sterilizzazione superficiale delle uova e allevamento di larve axeniche
<ol><li>Piastre di Petri in autoclave, pennelli, carta da filtro, acqua distillata e una capsula di Petri contenente LB (Luria-Bertani) agar medium.</li>
	<li>Metti le foglie con uova aderenti in una capsula di Petri, rimuovi con cura le uova dalle foglie usando una pinza e trasferiscile in un'altra capsula di Petri. NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con molta attenzione perché le uova sono aderenti alle foglie.</li>
	<li>Lavare queste uova con etanolo al 75% per 8 minuti e ripetere il lavaggio quattro volte con acqua sterile.</li>
	<li>Trasferire le uova sul mezzo LB agar per preservare l'umidità per la schiusa. NOTA: L'uso di lb agar medium può aiutare a verificare se l'uovo disinfettato è privo di germi.</li>
	<li>Posizionare la capsula di Petri in una camera di crescita e attendere che le uova si schiudano entro 24 ore.</li>
	<li>In una cappa di biosicurezza, piastrellare tre pezzi di carta da filtro bagnata in una capsula di Petri, posizionare foglie di pioppo prive di germi sulla carta, raccogliere le larve e posizionarle sulle foglie, sigillare la capsula di Petri con parafilm e incubarle in una camera di crescita a 27 ° C e 70 ± 5% di umidità relativa con un fotoperiodo di 16 ore di luce / 8 ore di buio. NOTA: Le foglie coltivate con tessuti sono delicate e possono perdere acqua rapidamente. Pertanto, l'uso di carta da filtro umida è necessario quando si trasferiscono le foglie nella capsula di Petri.</li>
	<li>Cambia le foglie ogni due giorni.</li>
	<li>Per i gruppi allevati convenzionalmente, trasferire le uova dalle foglie a una capsula di Petri contenente carta da filtro umida e nutrire queste larve con foglie di pioppo prive di germi.</li>
</ol>4. Verifica delle larve astoniche con saggi dipendenti dalla coltura
<ol><li>Seleziona casualmente tre larve 1°, 2° e 3° instar dai gruppi privi di germi e allevati convenzionalmente.</li>
	<li>Seziona le 3larve di instar con forbici sterili e pinze sotto uno stereomicroscopio e raccogli le loro viscere in tubi microcentrifuga. Raccogli intatte le larve di 1° e 2° instar in tubi. NOTA: Raccogli intere larve 1° e 2° instar in quanto sono troppo piccole per essere sezionate e mantieni intatte le loro viscere.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di soluzione salina tamponata con fosfato e tre sfere di acciaio in tubi da 1,5 mL e macinare i tessuti in omogeneizzati usando un omogeneizzatore che batte le perline.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di omogeneizzato al mezzo e alla piastra LB agar utilizzando un'asta sterile per la diffusione del vetro.</li>
	<li>Posizionare le piastre a 37 °C per 24 ore e osservare le colonie batteriche.</li>
</ol>5. Verifica di individui axenici con saggi indipendenti dalla cultura
<ol><li>Estrarre il DNA totale dei tessuti (ottenuto nella sezione 4) utilizzando un kit di estrazione del DNA.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm.</li>
	<li>Amplificare il gene rRNA batterico 16S utilizzando primer rRNA 16S universali con PCR. Impostare il sistema di reazione con 18 μL di miscela master PCR 1,1x (vedere la tabella dei materiali), 0,5 μL di primer 27F (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL di primer 1495R (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') e 100 ng di DNA modello. Impostare le condizioni PCR a 95 °C per 3 min; 28 cicli di 95 °C per 30 s, 55 °C per 1 min e 72 °C per 1 min; seguito da 72 °C per 10 min. Conservare i prodotti PCR a 4 °C fino a ulteriori analisi.</li>
	<li>Mescolare i prodotti PCR con colorante acido nucleico e analizzarli utilizzando l'elettroforesi su un gel di agarosio all'1% in 1x tampone TAE. Utilizzare 10 μL di un marcatore del DNA come riferimento.</li>
	<li>Osservare il gel con un transilluminatore UV e cercare il frammento target intorno a 1.500 bp.</li>
</ol>

<ol><li>Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+and+ecological+consequences+of+gut+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Ecology%2C+Evolution%2C+and+Systematics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Tokuda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-associated+spirochetes+are+major+agents+of+hemicellulose+degradation+in+the+hindgut+of+wood-feeding+higher+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).</li>
<li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li>
<li>Shin, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+microbiome+modulates+host+developmental+and+metabolic+homeostasis+via+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling.</a> Science. 334 (6056), 670-674 (2011).</li>
<li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+plantarum+promotes+Drosophila+systemic+growth+by+modulating+hormonal+signals+through+TOR-dependent+nutrient+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing.</a> Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).</li>
<li>Salem, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+supplementation+by+gut+symbionts+ensures+metabolic+homeostasis+in+an+insect+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host.</a> Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838(2014).</li>
<li>Koch, H., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socially+transmitted+gut+microbiota+protect+bumble+bees+against+an+intestinal+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).</li>
<li>Cirimotich, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+microbe-mediated+refractoriness+to+Plasmodium+infection+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae.</a> Science. 332 (6031), 855-858 (2011).</li>
<li>Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+bacteria+protect+wasp+larvae+from+fungal+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation.</a> Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).</li>
<li>Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+modulates+gut+immunity+and+promotes+baculovirus+infection+in+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera.</a> Insect Science. , (2021).</li>
<li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+-+Exploitation+of+gut+bacteria+in+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust.</a> Nature. 403 (6772), 851(2000).</li>
<li>Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+bacteria+of+Dendroctonus+valens+and+their+involvement+in+verbenone+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production.</a> Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).</li>
<li>Schretter, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+microbial+factor+modulates+locomotor+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila.</a> Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+modulates+Drosophila+aggression+through+octopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2698(2021).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+immunological+effects+of+gut+microbiota+in+leaf+beetles+at+the+local+and+systemic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels.</a> Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+the+gut+microbiota+in+environmental+RNA+interference+in+a+leaf+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle.</a> Microbiome. 9 (1), 98(2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+an+invasive+bark+beetle+infected+by+a+pathogenic+fungus+accelerates+beetle+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality.</a> Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).</li>
<li>Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+applications+of+insect+symbionts+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potential applications of insect symbionts in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).</li>
<li>Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+genetically+engineered+Trabulsiella+odontotermitis+as+a+%27Trojan+Horse%27+for+paratransgenesis+in+termites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 202(2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fighting+malaria+with+engineered+symbiotic+bacteria+from+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li>
<li>Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+germ-free+Drosophila+to+study+gut-microbe+interactions%3A+protocol+to+rear+Drosophila+under+axenic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions.</a> Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52(2018).</li>
<li>Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+lifespan+enhancement+by+exogenous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).</li>
<li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464(2018).</li>
<li>Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-free+mosquitoes+via+transient+colonisation+allows+stage-specific+investigation+of+host-microbiota+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 942(2021).</li>
<li>Berasategui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+of+the+pine+weevil+degrades+conifer+diterpenes+and+increases+insect+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness.</a> Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).</li>
<li>Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+antibiotics+on+larval+gut+bacterial+diversity+of+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).</li>
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<li>Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+feeding+preference+in+a+leaf+beetle%3A+the+importance+of+phenotypic+plasticity+of+a+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+Letters%22%5BJournal%5D)">Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant.</a> Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).</li>
<li>Ishihara, M., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+inactivity+and+prolonged+developmental+time+induced+by+seasonal+decline+in+host+plant+quality+in+the+willow+leaf+beetle+Plagiodera+versicolora+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).</li>
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<li>Habineza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoting+effect+of+gut+microbiota+on+growth+and+development+of+red+palm+weevil%2C+Rhynchophorus+ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+by+modulating+its+nutritional+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1212(2019).</li>
<li>Meilan, R., Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poplar+%28Populus+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Poplar (Populus spp.).</a> Methods in Molecular Biology. 344, Clifton, N.J. 143-151 (2006).</li>
<li>Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-endophyte+symbiosis%2C+an+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).</li>
<li>Grout, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristem-tip+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Meristem-tip culture.</a> Methods in Molecular Biology. 6, Clifton, N.J. 81-91 (1990).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

La preparazione di larve prive di germi e l'ottenimento di larve gnotobiotiche reintroducendo specifici ceppi batterici sono metodi potenti per chiarire i meccanismi alla base delle interazioni ospite-microbo. Le larve appena nate ottengono il microbiota intestinale in due modi principali: trasmissione verticale dalla madre alla prole o acquisizione orizzontale dai fratelli e dall'ambiente34. Il primo può essere soddisfatto dal trasferimento dei genitori alla prole attraverso la contaminazione del...

Simile ai mammiferi, il tratto digestivo degli insetti è una cavità per la digestione e l'assorbimento del cibo. La maggior parte degli insetti ospita diversi batteri commensali che prosperano nelle loro viscere e vivono di nutrizione fornita dagli ospiti1. La comunità commensale intestinale ha un profondo impatto su molteplici processi fisiologici negli insetti, tra cui digestione e disintossicazione degli alimenti 2,3,4, nutrizione e sviluppo 5,6,7, difesa contro agenti patogeni e parassiti 8,9,10,11, comunicazione chimica12,13 e comportamenti 14 ,15. Curiosamente, alcuni microbiota intestinali possono essere facoltativamente patogeni o essere manipolati da agenti patogeni invasori per aggravare l'infezione, indicando che i batteri intestinali possono essere dannosi in alcuni casi 16,17,18. I batteri intestinali possono anche servire come risorsa microbica per applicazioni biotecniche e gestione dei parassiti. Ad esempio, i batteri che digeriscono la lignocellulosa da insetti fitofagi e xilofagi sono stati utilizzati per digerire le cellule vegetali per lo sviluppo di biocarburanti19. La dispersione di simbionti intestinali ingegnerizzati che esprimono molecole bioattive è una tattica nuova e promettente per gestire l'agricoltura e i parassiti forestali e le zanzare che trasmettono malattie infettive 19,20,21, che può anche essere utilizzata per migliorare la forma fisica degli insetti benefici 22. Illustrare come si comporta un batterio intestinale in vivo è quindi considerato una priorità per sfruttarne appieno la funzione e sfruttarlo ulteriormente per varie applicazioni.
Gli animali possono ospitare da 1 a >1000 specie microbiche simbiotiche nell'intestino1. Di conseguenza, è difficile verificare con precisione come i singoli taxa batterici o il loro assemblaggio si comportano all'interno di un animale e se l'ospite o i suoi partner microbici guidano una funzione specifica. Pertanto, preparare le larve astrone per ottenere insetti gnotobiotici mediante colonizzazione mono- o multi-specie è necessario per studiare la funzione batterica e l'interazione con gli insetti23. Allo stato attuale, la somministrazione di cocktail antibiotici e la sterilizzazione della superficie delle uova di insetti sono metodi comuni per rimuovere i batteri intestinali 14,24,25,26. Tuttavia, le diete antibiotiche non possono eliminare completamente i batteri intestinali e hanno un effetto negativo sulla fisiologia degli insetti ospiti27,28. Di conseguenza, l'uso di insetti trattati con antibiotici può oscurare le vere capacità di alcuni batteri intestinali. Fortunatamente, la sterilizzazione superficiale delle uova può negare questo problema 23,29, che non ha effetti o trascurabili sugli insetti sperimentali. Inoltre, le diete artificiali non possono assomigliare completamente al cibo naturale degli insetti e lo sviluppo di una dieta artificiale è un processo costoso e laborioso30,31.
Il coleottero delle foglie di salice, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), è un diffuso parassita che si nutre principalmente di alberi salicacei, come salici (Salix) e pioppo (Populus L.) 32,33. Qui, lo scarabeo delle foglie di salice è stato usato come insetto rappresentativo mangiatore di foglie per sviluppare un protocollo per preparare e allevare un insetto privo di germi. Abbiamo sfruttato la coltura di tessuti vegetali per ottenere foglie di pioppo prive di germi per allevare larve axeniche di P. versicolora da uova sterilizzate. Lo stato astronico delle larve di P. versicolora è stato verificato tramite saggi dipendenti dalla cultura e indipendenti dalla cultura. Questo protocollo può mantenere gli insetti ascinici che imitano meglio la condizione selvaggia rispetto all'allevamento di insetti con una dieta artificiale. Ancora più importante, questo metodo è conveniente a un costo molto basso, il che aumenta la fattibilità di ottenere insetti axenici per futuri studi di interazione microbiota insetto-intestino, specialmente per insetti non modello senza diete artificiali ben sviluppate.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtri per siringhe</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mg/mL di</td><td></td><td></td> soluzione madre di NAA <td>a. Preparare 0,1 M di soluzione di NaOH (sciogliere 0,8 g di NaOH in 200 mL di acqua distillata). b. Aggiungere 0,2 g di NAA in un becher da 250 mL, aggiungere un po' di soluzione di NaOH 0,1 M fino a quando il NAA non si è sciolto e regolare il volume finale a 200 mL con acqua distillata. c. Filtrare la soluzione per rimuovere i batteri con una soluzione 0,22 &micro; m e una siringa sterile da 50 mL, confezionare la soluzione in provette da centrifuga da 1,5 mL e rifornire a -20 °C.</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Sangon Biotech F600620</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 PBS soluzione</td><td></td><td></td> madre Biosharp Life Sciences BL302A <td></td></tr><tr><td>2 M KOH</td><td>Sciogliere 22,44 g di KOH (peso molecolare: 56,1) in 200 mL di acqua distillata e sterilizzare in autoclave per 20 minuti a 121 °C.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becher da 250 mL e 2.000 mL</td><td>Shubo</td><td>sb16455</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe sterili da 50 mL Jinta</td><td></td><td>JT0125789</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduato da 500 mL</td><td>Shubo</td><td>sb1601</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE soluzione</td><td></td><td></td> madre <td>a.&nbsp; Sciogliere 242 g di Tris e 18,612 g di EDTA in 700 mL di acqua distillata. b. Regolare il pH a 7,8 con circa 57,1 mL di acido acetico. c. Regolare il volume finale a 1.000 mL. d. La soluzione madre è stata diluita in 1x tampone TAE quando è stata utilizzata.</td></tr><tr><td>75% etanolo</td><td>Xingheda trade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-naftalene acido acetico (NAA)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>86-87-3</td><td></td></tr><tr><td>Carta</td><td></td><td></td> assorbente <td>22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Coolaber</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Panasonic</td><td>MLS-3781L-PC</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore a perline</td><td>Jing Xin</td><td>XM-GTL64</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del DNA</td><td>MP Biomedicals</td><td>116560200</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Saiguo Biotech</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Jiaojie</td><td></td><td>70 mm</td></tr><tr><td>di diametro Unità di elettroforesi</td> <td>su gelBio-rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Gel Signal Green colorante per acidi nucleici</td><td>TsingKe</td><td>TSJ003</td><td></td></tr><tr>Piantine <td></td><td></td> di<td>pioppo prive di germi</td><td>Pioppo Shan Xin dell'Università di Ludong nella provincia di Shandong Golden</td></tr><tr><td>Star Super PCR Master Mix (1,1 volte)</td><td>TsingKe</td><td>TSE101</td><td></td></tr><tr><td>Camera di crescita</td><td>Ruihua</td><td>HP400GS-C</td><td></td></tr><tr><td>LB agar medium</td><td></td><td></td><td>a. Sciogliere 5 g di triptone, 5 g di NaCl, 2,5 g di estratto di lievito in 300 mL di acqua distillata. b. Regolare il volume finale a 500 mL, trasferire la soluzione in un pallone conico da 1.000 mL e aggiungere 7,5 g di agar. c. Autoclavare il terreno per 20 minuti a 121 °C.</td></tr><tr><td>Mini centrifuga</td><td>DRAGONLAB</td><td>D1008</td><td></td></tr><tr><td>MS terreno basico</td><td>Coolaber</td><td>PM1121-50L</td><td>M0245</td></tr><tr><td>MS terreno solido per coltura</td><td></td><td></td> di piantine prive di germi <td>a. Sciogliere 4,43 g di polvere di terreno basico MS e 30 g di saccarosio in 800 mL di acqua distillata. b. Regolare il pH a circa 5,8 con 2 M KOH con un pHmetro. c. Regolare il volume finale a 1.000 mL, Separare in due parti, trasferire in due matracci conici da 1.000 mL e aggiungere 2,6 g di agar per 500 mL. d. Autoclave per 20 min a 121 &deg;C.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pennello</td><td></td><td></td> da <td>1 cm di larghezza, utilizzato per raccogliere le uova</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PCR Termociclatori</td><td>Eppendorf</td><td>6331000076</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri</td><td>Supin</td><td></td> pHmetro da <td>90 mm di diametro</td></tr><tr><td></td><td>METTLER TOLEDO</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 0,2-2 & micro; L</td><td>Gilson</td><td>ECS000699</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 100-1.000 & micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 20-200 &; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000259</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 2-20 & micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000232</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per colture di tessuti vegetali</td><td>Chembase</td><td>ZP21</td><td>240 mL</td></tr><tr><td>Scatola</td><td></td><td></td> di plastica <td>2,35 L</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer per amplificare il gene batterico 16S rRNA</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td>27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sfere</td><td></td> d'acciaio <td>da 0,25 mm</td><td>utilizzate per macinare i tessuti</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans2K plus II DNA marcatore</td><td>Transgene Biotech</td><td>BM121-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>1115</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminatore UV</td><td>Monad Biotech</td><td>QuickGel 6100</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scilogex</td><td>MX-S</td><td></td></tr><tr>Rami <td></td><td></td><td>di salice</td><td>Sha Lake Park, Wuhan, Cina</td></tr><tr><td>Scarabeo</td><td></td><td></td> foglia di salice <td>Huazhong Agricultural University, Wuhan, Cina</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Le viscere degli insetti sono colonizzate da diversi batteri che possono avere un impatto profondo sui tratti fisiologici dell'ospite. L'introduzione di un particolare ceppo batterico in un insetto astronico è un metodo potente per verificare la funzione microbica intestinale e chiarire i meccanismi alla base delle interazioni tra microbi intestinali e ospiti. La somministrazione di antibiotici o la sterilizzazione delle superfici delle uova sono due metodi comunemente usati per rimuovere i batteri intestinali dagli insetti. Tuttavia, oltre ai potenziali effetti avversi degli antibiotici sugli insetti, studi precedenti hanno indicato che l'alimentazione di antibiotici non poteva eliminare i batteri intestinali. Pertanto, le diete artificiali prive di germi sono generalmente impiegate per mantenere gli insetti ascinici, che è un processo noioso e laborioso che non può assomigliare completamente ai componenti nutrizionali nel cibo naturale. Qui è descritto un protocollo efficiente e semplice per preparare e mantenere le larve axeniche di uno scarabeo fogliare (Plagiodera versicolora). In particolare, le superfici delle uova di coleottero sono state sterilizzate, in seguito alle quali sono state utilizzate foglie di pioppo prive di germi per allevare larve astronche. Lo stato astronico degli insetti è stato ulteriormente confermato attraverso saggi dipendenti dalla cultura e indipendenti dalla coltura. Collettivamente, combinando la disinfezione delle uova e la coltivazione priva di germi, è stato sviluppato un metodo efficiente e conveniente per ottenere L. versicolora axenico, fornendo uno strumento facilmente trasferibile per altri insetti mangiatori di foglie.

Le fasi di vita di P. versicolora sono mostrate nella Figura 1. Il maschio adulto è più piccolo della femmina adulta (Figura 1A). Nel campo, lo scarafaggio raggruppa le sue uova su una foglia; qui, quattro uova sono state staccate da una foglia (Figura 1B). I segmenti e le piantine di stelo di pioppo utilizzati per l'allevamento di insetti axenici sono mostrati nella Figura 2. L'intestino di un...

Per ottenere un insetto ascianico, la sua superficie dell'uovo viene sterilizzata e la larva tratteggiata viene successivamente allevata usando foglie astronche. Questo metodo fornisce un modo efficiente per la preparazione degli insetti axenici senza somministrare antibiotici o sviluppare una dieta artificiale, che può essere applicata anche ad altri insetti mangiatori di foglie.

Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

I batteri intestinali possono influenzare molteplici processi fisiologici degli ospiti degli insetti. Preparare e mantenere le larve axeniche è un potente strumento per studiare le funzioni dei batteri intestinali. I principali vantaggi di questo protocollo sono che la coltura del tessuto vegetale viene utilizzata per ottenere foglie prive di germi per allevare gli insetti carnici derivati da foglie axeniche derivate da uova sterilizzate in superficie e che questo metodo non è limitato da diete artificiali.Questo metodo è conveniente e aumenta la visibilità del mantenimento degli insetti astonici per futuri studi sui batteri intestinali, in particolare per gli insetti non modello senza diete artificiali ben sviluppate. Mantenere la popolazione di P.versicolora in una camera di crescita a 27 gradi Celsius e 70% di umidità relativa, con una luce di 16 ore e un fotoperiodo scuro di otto ore. Metti gli insetti in scatole di plastica perforate con carta assorbente bagnata inclinata e dai loro da mangiare rami di pioppo freschi.Spruzzare acqua pulita sulla carta assorbente per mantenere l'umidità e cambiare i rami ogni due giorni. Isolare gli adulti per l'ovodeposizione dopo la pupa e dar loro da mangiare foglie tenere per ottenere più uova. Entro 24 ore, raccogliere le uova appena deposte e metterle su carta assorbente umida per 60 ore per preparare le larve asferiche.Preparare MS medium in un milligrammo per millilitro di acido alfa-naftalene acetico o soluzioni stock NAA. In una cappa di biosicurezza, aggiungere 50 microlitri della soluzione madre NAA a 500 millilitri di mezzo MS e agitare per mescolare bene. Quindi versare circa 50 millilitri per contenitore di coltura tissutale e attendere la solidificazione.Sterilizzare bisturi e pinze in una fiamma di lampada ad alcool nella cappa di biosicurezza. Tagliare segmenti di gambo da tre a quattro centimetri con gemme apicali o gemme laterali da piantine di pioppo a circa un mese di crescita e inserirli nel terreno di coltura, uno o due segmenti di gambo per contenitore. Incubare questi segmenti di stelo in una camera di crescita per circa 30 giorni.E usa queste foglie prive di germi per nutrire le larve asferiche. Piastre di Petri in autoclave, pennelli, carta da filtro, acqua distillata in una capsula di Petri contenente LB agar medium. Metti le foglie con uova aderenti in una capsula di Petri.Quindi rimuovere con cura le uova dalle foglie usando una pinza e trasferirle in un'altra capsula di Petri. Lavare queste uova con etanolo al 75% per otto minuti. Quindi ripetere il lavaggio quattro volte con acqua sterile.Trasferire le uova sul mezzo LB agar per preservare l'umidità per la schiusa. Posizionare la capsula di Petri in una camera di crescita e attendere che le uova si schiudano entro 24 ore. In una cappa di biosicurezza, piastrella tre pezzi di carta da filtro bagnata in una capsula di Petri e posiziona foglie di pioppo prive di germi sulla carta.Raccogli le larve e mettile sulle foglie. Sigillare la capsula di Petri con Parafilm e incubarla in una camera di crescita. Cambia le foglie ogni due giorni.Per i gruppi allevati convenzionalmente, trasferire le uova dalle foglie a una capsula di Petri contenente carta da filtro umida e nutrire queste larve con foglie di pioppo prive di germi. Seleziona casualmente tre larve di prima, seconda e terza stella dai gruppi privi di germi e allevati convenzionalmente. Seziona le terze larve di instar con forbici e pinze sterili al microscopio stereo e raccogli le loro viscere in tubi di microcentrifuga.Raccogli le larve intatte della prima e della seconda stella in tubi. Aggiungere 100 microlitri di PBS e tre sfere di acciaio ai tubi da 1,5 millilitri e macinare i tessuti in omogeneizzati utilizzando un omogeneizzatore che batte le perline. Aggiungere 100 microlitri dell'omogeneizzato al mezzo lb agar e alla piastra utilizzando un'asta di diffusione del vetro sterile.Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi osservare le colonie batteriche. Estrarre il DNA totale dei tessuti precedentemente ottenuti utilizzando un kit di estrazione del DNA e misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro.Amplificare il gene rRNA batterico 16S utilizzando primer universali di rRNA 16S con PCR, impostando la reazione come descritto nel manoscritto di testo. Conservare i prodotti PCR a quattro gradi Celsius fino a ulteriori analisi. Mescolare i prodotti PCR con colorante acido nucleico e analizzarli utilizzando l'elettroforesi su un gel di agarosio all'1% in tampone 1X TAE.Utilizzare 10 microlitri di un marcatore del DNA come riferimento. Osserva il gel con un transilluminatore UV e cerca il frammento target intorno a 1.500 paia di basi. Sebbene non siano state osservate colonie batteriche in nessun gruppo privo di germi, sono state osservate in tutti i gruppi allevati convenzionalmente, indicando che le larve di uova sterilizzate che sono state alimentate con foglie di pioppo coltivate con tessuti non contenevano batteri.Le bande PCR a 1.500 coppie di basi sono apparse in tutti i gruppi allevati convenzionalmente. Al contrario, nessuna banda è stata osservata nei gruppi privi di germi o nel controllo negativo, il che implica che non esistevano batteri intestinali nelle larve astoniche. Per le specie di insetti con uova minuscole, i tipi di disinfettanti e la durata della sterilizzazione dovevano essere ottimizzati.Inoltre, le endofite nelle piante coltivate con tessuti dovrebbero essere notevoli. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per mantenere gli insetti privi di germi, che è uno strumento utile per facilitare gli studi di interazione insetto-batteri intestinali, in particolare per gli insetti non modello senza diete artificiali ben sviluppate.

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Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare (Video) | JoVE Journal

Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare

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