Esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare
16 dicembre 2021
Il presente protocollo descrive la preparazione e la misurazione quantitativa di arginina libera e proteina-legata e metil-arginine mediante spettroscopia 1H-NMR.
Questo protocollo consente di quantificare i livelli e la dinamica della metilazione dell'arginina. Questa modifica svolge importanti ruoli regolatori e potrebbe servire come biomarcatore per la malattia. Il vantaggio di questo metodo è che fornisce un flusso di lavoro semplice per un numero quasi illimitato di matrici che vanno da cellule, media, tessuti e biofluidi.
La metilazione dell'arginina è elevata in molti tumori umani e i primi inibitori delle transferasi del metodo dell'arginina sono testati in studi clinici. Questo metodo potrebbe aiutare con la stratificazione dei pazienti e la valutazione del rischio. A dimostrare la procedura sarà Hansjorg Habisch, un tecnico di ricerca del mio laboratorio.
Per i campioni liquidi, aggiungere 400 microlitri di metanolo ghiacciato a 200 microlitri del campione seguito da incubazione per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare questo campione a 10.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Spostare il surnatante e raccogliere il pellet in tubi da 1,5 millilitri.
Per i materiali solidi, aggiungere 600 microlitri di acqua al 66% di metanolo in tubi di polpa contenenti da 30 a 60 milligrammi di pellet di tessuto o celle. Omogeneizzare il tessuto molle una volta per 20 secondi e il tessuto rigido due volte per 20 secondi con un intervallo di cinque minuti in mezzo. Posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio e trasferire tutto il lisato in un nuovo tubo da 1,5 millilitri, seguito dall'incubazione.
Quindi, centrifugare il campione a 10.000 G per 30 minuti. A quattro gradi Celsius, selezionare il surnatante in provette da 1,5 millilitri e procedere con l'idrolisi proteica utilizzando questo surnatante. Troncare i tappi di ciascun tubo.
Quindi aggiungere 500 microlitri di acido cloridrico a nove molari a ciascun campione. Infine, metti i tubi in tubi di vetro. Chiuderli saldamente con i tappi, assicurandosi una corretta tenuta, e posizionare questi tubi in un becher di vetro parzialmente riempito di sabbia.
Idrolizzare i campioni per 16 ore a 110 gradi Celsius in una camera di essiccazione. Raffreddare i campioni e liofilizzarli durante la notte utilizzando una centrifuga ad alto vuoto. Il giorno successivo, sciogliere i pellet completamente essiccati in un millilitro di acido cloridrico 0,1 molare.
Aggiungere 50 microlitri di cloroformio a ciascun tubo e sciogliere completamente il pellet utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri. Trasferire l'intero volume in una nuova provetta e centrifugare i campioni per 10 minuti. Raccogliere con cura la fase superiore del liquido bifasico in un nuovo tubo.
Utilizzare tubi di plastica per tubi manuali o tubi di vetro per l'estrazione robotizzata in fase solida. Per l'estrazione manuale in fase solida, precondizionare le cartucce in ogni ciclo seguito da una centrifugazione di un minuto. Successivamente, caricare il campione sulle cartucce SPE e centrifugarle a 600 G per due minuti a temperatura ambiente.
Lavare le cartucce con un millilitro di acqua tre volte, ogni lavaggio seguito da centrifugazione per un minuto. Quindi lavare cinque volte con un millilitro di acido cloridrico molare 0,1, seguito da centrifugazione per un minuto a 800 G a temperatura ambiente. Lavare le cartucce due volte con un millilitro di metanolo seguito da centrifugazione per un minuto.
Eluire l'arginina e i suoi derivati in un singolo tubo da 15 millilitri aggiungendo un millilitro di tre soluzioni sostitutive X e centrifugare due volte per un minuto. Per l'estrazione robotizzata in fase solida, posizionare i tubi per la raccolta degli eluati e i tubi di vetro contenenti la fase superiore del liquido bifasico nella rispettiva posizione del robot. Utilizzare un'applicazione o un metodo nel software in base ai passaggi descritti per SPE manuale.
Liofilizzare i campioni durante la notte per asciugare completamente per eliminare l'ammoniaca e l'acqua. Sciogliere ogni campione in 500 microlitri di tampone NMR fino a quando non diventa omogeneo. Quindi trasferire una quantità uguale di campione omogeneo a ciascuna provetta NMR.
Gli spettri J-RES degli idrolizzati proteici di lievito purificati utilizzando il protocollo SPE sono mostrati qui. Diversi cambiamenti chimici caratteristici possono discriminare L-arginina e ADMA a 3,25 e 3,02 parti per milione. Entrambe le sostanze possono essere separate e quantificate in una matrice cellulare.
Sulla base del numero di protoni del gruppo metilico o metilene specifico al rispettivo spostamento chimico, una spettroscopia di risonanza magnetica nucleare H consente una quantificazione precisa. Utilizzando questo approccio, gli spostamenti chimici di risonanza magnetica nucleare H di SDMA e MMA possono essere separati e quantificati da spostamenti chimici caratteristici a 2,76 parti per milione di SDMA e 2,74 parti per milione di MMA. Quando si esegue questo protocollo, raccogliere con cura la fase superiore del liquido bifasico contenente la frazione solubile in acqua con una pipetta e trasferirla in nuovi provette.
Utilizzare tubi da 1,5 millilitri per SPE manuale o vetro di classe per SPE robotizzati. Evitare di versare sul cloroformio e sul suo contenuto. Gli eluati contenenti arginina e le specie di arginina metilata vengono analizzati mediante spettroscopia NMR.
Questo produce quantità assolute di queste specie. La nostra tecnologia è attualmente utilizzata in una pletora di progetti di ricerca di base volti a sezionare il ruolo fisiopatologico della metilazione dell'arginina. Inoltre, stiamo valutando la metilazione dell'arginina proteica come candidato biomarcatore in diverse malattie umane.
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Panoramica
Questo protocollo consente la quantificazione dei livelli di metilazione dell'arginina, che sono significativi in diversi processi regolatori e possono fungere da biomarcatori di malattia. Il metodo è versatile e applicabile a un'ampia gamma di matrici biologiche, inclusi cellule, mezzi di coltura, tessuti e fluidi biologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Ricerca clinica
Sfondo
- La metilazione dell'arginina svolge ruoli regolatori cruciali nei processi cellulari.
- Questa modificazione è aumentata in molti tipi di cancro umano.
- Gli inibitori delle metiltransferasi dell'arginina sono attualmente in fase di sperimentazione in studi clinici.
- La quantificazione della metilazione dell'arginina può contribuire alla stratificazione dei pazienti e alla valutazione del rischio.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per misurare l'arginina libera e legata alle proteine e le metil-arginine.
- Esplorare la dinamica della metilazione dell'arginina in diversi contesti biologici.
- Valutare il potenziale della metilazione dell'arginina come biomarcatore per le malattie.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di campioni biologici.
- Misurazione quantitativa mediante spettroscopia 1 H-NMR.
- Applicazione su diverse matrici, inclusi cellule e fluidi biologici.
- Dimostrazione della procedura da parte di un tecnico di ricerca.
Risultati principali
- Il protocollo quantifica con successo i livelli di metilazione dell'arginina.
- Applicabilità dimostrata su una varietà di campioni biologici.
- Possibili implicazioni per la ricerca sul cancro e la valutazione dei pazienti.
- Un flusso di lavoro semplice aumenta l'accessibilità per i ricercatori.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio semplice per lo studio della metilazione dell'arginina.
- Si prospetta promettente per il progresso della ricerca nel campo del cancro e di altre malattie.
- Applicazioni future potrebbero migliorare gli esiti clinici grazie a una migliore stratificazione dei pazienti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione della dinamica della metilazione dell'arginina supporta la validazione degli obiettivi nei programmi di oncologia e nella scoperta di biomarcatori. Questo metodo basato su NMR consente la misurazione precisa di ADMA, SDMA, MMA e arginina in diverse matrici biologiche, fornendo un de-risking meccanicistico per i test di ipotesi terapeutiche. Il flusso di lavoro aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando i livelli di modificazione post-traduzionale allo stato della malattia e alla risposta ai farmaci.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della metilazione dell'arginina come meccanismo regolatorio nella funzione proteica e nelle vie di segnalazione.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro robusto per la quantificazione delle specie metil-arginina in campioni biologici complessi.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico correlando i livelli di metilazione ai fenotipi tumorali e alla risposta terapeutica.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative mediante NMR per l'arginina e i suoi derivati, consentendo la standardizzazione del saggio.
- Valore operativo: Include un passaggio di purificazione mediante SPE per rimuovere interferenti, garantendo un rilevamento riproducibile in matrici cellulari.
- Valore operativo: Compatibile con piattaforme SPE manuali e robotizzate per l'elaborazione scalabile dei campioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la valutazione dei biomarcatori misurando la dinamica della metilazione dell'arginina in sistemi rilevanti per le malattie.
- Valore operativo: Permette il monitoraggio longitudinale dei cambiamenti di metilazione in modelli preclinici e campioni di pazienti.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento con rischio calibrato fornendo dati sui biomarcatori per la stratificazione dei pazienti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla qualificazione del biomarcatore, consentendo decisioni basate sui dati a ogni fase.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando la metilazione dell'arginina in risposta a perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi pronti per il saggio sulle specie di metil-arginina dopo purificazione mediante SPE e analisi NMR.
- Analisi: Permette una quantificazione assoluta tramite integrazione dello spostamento chimico in 1H-NMR, consentendo il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica attraverso la misurazione di biomarcatori in modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'analisi del metiloma dell'arginina in diversi progetti e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso la misurazione diretta degli stati di modificazione post-traduzionale.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante purificazione con estrazione in fase solida (SPE) e rilevamento basato su NMR.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento/cessazione collegando i livelli di metilazione dell'arginina ai meccanismi della malattia e alla sensibilità ai farmaci.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione adeguata al rischio degli obiettivi basata su evidenze biomolecolari ottenute dal profilo di metilazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'idrolisi proteica, nelle tecniche di SPE e nell'uso della spettroscopia NMR.
- Necessita dell'accesso a spettrometri NMR ad alto campo e a strumentazione per SPE (manuale o robotizzata).
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di preparazione del campione e di analisi dei dati.
- Comporta la necessità di adattamenti per diversi tipi di campione (cellule, tessuti, fluidi biologici) durante l'idrolisi ed l'estrazione.
- Comprende limitazioni pratiche, come la saturazione della SPE a elevate concentrazioni di arginina (3 mmol/L) e la soglia di sensibilità (~100 nmol/L per ADMA).
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:58
Preliminary Sample Preparation
2:12
Protein Hydrolysis
3:21
Manual Solid-Phase Extraction
4:21
Robotic Solid Phase Extraction for NMR Sample Preparation
4:59
Results: Measurement of Arginine Methylome by NMR Spectroscopy
5:55
Conclusion
