Name: Esplorazione del metiloma dellarginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Scopri la quantificazione della metilazione dell'arginina mediante spettroscopia NMR. Questo metodo semplice analizza cellule, tessuti e biofluidi per studiare biomarcatori di malattie come il cancro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell'Austrian Science Fund (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (progetto faro DYNIMO), sovvenzioni dell'Agenzia austriaca per la promozione della ricerca (FFG) 864690 e 870454, dal Centro di ricerca sul metabolismo integrativo di Graz; Programma infrastrutturale austriaco 2016/2017, il governo della Stiria (Zukunftsfonds) e il Fondo di avvio per talenti di alto livello dell'Università di medicina del Fujian (XRCZX2021020). Ringraziamo il Centro di Ricerca Medica per l'accesso alle strutture di coltura cellulare. F.Z. è stato formato nell'ambito del programma di dottorato in medicina molecolare, Università di medicina di Graz. Q.Z. è stato addestrato nell'ambito del programma di dottorato in Malattie metaboliche e cardiovascolari, Università di Medicina di Graz.

Gli idrolizzati proteici di lievito sono stati utilizzati come campioni per i risultati rappresentativi di questo lavoro. L'intero protocollo è riassunto nella Figura 1.
1. Preparazione dei materiali e dei reagenti
<ol><li>Metanolo/acqua: preparare una miscela di due parti di metanolo al 99% (MeOH) e una parte di H 2 O, designata come MeOH/H2 O. Conservare MeOH puro e MeOH/H2Oa -20 °C per ridurre al minimo l'evaporazione dell'alcol e aumentare la stabilità del campione.</li>
	<li>Acido cloridrico (HCl): diluire 9 mol/L da HCl concentrato (12,0 mol/L o 37%) e 0,1 mol/L di HCl. La soluzione più concentrata (9 mol/L) viene utilizzata per l'idrolisi proteica, mentre quella concentrata più bassa (0,1 mol/L) viene utilizzata per l'estrazione in fase solida. ATTENZIONE: Lavorare all'interno della cappa aspirante.</li>
	<li>Preparare una soluzione sostitutiva per SPE contenente il 10% di una soluzione di ammoniaca satura (stock: 30% p/p di ammoniaca), il 50% di metanolo e il 40% di acqua (v/v).</li>
	<li>Tampone NMR: sciogliere 5,56 g di idrogeno fosfato disodico (Na 2 HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g di sale sodico di acido propionico 3-(trimetilsilil)-2,2,3,3-d4 (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) di azoturo di sodio (NaN3) in 500 mL di biossido di deuterio (D2O)e regolare a pH7,4 (utilizzando HCl o NaOH, rispettivamente) (vedi Tabella dei materiali). Controllare la purezza di ogni nuovo lotto tampone mediante spettroscopia NMR. NOTA: La quantità di eventuali contaminanti (ad esempio, etanolo) deve essere la più bassa possibile.</li>
	<li>Riempire i tubi di polpa con sfere di ossido di zirconio (tubi da 2 ml e perline da 1,4 mm sono adatti per la maggior parte delle applicazioni, ma sono disponibili diverse varianti) (vedi Tabella dei materiali). Riempi circa 10-20 perline a mano o acquista tubi preriempiti, che sono anche disponibili.</li>
	<li>Tenere a portata di mano le pipette e le rispettive punte nell'intervallo 10-1.000 μL. NOTA: L'acqua altamente pura, designatacome H 2 O, definita da un'elevata resistenza di ≥18,2 MΩ·cm-1, è stata utilizzata durante tutto il lavoro. Corrisponde all'acqua doppia distillata.</li>
</ol>2. Raccolta e conservazione dei campioni
<ol><li>Congelare i campioni liquidi (siero/plasma, coltura cellulare surnatante, ecc.) con azoto liquido e conservarli a -80 °C fino all'uso.</li>
	<li>Preparare i materiali solidi come indicato di seguito.<ol><li>Raccogliere le cellule da colture cellulari (3-5 milioni di cellule) sia raccogliendo cellule aderenti, dopo lavaggio con soluzione salina tamponata fosfato a freddo, raschiatura e centrifugazione, sia centrifugazione diretta di cellule cresciute in sospensione.</li>
		<li>Rimuovere i surnatanti cellulari (che potrebbero essere raccolti per ulteriori analisi, mediante misurazione diretta consecutiva, vedi punto 6, o dopo precipitazione di proteine solubili, vedi punto 3.1), quindi congelare i pellet con azoto liquido e conservarli a -80 °C. Per ulteriori elaborazioni, vedere il passaggio 3.2.</li>
		<li>Conservare e raccogliere i tessuti secondo lo scopo dello studio. Per tessuti molto omogenei, come il fegato o il muscolo, analizzarne qualsiasi parte. Ad esempio, nel caso di un cervello di topo, determinare la metilazione globale dell'arginina dell'intero cervello o sezioni cerebrali. NOTA: Il peso ideale dei tessuti da trattare è 30-60 mg. Si consiglia di congelare e polverizzare l'intero cervello e utilizzare aliquote di esso. In alternativa, possono essere utilizzate parti specifiche del cervello (ad esempio, frontale, cervelletto, regioni occipitali o un emisfero, del peso di ~ 250 mg).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparazione preliminare del campione
NOTA: Eseguire il lavoro sul ghiaccio, mantenendo MeOH freddo. I campioni devono inoltre essere conservati su ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine.
<ol><li>Per i campioni liquidi, aggiungere 400 μL di metanolo ghiacciato a 200 μL del campione. Continuare con il passaggio 3.3. NOTA: se è disponibile meno campione, regolare i volumi di conseguenza; La sensibilità NMR è solitamente abbastanza elevata per quantità di campione più piccole, ma deve essere testata individualmente.</li>
	<li>Nel caso di materiali solidi, preparare provette da 1,5 ml sufficienti per i lisati (utilizzare per la centrifugazione dopo l'omogeneizzazione).<ol><li>Con attenzione, ma accuratamente, risospendere i pellet cellulari in 600 μL di MeOH/H2O e trasferire l'intera fase liquida nei tubi di spappolatura.</li>
		<li>Metti i tessuti in provette di polpa (puoi pesarli direttamente nei tubi) e aggiungi 600 μL di MeOH / H2O (per 30-60 mg; regola se il peso differisce sostanzialmente).</li>
		<li>Inserire i tubi nell'omogeneizzatore tissutale (vedere Tabella dei materiali) e omogeneizzare una volta per 20 s con forti agitazioni (per pellet cellulari, tessuti molli) o due volte per 20 s ciascuno (o più a lungo se necessario) con un intervallo di 5 minuti in mezzo (per tessuti rigidi).</li>
		<li>Dopo l'omogeneizzazione, rimettere immediatamente i campioni sul ghiaccio e trasferire l'intero lisato in nuove provette da 1,5 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservare i campioni per almeno 30 minuti (fino a diversi giorni) a -20 °C prima di un'ulteriore lavorazione.</li>
	<li>Centrifugare a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Nel frattempo, preparare provette da 1,5 ml sufficienti per raccogliere i surnatanti NOTA: Questo surnatante (designato "(1)" nella Figura 1) potrebbe essere scartato, essere liofilizzato ed elaborato direttamente per NMR (fase 6) o analizzato in altro modo.</li>
	<li>In questo protocollo, il precipitato di MeOH (= pellet ottenuto dopo la fase 3.1 o 3.2.2, rispettivamente) viene utilizzato per ulteriori analisi contenenti, tra l'altro, componenti quali acidi nucleici e lipidi, proteine arginina-metilate. Continuare con l'idrolisi proteica o conservare i pellet a -20 °C per alcuni giorni.</li>
</ol>4. Idrolisi proteica
<ol><li>Aggiungere 500 μL di 9 mol/L di HCl a ciascun campione. Quindi, troncare i tappi di ciascun tubo con le forbici e inserirli nei tubi di coltura di vetro (Figura 2A). Con attenzione, ma strettamente, chiudere i tappi rossi (controllando così la sigillatura). NOTA: Prima dell'uso, controllare sempre ogni guarnizione (pellicola di PTFE grigia all'interno dei tappi a vite rossi) per un corretto serraggio e pulirli regolarmente con acqua.</li>
	<li>Al termine, posizionare i tubi in un becher parzialmente riempito di sabbia (per un migliore trasferimento di calore) e idrolizzare i campioni per circa 16 ore a 110 °C in una camera di essiccazione.</li>
	<li>Dopo l'idrolisi, raffreddare i campioni (~1 h).</li>
	<li>Successivamente, liofilizzare durante la notte utilizzando una centrifuga ad alto vuoto (inferiore a 100 Pa).</li>
	<li>Sciogliere i pellet - se completamente asciutti (in caso contrario, continuare la liofilizzazione) - in 1 mL di 0,1 mol/L HCl e aggiungere 50 μL di cloroformio (CHCl3) a ciascun tubo; Sciogliere accuratamente il pellet con una pipetta da 1.000 μL, mescolando così i liquidi, quindi trasferire l'intero volume in un nuovo tubo. ATTENZIONE: Lavorare sempre con piccole quantità per ridurre al minimo l'evaporazione estesa</li>
	<li>Quindi, centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Raccogliere con cura la fase superiore del liquido bifasico contenente la frazione solubile in acqua (Figura 2B, la frazione con la densità inferiore) con una pipetta e riempirla in nuovi tubi. Utilizzare tubi da 1,5 mL per SPE manuale (punto 5.2) o flaconcini di vetro per SPE robotizzati (punto 5.3 e figura 2D). Evitare di versare su CHCl3 e il suo contenuto (Figura 2C).</li>
</ol>5. Estrazione in fase solida (SPE)
<ol><li>Prima del primo utilizzo, pulire le cartucce SPE due volte con 1 mL della soluzione sostitutiva (fase 1.3) seguita da centrifugazione a 800 x g per 1 minuto a temperatura ambiente (posto in provette da 15 ml). Possono essere utilizzati 10-20 volte ciascuno.</li>
	<li>SPE manuale<ol><li>Precondizionare le cartucce (vedere la tabella dei materiali) in ogni ciclo con 1 mL di metanolo puro e 2 x 1 mL di PBS, seguita ogni volta da centrifugazione a 800 x g per 1 minuto a temperatura ambiente (posta in tubi da 15 ml).</li>
		<li>Successivamente, caricare i campioni (dal punto 4.7) sulle cartucce SPE e centrifugarli a 600 x g per 2 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Quindi, applicare un ciclo di lavaggio come indicato di seguito.<ol><li>Aggiungere tre volte 1 mL di H2O (ciascuno seguito da centrifugazione per 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).</li>
			<li>Aggiungere cinque volte 1 mL di 0,1 mol/L HCl (ciascuno seguito da centrifugazione per 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).</li>
			<li>Aggiungere due volte 1 mL di MeOH (ciascuno seguito da centrifugazione per 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).</li>
		</ol></li>
		<li>Quindi, eluire l'arginina e i suoi derivati con 3 x 1 mL di soluzione sostitutiva (seguita da centrifugazione 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente) in un singolo tubo da 15 ml. NOTA: La soluzione sostitutiva funge da eluente per l'arginina e derivati e viene utilizzata anche per la pulizia delle cartucce (tutte le sostanze vengono lavate prima dell'eluizione o al valore pH basico della soluzione sostitutiva). Tuttavia, per evitare la contaminazione nel tempo, il riutilizzo dovrebbe essere limitato (vedere il passaggio 5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>SPE robotica NOTA: Qui, un robot per pipettaggio (la parte principale costituita da un ago per pipettaggio, una stazione di lavaggio per l'ago, una fornitura di reagenti e posizioni per campioni ed eluati, vedi Tabella dei materiali) viene fornito con un portacartucce per le colonne SPE. Per altri strumenti, assicurati di essere completamente equipaggiato con tutte le cose elencate.<ol><li>Riempire il surnatante (dal punto 4.7) direttamente in flaconcini di vetro con sigillante in PTFE (Figura 2D), preparare un numero sufficiente di reagenti (100 mL di ciascuno, cioè soluzione sostitutiva, 99% di MeOH, PBS, H 2 Oe 0,1 di mol/L HCl), tubi da 5 mL per l'eluizione e soluzione di lavaggio per l'ago del robot (di solito H2O).</li>
		<li>Utilizzare un'applicazione o un metodo nel software del robot basato esattamente sui passaggi descritti per SPE manuale (passo 5.2). NOTA: I dettagli possono variare molto tra i fornitori di strumenti, quindi fare riferimento al manuale del software del rispettivo robot per la programmazione. Un robot di pipettaggio di solito funziona applicando la pressione dell'aria sulle cartucce invece della centrifugazione, che è la differenza principale. Se il protocollo viene stabilito ed eseguito per la prima volta, includere controlli (ad esempio, L-arginina di concentrazione nota) per verificare un flusso di lavoro ottimale.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Preparazione finale per la RMN
<ol><li>Campioni di liofilizzazione durante la notte per completare la secchezza per eliminare l'ammoniaca e H2O.</li>
	<li>Sciogliere ciascun campione in 500 μL di tampone NMR (fase 1.4) e trasferirlo in provette NMR. È importante sottolineare che il volume deve essere lo stesso in tutte le provette e i campioni devono essere omogenei (privi di residui e lipidi, che tendono ad aggregarsi). NOTA: I dettagli della spettroscopia NMR vanno oltre questa revisione del metodo e sono descritti più dettagliatamente altrove27. Qui, vengono spiegati solo i requisiti e i passaggi principali. La quantificazione dell'arginina e dei suoi metaboliti viene eseguita su uno spettrometro NMR a 600 MHz (vedi Tabella dei materiali). In linea di principio, è possibile utilizzare qualsiasi altra intensità di campo dello spettrometro NMR/NMR, a condizione che i segnali NMR dell'arginina e delle arginine metilate possano essere rilevati con sufficiente sensibilità e senza sovrapposizione di segnali. È possibile utilizzare qualsiasi testa di sonda con gradienti dell'asse z in grado di registrare 1spettro H, a condizione che le sequenze di impulsi siano impostate di conseguenza.</li>
	<li>Registrare uno spettro 1D utilizzando la sequenza di impulsi CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 scansioni, dimensione di fid 73728, larghezza spettrale 11904,76 Hz su un NMR a 600 MHz, ritardo di riciclo 4 s) con soppressione del segnale dell'acqua utilizzando la presaturazione.</li>
	<li>In questi esperimenti, rimuovere gli accoppiamenti scalari 1H mediante disaccoppiamento virtuale, riducendo la sovrapposizione del segnale. Registrare ulteriori per domande specifiche e/o campioni o matrici complesse, ad esempio 1H-13 C-eteronucleare singolo spettro di coerenza quantistica (HSQC) H-1327. NOTA: Per matrici più complesse in cui i segnali NMR1 H di arginine metilate potrebbero essere parzialmente sovrapposti a segnali NMR 1H di altri metaboliti (ad esempio, lisina), sono necessari spettri omo-nucleari J-risolti (JRES)35 H.</li>
	<li>Eseguire la quantificazione assoluta integrando le rispettive intensità di picco degli standard di una concentrazione nota, ad esempio 100 μmol / arginina. NOTA: Di routine, ADMA, SDMA e MMA (vedere la tabella dei materiali) sono riportati come rapporto relativo all'arginina. Ciò ha un vantaggio significativo che non è necessario eseguire alcuna normalizzazione separata (ad esempio, numero di cellule, massa tissutale, concentrazioni proteiche). In tal caso, l'arginina funge da standard interno e la quantificazione relativa è sufficiente per ottenere informazioni biologicamente rilevanti.</li>
	<li>Per differenziare SDMA e MMA, liofilizzare nuovamente i campioni per eliminare D2O (se sono stati risospesi in tampone NMR in precedenza), che viene poi sostituito da dimetilsolfossido deuterato (d 6-DMSO), consentendo la risoluzione delle risonanze metiliche27. Pertanto, aspirare i campioni dalle provette NMR con pipette Pasteur, liofilizzarli e scioglierli in 500 μL di d6-DMSO.</li>
</ol>

<ol><li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation%2C+functions+and+clinical+relevance+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).</li>
<li>Bachand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases%3A+from+unicellular+eukaryotes+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans.</a> Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).</li>
<li>Wang, Y. C., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+protein+arginine+methyltransferases+in+non-mammalian+animal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems.</a> FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).</li>
<li>Ahmad, A., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+PRMTs+broaden+the+scope+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).</li>
<li>Fisk, J. C., Read, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in parasitic protozoa.</a> Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).</li>
<li>Hofweber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+FUS+Is+Suppressed+by+Its+Nuclear+Import+Receptor+and+Arginine+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation.</a> Cell. 173 (3), 706-719 (2018).</li>
<li>Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGG%2FRG+Motif+Regions+in+RNA+Binding+and+Phase+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).</li>
<li>Nott, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transition+of+a+disordered+nuage+protein+generates+environmentally+responsive+membraneless+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles.</a> Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).</li>
<li>Fong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+RNA+splicing+catalysis+through+inhibition+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation.</a> Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+arginine+methylation+in+breast+cancer%3A+emerging+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).</li>
<li>Gulla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+5+has+prognostic+relevance+and+is+a+druggable+target+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma.</a> Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomic+evaluation+of+arginine+methylation+and+cardiovascular+risks%3A+potential+mechanisms+beyond+nitric+oxide+synthase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).</li>
<li>Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN%2C+the+product+of+the+spinal+muscular+atrophy+gene%2C+binds+preferentially+to+dimethylarginine-containing+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets.</a> Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).</li>
<li>Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+arginine+methylation+of+organ+proteins+during+the+development+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).</li>
<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+methylarginine+metabolism+in+the+cardiovascular+system+identifies+the+lung+as+a+major+source+of+ADMA%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).</li>
<li>Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+arginine+methylation+to+ADMA%3A+a+novel+mechanism+with+therapeutic+potential+in+chronic+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases.</a> BMC Pulmonary Medicine. 9, 5(2009).</li>
<li>Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+axis+of+protein+arginine+methylation+and+asymmetric+dimethylarginine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).</li>
<li>Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+pesticide+research+and+development%3A+review+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives.</a> Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).</li>
<li>Chiang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT5+Is+a+Critical+Regulator+of+Breast+Cancer+Stem+Cell+Function+via+Histone+Methylation+and+FOXP1+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression.</a> Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).</li>
<li>Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT7+preserves+satellite+cell+regenerative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity.</a> Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).</li>
<li>Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+asymmetric+arginine+methylation+during+replicative+and+H2O2-induced+premature+senescence+in+WI-38+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts.</a> Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).</li>
<li>Bhatter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+augments+Sbp1+function+in+translation+repression+and+decapping%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping.</a> FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein arginine methylation.</a> Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).</li>
<li>Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-incorporated+methylated+arginine+reference+values+in+healthy+subjects+whole+blood+and+evaluation+of+factors+affecting+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation.</a> Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).</li>
<li>Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+hydrolysis+method+on+the+determination+of+the+amino+acid+composition+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins.</a> Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).</li>
<li>Davids, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+asymmetric+and+symmetric+dimethylarginine%2C+L-monomethylarginine%2C+L-arginine%2C+and+L-homoarginine+in+biological+samples+using+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).</li>
<li>Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+metabolomics+as+emerging+tool+to+study+autophagy+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation.</a> Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).</li>
<li>Vignoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolomics+by+1D+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolomics by 1D NMR.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).</li>
<li>Carr, H. Y., Purcell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diffusion+on+free+precession+in+nuclear+magnetic+resonance+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments.</a> Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times.</a> Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).</li>
<li>Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+1H+n.m.r.+spectroscopy+for+studies+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).</li>
<li>Stryeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentrations+of+Citrate%2C+Tyrosine%2C+2-+and+3-+Hydroxybutyrate+are+associated+with+increased+3-month+mortality+in+acute+heart+failure+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6743(2019).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+landscape+of+metabolic+dysregulation+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing.</a> Biomolecules. 11 (2), (2021).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+human+hepatocellular+tumors+undergo+a+global+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming.</a> Cancers. 13 (8), (2021).</li>
<li>Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation%3A+Cellular+functions+and+methods+of+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).</li>
<li>Habisch, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroectodermally+converted+human+mesenchymal+stromal+cells+provide+cytoprotective+effects+on+neural+stem+cells+and+inhibit+their+glial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation.</a> Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).</li>
<li>Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+ultrasensitive+luminescence+assay+for+protein+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).</li>
<li>Hevel, J. M., Price, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+direct+measurement+of+methyltransferase+activity+in+about+30min%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min.</a> Methods. 175, 3-9 (2020).</li>
<li>Altincekic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+detection+of+arginine+methylation+in+highly+repetitive+protein+motifs+of+low+sequence+complexity+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).</li>
<li>Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FUS+about+arginine+methylation+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD.</a> The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Nella sezione seguente, l'attenzione principale si trova sul metodo stesso; le implicazioni biologiche della metilazione dell'arginina sono descritte nella sezione Introduzione.
In primo luogo, i tessuti di diversa rigidità potrebbero richiedere un aggiustamento della lisi del campione: le cellule provenienti da colture cellulari (inclusi batteri, lieviti, ecc.) e tessuti come cervello, fegato giovane, muscolatura liscia, ecc., Possono essere rapidamente omogeneizzati. Per i tessuti ad alta ri...

Negli ultimi due decenni, la metilazione dei residui di arginina è stata riconosciuta come una modificazione post-traduzionale essenziale delle proteine. Colpisce processi biologici fondamentali come la regolazione della trascrizione, la trasduzione del segnale e molti altri1. Le principali proteine coinvolte nella regolazione della metilazione dell'arginina sono le proteine arginina metiltransferasi (PRMT)2. I principali derivati dell'arginina sono la ω-(N G,N G)-dimetilarginina asimmetrica (ADMA), la dimetilarginina ω-(N G,N'G)-simmetrica (SDMA) e la ω-N G-monometilarginina (MMA)2.
I PRMT usano S-adenosil-l-metionina per trasferire i gruppi metilici al gruppo guanidino terminale (con due gruppi amminici equivalenti) dell'arginina1 legata alle proteine. Si possono distinguere due enzimi principali: sia gli enzimi di tipo I che quelli di tipo II catalizzano la prima fase di metilazione per formare MMA (che quindi perde la sua simmetria). Seguendo questa fase, gli enzimi di tipo I (ad esempio, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) usano MMA come substrato per formare ADMA, mentre gli enzimi di tipo II (principalmente PRMT5 e PRMT9) producono SDMA. PRMT1 è stata la prima proteina arginina metiltransferasi ad essere isolata da cellule di mammifero3. Tuttavia, i PRMT sono stati evolutivamente conservati4 in altri animali come vertebrati non mammiferi, cordati invertebrati, echinodermi, artropodi e nematodi cnidari5, piante6 e protozoi, compresi funghi come il lievito7. In molti casi, il knockout di uno dei PRMT porta alla perdita di vitalità, rivelando il ruolo essenziale delle specie di arginina metilata coinvolte in processi cellulari fondamentali come la trascrizione, la traduzione, la trasduzione del segnale, l'apoptosi e la separazione di fase liquido-liquido (cioè la formazione di organelli senza membrana, ad esempio nucleoli), che coinvolge regolarmente domini ricchi di arginina 8,9,10 . A sua volta, questo influenza la fisiologia e gli stati patologici, tra cui il cancro 11,12,13, il mieloma multiplo 14, le malattie cardiovascolari15, la patogenesi virale, l'atrofia muscolare spinale 16, il diabete mellito 17 e l'invecchiamento1. Si ritiene che l'aumento dei livelli di ADMA nel sangue, ad esempio, derivato dal polmone18 a causa della disgregazione proteica, sia collegato alla disfunzione endoteliale, alla malattia polmonare cronica19 e ad altre sindromi di malattie cardiovascolari20. È stato riscontrato che la sovraespressione dei PRMT accelera la tumorigenesi ed è associata a prognosi infausta21,22. Inoltre, l'ablazione di PRMT6 e PRMT7 innesca un fenotipo di senescenza cellulare23. Una significativa diminuzione di ADMA e PRMT1 è stata riscontrata durante l'invecchiamento dei fibroblasti WI-3824.
La sfida è capire come agisce la metilazione nei processi (pato)fisiologici identificando e quantificando la metilazione dell'arginina proteica. La maggior parte degli approcci attuali utilizza anticorpi per rilevare arginine metilate. Tuttavia, questi anticorpi sono ancora specifici del contesto e potrebbero non riuscire a riconoscere diversi motivi di proteine metilate dell'arginina25,26. Nel protocollo descritto, tutti i derivati dell'arginina menzionati sopra possono essere quantificati in modo affidabile mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), cioè da soli, in combinazione o, come nella maggior parte dei casi, all'interno di matrici biologiche complesse come cellule eucariotiche (ad esempio, da lievito, topo o origine umana) e tessuti27, così come siero28. Per le proteine e quelle matrici complesse, l'idrolisi proteica29 è un prerequisito per generare aminoacidi liberi (modificati), come arginina, MMA, SDMA e ADMA. L'estrazione in fase solida (SPE)30 consente l'arricchimento dei composti di interesse. Infine, la spettroscopia 1H-NMR permette la rilevazione parallela dell'arginina e di tutti i principali derivati metilici dell'arginina. La spettroscopia NMR ha il vantaggio di essere veramente quantitativa, altamente riproducibile e una tecnica robusta31,32. Le misurazioni NMR finali possono essere eseguite in seguito, quando sono stati raccolti e preparati molti campioni. Infine, questo protocollo si concentra principalmente sulla preparazione del campione in quanto ciò non richiede un proprio spettrometro NMR. Può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori biochimici. Tuttavia, alcuni suggerimenti su quali misure di spettroscopia NMR dovrebbero essere fatte sono forniti in questo lavoro.

<table><tbody><tr><td>Provette da 15 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>acido 3-(trimetilsilil) propionico-2,2,3,3-d4 sale sodico (TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>provette da 5 mL, fondo tondo</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di ammoniaca 32%</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz spettrometro NMR, dotato di una testa di sonda TXI</td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata, ad es. 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio &ge; 99% annuo</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>fluido termovettore per sistema SpeedVac</td></tr><tr><td>Ossido di deuterio (D2O)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido-d6 (d6-DMSO)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Legante a camera di essiccazione</td><td></td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>Provette per coltura DIRAN, 13 x 100 mm, GL 14, 9 mL</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards Pompa per olio a vuoto profondo RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>parte del sistema SpeedVac Provette Eppendorf</td></tr><tr><td>da 1,5 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Robot di pipettaggio Gilson GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td></td><td></td>26150008</tr><tr><td>L-arginina</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo &ge; 99%</td><td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q acqua aparatus</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartucce Waters</td><td></td><td>186000252</td><td>https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/</td></tr> <tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 omogeneizzatore tissutale</td><td>Bertin Strumenti</td><td>P000669-PR240-A</td><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td></tr> <tr><td>Tubi Precellys (tubi per spappolamento)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Perle di ossido di zirconio Precellyse da 1,4 mm VWR</td><td>International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap Moduli di riscaldamento, agitazione ed evaporazione</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18820</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820</td></tr><tr><td>Rotore per provette da 1,5 mL, FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant Savant Sappone di raffreddamento refrigerato</td><td>Thermo Scientific</td><td>15996161</td><td>parte del sistema SpeedVac Savant</td></tr><tr><td>SpeedVac concentratore sottovuoto SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>parte del sistema SpeedVac; equipaggiato con rotore per provette da 1,5 ml</td></tr><tr><td>Tappi a vite per fiale di vetro con guarnizione in PTFE, DN9</td><td>Dr. R. Forche Cromatografia</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di vetro a filettatura corta 1,5 mL, ND9</td><td>Dr. R. Forche Cromatografia</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>Azide di sodio (NaN3)</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (Software)</td><td>Bruker-https://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-dimetilarginina asimmetrica (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-monometilarginina (MMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-NG'-dimetilarginina simmetrica (SDMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

L'arginina legata alle proteine è comunemente metilata in molte proteine e regola la loro funzione alterando le proprietà fisico-chimiche, la loro interazione con altre molecole, comprese altre proteine o acidi nucleici. Questo lavoro presenta un protocollo facilmente implementabile per quantificare l'arginina e i suoi derivati, tra cui la dimetilarginina asimmetrica e simmetrica (ADMA e SDMA, rispettivamente) e la monometilarginina (MMA). Dopo l'isolamento proteico da fluidi corporei biologici, tessuti o lisati cellulari, viene descritto un metodo semplice per l'omogeneizzazione, la precipitazione delle proteine e l'idrolisi proteica. Poiché gli idrolizzati contengono molti altri componenti, come altri amminoacidi, lipidi e acidi nucleici, è essenziale una fase di purificazione mediante estrazione in fase solida (SPE). SPE può essere eseguita manualmente utilizzando centrifughe o un robot di pipettaggio. La sensibilità per ADMA utilizzando il protocollo corrente è di circa 100 nmol/L. Il limite superiore di rilevazione per l'arginina è di 3 mmol / L a causa della saturazione SPE. In sintesi, questo protocollo descrive un metodo robusto, che spazia dalla preparazione del campione biologico al rilevamento basato su NMR, fornendo preziosi suggerimenti e insidie per un lavoro di successo nello studio del metiloma dell'arginina.

Di routine, proiezioni 1H 1D di spettri NMR 2D J-risolti (JRES), virtualmente disaccoppiati vengono utilizzate per assegnazioni e quantificazioni di picco nel nostro laboratorio36. La figura 3 mostra spettri JRES rappresentativi di idrolizzati proteici di lievito purificati utilizzando l'attuale protocollo SPE. Sebbene a concentrazioni molto diverse, entrambe le sostanze possono essere separate e quantificate in una matrice cellulare. Sulla base del numero ...

Il presente protocollo descrive la preparazione e la misurazione quantitativa di arginina libera e proteina-legata e metil-arginine mediante spettroscopia 1H-NMR.

Esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Questo protocollo consente di quantificare i livelli e la dinamica della metilazione dell'arginina. Questa modifica svolge importanti ruoli regolatori e potrebbe servire come biomarcatore per la malattia. Il vantaggio di questo metodo è che fornisce un flusso di lavoro semplice per un numero quasi illimitato di matrici che vanno da cellule, media, tessuti e biofluidi.La metilazione dell'arginina è elevata in molti tumori umani e i primi inibitori delle transferasi del metodo dell'arginina sono testati in studi clinici. Questo metodo potrebbe aiutare con la stratificazione dei pazienti e la valutazione del rischio. A dimostrare la procedura sarà Hansjorg Habisch, un tecnico di ricerca del mio laboratorio.Per i campioni liquidi, aggiungere 400 microlitri di metanolo ghiacciato a 200 microlitri del campione seguito da incubazione per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare questo campione a 10.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Spostare il surnatante e raccogliere il pellet in tubi da 1,5 millilitri.Per i materiali solidi, aggiungere 600 microlitri di acqua al 66% di metanolo in tubi di polpa contenenti da 30 a 60 milligrammi di pellet di tessuto o celle. Omogeneizza

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Vengono descritti due metodi per assegnare i segnali di risonanza magnetica nucleare α- e ε-dimetilammina di una lisina N-terminale riduttivamente metilata 13C. Un metodo utilizza la selettività indotta dal pH della reazione di metilazione riduttiva e l'altro utilizza l'aminopeptidasi per rimuovere selettivamente la lisina N-terminale.

Metodi per identificare le risonanze NMR dell'ammina 13C-dimetil N-terminale su proteine metilate riduttivamente

Proteine ​​arginina metilazione, catalizzata da una classe di enzimi viz., Proteina arginina metil transferasi (PRMTs), è il processo di aggiunta enzimatica di gruppi metile (s) per arginines all'interno di proteine. Il test in vitro metilazione è lo strumento più affidabile per valutare lo stato di metilazione di substrati PRMT noti o nuovi.

In vitro metilazione Assay per studiare proteine ​​Arginina Metilazione

Gli array di peptidi sintetizzati con il metodo SPOT possono essere utilizzati per analizzare la specificità del substrato delle proteine lisina metiltransferasi (PKMT) e per definire lo spettro del substrato delle PKMT per comprendere il loro ruolo biologico. Questo protocollo descrive come sintetizzare array di peptidi, metilarli con PKMT e analizzare i risultati.

Analisi Specificità di proteine ​​lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array

La metilazione del DNA è in grado di mantenere stabili i livelli di espressione genica e di consentire cambiamenti dinamici nell'espressione genica in risposta a una varietà di stimoli. Descriviamo in dettaglio le tecniche che consentono lo studio dei cambiamenti gene-specifici nella metilazione del DNA e l'effetto di questi cambiamenti sull'espressione genica.

Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Questo protocollo descrive la ricostituzione dei nucleosomi contenenti modo differenziale istoni sorella marcati con isotopi. Allo stesso tempo, nucleosomi asimmetricamente post-traduzionali modificati possono essere generati dopo utilizzando una copia istone premodified. Queste preparazioni possono essere facilmente utilizzati per studiare i meccanismi modifica diafonia, contemporaneamente su entrambi istoni sorella, utilizzando la spettroscopia NMR ad alta risoluzione.

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

La proteina arginina (R)-metilazione è una diffusa modificazione post-traduzionale che regola molteplici percorsi biologici. La spettrometria di massa è la migliore tecnologia per profilare globalmente il R-metil-proteoma, quando accoppiata ad approcci biochimici per l'arricchimento peptidico modificato. Il flusso di lavoro progettato per l'identificazione ad alta confidenza della R-metilazione globale nelle cellule umane è descritto qui.

Un approccio proteomico basato sulla spettrometria di massa per l'analisi globale e ad alta confidenza della R-metilazione delle proteine

Questi protocolli forniscono la metodologia utilizzata per valutare l'attività enzimatica dei singoli membri della proteina arginina metiltransferasi (PRMT) nelle cellule. Vengono descritte linee guida dettagliate sulla valutazione dell'attività delle PRMT utilizzando biomarcatori endogeni ed esogeni, anticorpi di riconoscimento metil-arginina e composti degli utensili inibitori.

Metodi quantitativi per studiare l'attività delle proteine arginina metiltransferasi 1-9 nelle cellule

Qui, presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio l'acquisizione, l'elaborazione e l'analisi di una serie di esperimenti NMR volti a caratterizzare le interazioni proteina-glicano in soluzione. Vengono descritte le metodologie più comuni basate su ligandi e proteine, che indubbiamente contribuiscono ai campi della glicobiologia strutturale e degli studi di riconoscimento molecolare.

Districare le interazioni glicano-proteina: la risonanza magnetica nucleare (NMR) in soccorso

Qui presentiamo un protocollo per valutare semi-quantitativamente i livelli globali di m⁶A utilizzando dot blot. L'RNA totale viene estratto, denaturato, maculato su una membrana di nylon, sondato con anticorpi anti-m⁶A e visualizzato tramite chemiluminescenza. L'intensità del segnale, quantificata dall'analisi in scala di grigi ImageJ, riflette l'abbondanza relativa di metilazione, fornendo un flusso di lavoro riproducibile per la ricerca.

Test Dot Blot per Rilevare i Livelli Globali di Modifica dell'RNAN 6-metiladenosina

La polarizzazione nucleare dinamica con successiva dissoluzione del campione ha permesso studi in tempo reale del metabolismo nei sistemi biologici. Il [1-13C]piruvato iperpolarizzato è stato utilizzato per studiare l'attività della lattato deidrogenasi in una linea cellulare di carcinoma prostatico in vitro.

hyperpolarized 13 C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e Imaging

Scopri la quantificazione della metilazione dell'arginina mediante spettroscopia NMR. Questo metodo semplice analizza cellule, tessuti e biofluidi per studiare biomarcatori di malattie come il cancro.

Esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare

Esplora altri video