Name: Approcci cartografici chimici per studiare linfezione da tripanosomatidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Impara la cartografia chimica per modellare la distribuzione 3D di metaboliti e parassiti tripanosomatidi nei tessuti. Questo metodo consente di analizzare le perturbazioni metaboliche locali e i sintomi clinici.

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Laura-Isobel McCall, PhD, ha ricevuto un Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Award dal Burroughs Wellcome Fund. Gli autori desiderano inoltre riconoscere il sostegno del numero di premio NIH R21AI148886, una sovvenzione pilota dell'Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) con il numero di premio NIH P20GM103648 e fondi di start-up dell'Università dell'Oklahoma (a LIM). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei finanziatori. Gli autori desiderano anche ringraziare gli sviluppatori degli strumenti utilizzati in questo protocollo. Sono state citate, ove applicabile, tutte le pubblicazioni pertinenti.

Nessun conflitto di interessi da segnalare.

Comprendere le infezioni da tripanosomatidi è essenziale per guidare lo sviluppo di nuovi farmaci e approcci terapeutici. Questo metodo di cartografia chimica è pronto a fornire informazioni utili sulla relazione tra metabolismo e patogenesi della malattia tripanosomatidica, rispondendo così a questa esigenza traslazionale.
Solo i solventi di grado LC-MS sono raccomandati durante l'estrazione dei metaboliti e le analisi ms, per ridurre la contaminazione di fondo. La contaminazione polimerica35, comunemente derivata da film di paraffina e/o altre materie plastiche36,37,38, deve essere evitata ove possibile. Parafilm, in particolare, non deve mai essere utilizzato. Questi aspetti sono cruciali poiché la qualità dei dati LC-MS dipende dai materiali utilizzati durante la preparazione del campione e l'estrazione dei metaboliti. La qualità dei dati dovrebbe essere garantita prima di generare grafici. Inoltre, la generazione di queste mappe metabolomiche spaziali complete richiede la raccolta di tutti i campioni di tessuto adiacenti e l'estrazione di metaboliti da tutti i campioni raccolti per evitare lacune in queste mappe. Le procedure di raccolta, la logistica dell'estrazione dei metaboliti e l'analisi LC-MS e i costi dovrebbero quindi essere considerati e pianificati di conseguenza.
Questo protocollo può essere modificato per soddisfare le esigenze degli utenti in diversi modi. Ad esempio, la polarità e la solubilità dei solventi utilizzati durante l'estrazione dei metaboliti influenzeranno i metaboliti rilevati39. Per massimizzare la diversità delle caratteristiche dei metaboliti rilevati per le analisi cartografiche chimiche non mirate, si raccomanda di combinare più fasi di estrazione e solventi. Ad esempio, questo metodo utilizza diclorometano, metanolo e acqua come solventi di estrazione perché consentono il rilevamento accurato di molecole non polari e polari20,40. Tuttavia, questi solventi non sono universalmente adatti per ogni esperimento di SM e i ricercatori dovrebbero selezionare i solventi da estrazione in base agli obiettivi del loro progetto. Allo stesso modo, possono essere utilizzate diverse condizioni LC-MS/ MS, come la sostituzione della cromatografia a fase inversa con la cromatografia a fase normale. Colonne alternative possono anche essere utilizzate per la raccolta di dati in fase inversa invece della cromatografia C8, anche se empiricamente, la cromatografia C8 è più robusta per i lipidi tissutali e ha una frequenza di intasamento inferiore. Concettualmente, questi protocolli possono essere applicati anche ad altri metodi di spettrometria di massa come la gascromatografia-spettrometria di massa, ecc.
Un approccio alternativo è l'imaging della spettrometria di massa. Infatti, a differenza degli approcci di imaging con spettrometria di massa, la cromatografia liquida-spettrometria di massa non conserva intrinsecamente le informazioni spaziali10. Gli approcci di cartografia chimica colmano questa lacuna includendo la posizione di campionamento al momento della concettualizzazione del progetto, nei metadati del campione e nelle fasi di elaborazione dei dati. Un punto di forza di questo approccio alla cartografia chimica, a differenza dell'imaging con spettrometria di massa, è la capacità di fornire annotazioni sicure (Metabolomics Standards Initiative livello 1 o livello 2 annotation confidence41), a differenza dell'imaging con spettrometria di massa in cui la maggior parte delle applicazioni si basa su una massa accurata solo per l'annotazione. L'imaging con spettrometria di massa consentirà una mappatura spaziale a grana fine, a volte fino al livello di singola cellula, ad esempio 42,43. Al contrario, gli approcci di cartografia chimica consentono la mappatura su larga scala tra organi della distribuzione dei metaboliti senza richiedere competenze di criosezione di animali interi altamente specializzate. La cartografia chimica fornisce prove complementari ai numerosi approcci trascrittomici spaziali in fase di sviluppo, ad esempio 44, con il vantaggio di concentrarsi sullo "strato omico più vicino al fenotipo"45. I metodi alternativi per la quantificazione del carico parassitario includono la misurazione della bioluminescenza al momento della raccolta del campione6. Segmenti fini potrebbero anche essere raccolti per consentire la microscopia confocale o elettronica per valutare il carico parassitario localizzato e il danno tissutale. L'omogeneizzato d'acqua, che viene utilizzato per la quantificazione delle citochine in questo protocollo e nelle pubblicazioni precedenti13, potrebbe anche essere utilizzato per quantificare i marcatori a base proteica del danno tissutale.
Esistono anche diversi modi per ottenere modelli 3D adatti a tracciare i dati LC-MS risultanti. Oltre al metodo suggerito qui, i modelli possono essere acquistati prefabbricati da vari fornitori online. Assicurarsi che i termini di utilizzo corrispondano all'uso previsto, in particolare per quanto riguarda la pubblicazione. I modelli per organi di grandi dimensioni possono essere generati de novo utilizzando scanner 3D secondo le istruzioni dello scanner. Esistono alternative come MATLAB per la generazione e la visualizzazione di modelli 3D per la cartografia chimica46, ma sono state implementate principalmente prima dello sviluppo di 'ili16. MATLAB è una suite di strumenti di analisi e programmazione dei dati che offre un'ampia varietà di applicazioni in molti campi. Tuttavia, MATLAB non è né gratuito né open-source e richiede familiarità con le interfacce MATLAB, soprattutto considerando che MATLAB non è stato sviluppato per l'elaborazione di dati di spettrometria di massa. Le alternative di questo metodo proposto, vale a dire SketchUp, Meshlab e 'ili, sono liberamente accessibili, facili da usare e offrono funzioni simili a MATLAB per scopi di cartografia chimica.
Questo metodo è robusto per quanto riguarda la preparazione del campione e l'estrazione del metabolita. La risoluzione dei problemi è spesso necessaria nella fase di acquisizione dati LC-MS. Questo esula dallo scopo di questo articolo. I lettori sono indirizzati a pubblicazioni eccellenti sulla risoluzione dei problemi di acquisizione dati LC-MS, tra cui 20,47. Allo stesso modo, le complessità dell'annotazione dei metaboliti esulano dallo scopo dell'attenzione di questo metodo sulla generazione di modelli 3D. Riferimenti utili su questo argomento includono24,25,48,49.
Mentre questo metodo esplora efficacemente la patogenesi della malattia, ci sono limitazioni a questo approccio, alcune delle quali sono comuni in qualsiasi esperimento di metabolomica. Una di queste limitazioni è il basso tasso di annotazione delle caratteristiche LC-MS50, che dipende dalla disponibilità e dalla qualità delle librerie spettrali di riferimento. Un'ulteriore limitazione è che questo protocollo non preserva l'mRNA a causa dell'incompatibilità dei reagenti di conservazione dell'RNA come RNAlater con l'analisi LC-MS/MS. Tuttavia, la qualità delle proteine è adeguata per le analisi a valle e quindi può sostituire le analisi basate sull'mRNA.
Un approccio cartografico chimico alla patogenesi delle infezioni riflette direttamente il modo in cui le infezioni batteriche, virali o parassitarie si sviluppano nei sistemi di organi e causano malattie localizzate. L'analisi di questi sottocampioni regionali e la generazione di modelli 3D alla fine trasmettono come i metaboliti funzionano nello spazio tridimensionale, facendo luce su queste dimensioni spaziali precedentemente non riconosciute della biologia molecolare. Utilizzando questo protocollo, ad esempio, la localizzazione dei metaboliti è stata confrontata con il carico di parassiti Trypanosoma cruzi. I risultati hanno chiarito la relazione tra l'agente patogeno e il tessuto ospite e hanno anche dimostrato le dinamiche metaboliche della progressione dei sintomi della malattia di Chagas6. I metodi di cartografia chimica sono stati applicati anche a vari argomenti, come l'interazione dell'ambiente costruito dall'uomo51,52,53, la composizione chimica di sistemi di organi come la pelle umana46 e i polmoni54 e il metabolismo vegetale e le interazioni ambientali55. Le applicazioni future possono comportare la valutazione della tolleranza e della resilienza localizzate alla malattia, o la relazione tra i livelli di metaboliti locali, il tropismo patogeno e il tropismo della malattia in modelli oltre l'infezione da tripanosomatidi. Questo approccio dovrebbe anche avere un'ampia applicabilità per espandere gli attuali protocolli di farmacocinetica, per valutare la relazione tra i livelli locali di farmaci tissutali e il metabolismo dei farmaci rispetto al contesto metabolico generale, al danno tissutale e alla clearance dei patogeni. Nel complesso, la cartografia chimica consente esplorazioni uniche delle distribuzioni dei metaboliti in vari tipi di campioni, con applicazioni che includono la patogenesi delle malattie, la salute umana, le interazioni uomo-ambiente e la dinamica microbica.

I parassiti tripanosomatidi sono costituiti da specie di Leishmania, tripanosomi africani (Trypanosoma brucei) e tripanosomi americani (Trypanosoma cruzi). I protozoi di leishmania causano leishmaniosi, che comprende l'auto-guarigione e l'auto-limitata leishmaniosi cutanea localizzata, la leishmaniosi mucocutanea in cui i tessuti mucosi della bocca, del naso e della gola si danneggiano, e la leishmaniosi viscerale con tropismo parassitario agli organi viscerali che causa febbre ed epatosplenomegalia1,2. T. brucei causa la tripanosomiasi africana umana (HAT), nota anche come malattia del sonno, segnalata principalmente nei paesi africani3. I segni e sintomi clinici includono epatosplenomegalia, febbre, mal di testa, dolori muscoloscheletrici, linfoadenopatie e anemia nella fase emo-linfatica quando i parassiti si localizzano nel flusso sanguigno e linfatici. Questo è seguito dallo stadio meningo-encefalitico, in cui i parassiti si localizzano nel sistema nervoso centrale e causano disturbi del sonno, alterazioni comportamentali e infine coma fatali4. T. cruzi causa la malattia di Chagas, endemica nelle Americhe. Gli individui infetti sperimentano uno stadio acuto iniziale, di solito asintomatico, con ampio tropismo parassitario. Circa il 10%-30% degli individui infetti sperimenta sintomi di stadio cronico dopo decenni di infezione, caratterizzati da megaesofago, megacolon e complicanze cardiovascolari5,6.
La metabolomica studia piccole specie molecolari (50-1.500 Da), compresi composti biologici del metabolismo primario o secondario e composti derivati esternamente come farmaci o molecole derivate dal cibo. Nel contesto delle interazioni ospite-patogeno, la metabolomica può esplorare l'impatto dell'infezione sugli ambienti del metabolita ospite, cruciale per accedere all'effetto del patogeno sull'ospite. Può anche valutare gli adattamenti patogeni all'ambiente nutrizionale e immunologico dell'ospite7,8,9. La spettroscopia di spettrometria di massa (MS) e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) sono strumenti metabolomici comuni utilizzati per identificare, quantificare e caratterizzare i metaboliti. Questo approccio "omico" può essere applicato anche alla scoperta di biomarcatori e allo sviluppo di farmaci10,11.
Dato il tropismo tissutale specifico dei parassiti tripanosomatidi, le analisi metabolomiche spaziali possono consentire una visione significativa della patogenesi delle malattie che causano. La mappatura della distribuzione spaziale dei metaboliti ha rivelato metaboliti localmente colpiti dall'infezione cronica da Trypanosoma cruzi nel tessuto cardiaco del topo e dall'infezione acuta e a lungo termine da Trypanosoma cruzi nel tratto gastrointestinale del topo6,12,13. In particolare, la cartografia chimica 3D ha dimostrato una disconnessione tra la persistenza del parassita e le alterazioni metaboliche nel tessuto cardiaco di topi cronicamente infetti da Trypanosoma cruzi. Il metabolismo era più perturbato nei segmenti inferiori e apicali del cuore, in corrispondenza con i siti dei sintomi della malattia di Chagas (aneurismi apicali cardiaci). Le famiglie di metaboliti perturbate dall'infezione in specifici siti cardiaci e correlate alla gravità della malattia includono acilcarnitine e glicerofosfocoline12,13,14. Nel tratto gastrointestinale, le alterazioni metaboliche persistenti concordavano con i siti dei sintomi della malattia di Chagas: esofago e colon. Al contrario, il metabolismo viene ri-normalizzato in siti non associati ai sintomi della malattia di Chagas, come l'intestino tenue. I metaboliti localmente perturbati dall'infezione nel tratto gastrointestinale includono acilcarnitine, glicerofosfocoline, chinurenina, triptofano e acido colico. Inoltre, queste analisi hanno permesso l'identificazione di un nuovo meccanismo metabolico di tolleranza alla malattia di Chagas6. L'applicazione di questi metodi allo studio della leishmaniosi cutanea ha rivelato significative perturbazioni metaboliche nel sito della lesione, ma anche specifici cambiamenti metabolici nel tessuto macroscopicamente sano adiacente alla lesione. Ad esempio, la glutammina è stata impoverita nel sito della lesione, mentre le glicerofosfocoline nel m / z (rapporto massa / carica) 200-299, 400-499, 500-599 e 600-699 sono state significativamente aumentate nel sito della lesione. Il PC (O-34:1) è stato aumentato solo nei siti adiacenti alla lesione15.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di dimostrare i passaggi necessari per generare modelli 3D di distribuzione dei metaboliti ("cartografia chimica") applicati ai modelli di infezione da parassiti tripanosomatidi (Figura 1). Questo approccio si basa su diversi progressi critici nel contesto dell'elaborazione dei dati di metabolomica e metabolomica, in particolare lo sviluppo di un software per tracciare facilmente i dati metabolomici su modelli 3D16.

<table><tbody><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 mL</td><td>NA</td><td></td><td>NA di qualsiasi marca, se disponibile</td></tr><tr><td>flacone da 1 L, pyrex</td><td>NA</td><td>NA di</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>cilindro graduato da 1 L, pyrex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>di qualsiasi marca, se disponibile</td></tr><tr><td>Provette SafeLock Eppendorf da 2 mL</td><td>VWR</td><td>20901-540</td><td>utilizzare il modello di provetta appropriato per l'omogeneizzatore</td></tr> <tr><td>di tessuti disponibileModello 3D (de-novo generato secondo le fasi del protocollo o acquistato)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>a seconda dei requisiti per il sistema in esame</td></tr><tr><td>Perlina in acciaio inossidabile da 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Fisher</td><td>3252449</td><td></td></tr><tr><td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, se disponibile; pubblicato in Piron, M. et al. Sviluppo di un test PCR in tempo reale per la rilevazione di Trypanosoma cruzi in campioni di sangue. Acta tropica. 103 (3), 195&ndash; 200 (2007).</td></tr><tr><td>bilancia analitica</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer</td><td>NA</td><td>NA qualsiasi</td><td>marca, come disponibile; pubblicato su Piron, M. et al. Sviluppo di un test PCR in tempo reale per Trypanosoma cruzi rilevamento in campioni di sangue. Acta tropica. 103 (3), 195&ndash; 200 (2007).</td></tr><tr><td>centrifuga da banco con microcentrifuga, provetta falcon e capacità di piastra a 96 pozzetti</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>cabina di biosicurezza</td><td>NA</td><td>NA</td><td>classe II, tipo A2; qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile; pubblicato in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Quantificazione rapida di Trypanosoma cruzi nel tessuto ospite mediante PCR in tempo reale. Parassitologia molecolare e biochimica. 129 (1), 53&ndash; 59 (2003).</td></tr><tr><td>fotocamera</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, a seconda della disponibilità. Una fotocamera del cellulare è adeguata per questo sistema</td></tr><tr><td>di imaging con capacità di chemiluminescenza</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi sistema, come disponibili</td></tr><tr><td>batuffoli di cotone</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibili</td></tr><tr><td>cryogloves</td><td>VWR</td><td>97008-208</td><td>sostituire con qualsiasi marca, come disponibili</td></tr><tr><td>forbici da dissezione</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>ghiaccio secco</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibili</td></tr><tr><td>pinze extra di lunghezza</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>frigorifero di grado infiammabile</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibili</td></tr><tr><td>scatole di conservazione per congelatore per provette per microcentrifuga</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>cappa aspirante</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>massa ad alta risoluzione spettrometro</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile, come ThermoFisher Q-Exactive Plus (numero di catalogo 0726030)</td></tr><tr><td>secchiello per il ghiaccio</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>ili software</td><td>ili.embl.de</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>grande tupperware</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile; abbastanza grande da contenere comodamente topo, batuffolo di cotone</td></tr><tr><td>acetonitrile di grado LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>dicolorometano di grado LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>D151-4</td><td></td></tr><tr><td>acido formico di grado LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A11750</td><td></td></tr><tr><td>metanolo di grado LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>acqua di grado LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>W64</td><td></td></tr><tr><td>colonna per cromatografia liquida</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4499-AN</td><td>può essere sostituita con altre marche e modelli, a seconda dei metaboliti di interesse:</td></tr><tr><td>cartuccia di protezione della colonna per cromatografia liquida</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-8784</td><td>può essere sostituita con altre marche e modelli, a seconda delle esigenze per i metaboliti di interesse:</td></tr><tr><td>supporto della cartuccia della colonna per cromatografia liquida di interesse</td>: <td>Phenomenex</td><td>AJ0-9000</td><td>può essere cambiato con altre marche e modelli a seconda dei metaboliti di interesse</td></tr><tr><td>azoto liquido</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>luciferina</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Software MeshLab</td><td>https://www.meshlab.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Software Meshmixer</td><td>https://www.meshmixer.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MS calibrante</td><td>NA</td><td>NA</td><td>appropriato per lo strumento disponibile</td></tr><tr><td>Software di elaborazione dati MS</td><td>NA NA</td><td>NA</td><td>molteplici opzioni disponibili; gli autori raccomandano il software MZmine</td></tr><tr><td>MSConvert</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>sono adatti anche altri modelli di nanodrop</td></tr><tr><td>p1000 puntali per pipette</td><td>NA</td><td>NA</td><td>utilizzare la marca appropriata per i pipettatori disponibili</td></tr><tr><td>pipettatore p1000</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, se disponibili</td></tr><tr><td>puntali per pipette p20</td><td>NA</td><td>NA</td><td>utilizzare la marca appropriata per i pipettatori disponibili pipettatore</td></tr><tr><td>p20</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibili</td></tr><tr><td>puntali per pipette p200</td><td>NA</td><td>NA</td><td>utilizzare la marca appropriata per i pipettatori</td></tr><tr><td>p200 disponibili pipettor</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come</td></tr><tr><td>dispositivi di protezione individuale disponibili (guanti, camice da laboratorio, occhiali/occhiali protettivi; visiera)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex)</td><td>Quansys biosciences</td><td>110949MS</td><td>può sostituire con altri saggi di citochine basati su proteine, come altri kit ELISA per citochine</td></tr><tr><td>commerciali Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps)</td><td>Zymo</td><td>D4069</td><td>sostituire con qualsiasi marca di kit di estrazione del DNA mammifero, come disponibile</td></tr><tr><td>termociclatore in tempo reale</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>saliera o infusore per tè</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca; per contenere isoflurano-imbevuto batuffolo di cotone e prevenire il contatto con la pelle del topo</td></tr><tr><td>software</td><td>SketchUp https://www.sketchup.com/</td><td></td><td></td></tr> NA <tr><td>campione pinze</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>speedvac con provetta per microcentrifuga e capacità di piastra a 96 pozzetti</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come</td></tr><tr><td>disponibile software per fogli di calcolo</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td>NA</td><td>può sostituire con altri software di gestione dei fogli di calcolo, a seconda dei casi</td></tr><tr><td>sulfacloropiridazina</td><td>Sigma</td><td>S9882-100G</td><td></td></tr><tr><td>sulfadimetossina</td><td>Sigma</td><td>S7007-10G</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di reazione qPCR verde Sybr</td><td>Fisher</td><td>A25780</td><td>può sostituire con altre miscele di reazione qPCR verde Sybr, a piacere</td></tr><tr><td>TCCCTCTCATCAGTTCTAT primer GGCCCA</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile; pubblicato in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Quantificazione rapida di Trypanosoma cruzi nel tessuto ospite mediante PCR in tempo reale. Parassitologia molecolare e biochimica. 129 (1), 53&ndash; 59 (2003).</td></tr><tr><td>omogeneizzatore di tessuti</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td>di qualsiasi marca, a seconda della disponibilità; ad esempio, Qiagen TissueLyser II, numero di catalogo 85300, con set di adattatori TissueLyser (2 x 24), numero di catalogo 69982</td></tr><tr><td>campioni di tessuto</td><td>NA</td><td>NA da</td> un <td>modello di infezione appropriato</td></tr><tr><td>Dispenser a perlina singola TissueLyser</td><td>Qiagen</td><td>69965</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, se disponibile, come ThermoFisher Vanquish (numero di catalogo IQLAAAGABHFAPUMBHV)</td></tr><tr><td>congelatore a bassissima temperatura (-80)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>bagno ad ultrasuoni</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi sistema, come disponibile</td></tr><tr><td>ghiaccio umido</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualsiasi marca, come disponibile</td></tr><tr><td>pellicola sigillante senza zone</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 490007-390</td><td></td></tr></tbody></table>

approcci cartografici chimici per studiare l'infezione da tripanosomatidi

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Il tropismo patogeno e il tropismo della malattia si riferiscono alle posizioni dei tessuti colonizzate selettivamente o danneggiate dagli agenti patogeni, portando a sintomi localizzati della malattia. I parassiti tripanososamidi infettivi dell'uomo includono Trypanosoma cruzi, l'agente eziologico della malattia di Chagas; Trypanosoma brucei, l'agente eziologico della malattia del sonno; e le specie di Leishmania , agenti causali della leishmaniosi. Insieme, colpiscono 20 milioni di persone in tutto il mondo. Questi parassiti mostrano un tropismo specifico: cuore, esofago, colon per T. cruzi, tessuto adiposo, pancreas, pelle, sistema circolatorio e sistema nervoso centrale per T. brucei, pelle per ceppi di Leishmania dermotropica e fegato, milza e midollo osseo per ceppi viscerotropici di Leishmania . Una prospettiva spaziale è quindi essenziale per comprendere la patogenesi della malattia tripanosomatidica. La cartografia chimica genera visualizzazioni 3D dell'abbondanza di piccole molecole generate tramite cromatografia liquida-spettrometria di massa, rispetto ai parametri microbiologici e immunologici. Questo protocollo dimostra come la cartografia chimica possa essere applicata per studiare i processi patogeni durante l'infezione da tripanosomatidi, a partire dal campionamento sistematico dei tessuti e dall'estrazione dei metaboliti, seguita dall'acquisizione dei dati di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem e concludendo con la generazione di mappe 3D della distribuzione dei metaboliti. Questo metodo può essere utilizzato per molteplici domande di ricerca, come i requisiti nutrizionali per la colonizzazione dei tessuti da parte di T. cruzi, T. brucei o Leishmania, l'immunometabolismo nei siti di infezione e la relazione tra perturbazione metabolica tissutale locale e sintomi clinici della malattia, portando a una visione completa della patogenesi della malattia tripanosomatidica.

Il numero di caratteristiche metaboliche ottenute dipende dal tipo di tessuto analizzato e dai parametri di elaborazione dei dati. Ad esempio, questo protocollo è stato utilizzato per analizzare l'impatto spaziale dell'infezione da T. cruzi sul metaboloma del tratto gastrointestinale in un modello murino di infezione da T. cruzi. Nel lavoro precedente, il maschio C3H / HeJ è stato iniettato per via intraperitoneale con 1.000 cl + luc T. cruzi parassiti32,6. Gli animali sono stati sottoposti a eutanasia 12 o 89 giorni dopo l'infezione e un'analisi cartografica chimica di 13 segmenti contigui del tratto gastrointestinale è stata eseguita come descritto in questo protocollo. Questa analisi ha portato a una tabella di funzionalità di 5.502 feature, che sono state poi visualizzate in 3D utilizzando i passaggi descritti in questo protocollo. Questo approccio consente la visualizzazione delle caratteristiche dei metaboliti in singoli animali che sono elevati nel sito di elevato carico di parassiti (chinurenina, Figura 2B vs carico di parassiti, Figura 2A), di metaboliti con distribuzione differenziale tra le regioni tissutali (glutammina, Figura 2C) e caratteristiche dei metaboliti che si trovano a livelli comparabili nell'intestino tenue e crasso (LPE 16:0 Figura 2D ). La chinurenina è stata selezionata per la visualizzazione a causa della sua nota relazione con l'infiammazione e delle precedenti pubblicazioni sulla capacità dei metaboliti derivati dalla chinurenina di regolare il carico di T. cruzi33. Modelli casuali di apprendimento automatico basati su foreste avevano precedentemente rivelato un'associazione tra i livelli di chinurenina e lo stato di infezione6. La glutammina è stata selezionata per una visualizzazione basata su precedenti pubblicazioni che dimostrano una relazione tra disponibilità di glutammina in vitro e sensibilità al farmaco T. cruzi34. La distribuzione differenziale è stata confermata utilizzando la regressione logistica, p &lt; 0,05. LPE 16:0 è stato selezionato dopo un'ispezione visiva dei dati per scoprire le caratteristiche dei metaboliti trovati a livelli comparabili tra i siti tissutali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del protocollo. L'illustrazione è stata creata con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg"> Figura 2: Analisi cartografica chimica. I topi maschi C3H/HeJ sono stati iniettati per via intraperitoneale con 1.000 parassiti CL+luc T. cruzi32. Gli animali sono stati sottoposti a eutanasia 12 o 89 giorni dopo l'infezione e il tratto gastrointestinale è stato raccolto e sezionato sistematicamente (fase 1)6. I metaboliti sono stati estratti come nella fase 2 e analizzati da LC-MS/MS.3D la generazione del modello è stata eseguita utilizzando il software SketchUp (passaggio 5) e i dati sono stati tracciati in 3D come nel passaggio 6. (A) Distribuzione del parassita in un topo specifico, 12 giorni dopo l'infezione. (B) Distribuzione del metabolita chinurenina nello stesso topo, 12 giorni dopo l'infezione. (C) Distribuzione media della glutammina tra topi infetti, 89 giorni dopo l'infezione. (D) Livelli comparabili di m/z 454.292 tempo di ritenzione 2.929 min, annotati come 2-esadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (LPE 16:0), nello stesso topo come in A e B nell'intestino tenue e nel colon. Campioni e dati sono stati generati in6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive i passaggi per generare un modello 3D della distribuzione dei metaboliti durante l'infezione da tripanosomatidi, compresa la raccolta di campioni, l'estrazione di metaboliti, una panoramica della cromatografia liquida-acquisizione dei dati di spettrometria di massa tandem, generazione di modelli 3D e, infine, visualizzazione dei dati.

Approcci cartografici chimici per studiare l'infezione da tripanosomatidi

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Questo protocollo può essere utilizzato per costruire modelli 3D di distribuzione di metaboliti e parassiti. Questo può aiutare a comprendere la relazione tra perturbazione metabolica dei tessuti locali, distribuzione dei parassiti e sintomi clinici della malattia. Il vantaggio principale di questo metodo è che consente la mappatura tra organi su scala reale della distribuzione dei metaboliti rispetto alla distribuzione dei patogeni e la sua analisi statistica.Teoricamente, la cartografia chimica può esplorare lo sviluppo e l'impatto della malattia sull'ospite esaminando direttamente i metaboliti responsabili della patogenesi e gli effetti del trattamento. Inizia pesando ed etichettando i tubi. Sezionare sistematicamente i tessuti con una sezione per tubo.Pesare le provette contenenti campioni di tessuto per determinare il peso del campione e registrare il peso. Per eseguire l'omogeneizzazione a base d'acqua dei campioni di tessuto, aggiungere una perla di acciaio inossidabile da cinque millimetri alle due provette di microcentrifuga da millilitri contenenti campioni di tessuto. Fare un tubo vuoto contenente acqua di grado LCMS.Portare il volume a 500 microlitri per 50 milligrammi del campione aggiungendo acqua refrigerata di grado LCMS, quindi omogeneizzare i campioni a 25 hertz per tre minuti. I campioni devono essere accuratamente omogeneizzati. Raccogliere 1/10 del volume di omogeneizzazione per l'estrazione del DNA e altre analisi.Aggiungere metanolo di grado LCMS ghiacciato con quattro micromolari di sulfacloropiridazina all'omogeneizzato. Omogeneizzare i campioni in un omogeneizzatore tissutale a 25 hertz per tre minuti, seguito da centrifugazione per 10 minuti. Raccogliere un volume uguale di surnatante in una piastra da 96 pozzetti e mantenere i residui solidi sul ghiaccio mentre si raccolgono i supernatanti.Asciugare completamente il surnatante di estrazione acquosa utilizzando la massima velocità e nessun riscaldamento. Eseguire l'estrazione organica aggiungendo 1.000 microlitri di metanolo di diclorometano pre-refrigerato con due sulfacloropiridazina micromolare per 50 milligrammi di campione di residuo solido. Omogeneizzare i campioni a 25 hertz per cinque minuti, seguiti da centrifugazione per 10 minuti.Raccogliere un volume uguale di surnatante in un piatto da 96 pozzetti. Scatta una foto dell'organo di interesse. Fai clic su File, quindi su Importa nel software SketchUp per importare un'immagine degli organi di interesse.Fare clic sullo strumento linee e selezionare l'opzione a mano libera. Usa lo strumento matita per tracciare e disegnare i contorni degli organi di interesse. Selezionate lo strumento push/pull e posizionate l'area ombreggiata per convertire il disegno da 2D a 3D.Esportare il file in formato dae facendo clic su Esporta file e quindi su Modello 3D. Per migliorare il realismo del modello, importare il modello nel software MeshLab selezionando File, quindi facendo clic su Importa mesh. Selezionate Wireframe dal menu in alto, quindi Filtri, fate clic su Rimeshing Simplification and Reconstruction (Remeshing Simplification and Reconstruction), quindi su Punto medio superfici di suddivisione (Subdivision Surfaces Midpoint).Lasciare tutti i valori come predefiniti e selezionare Applica due volte. Esportare il modello in formato sdl facendo clic su File, quindi su Esporta mesh come e quindi selezionando Formato file SDL nel menu a discesa Tipo file. Salvalo e seleziona OK nel menu a comparsa successivo.Aprire il software Meshmixer e importare il file sdl generato nel passaggio precedente. Usa gli strumenti sculpt, brushes, dragon sculpt, brushes, inflate tools per estrarre le superfici del modello che devono essere arrotondate. Salvalo in formato sdl una volta che il modello ha l'aspetto desiderato facendo clic su File ed esporta.Assegnare al file il nome desiderato, selezionare SDL Binary Format e salvarlo. Aprire il modello 3D nel software MeshLab. Fare clic su OK nella finestra popup di elaborazione post-aperta.Ottenete le coordinate X, Y e Z per ogni punto di campionamento selezionando lo strumento punti di prelievo, quindi fate clic con il pulsante destro del mouse a intervalli regolarmente distanziati sulla superficie del modello 3D. Una volta selezionate tutte le coordinate desiderate, fai clic sul pulsante Salva più in alto nella finestra popup del modulo. Nel software per fogli di calcolo, apri il file pp generato nel passaggio precedente.Regolare la visualizzazione dei dati facendo clic su Testo dati in colonne, quindi delimitato. Fare clic su Avanti e quindi selezionare Spazio e fare clic su Fine. Riformattare in modo che solo i valori numerici rimangano nelle celle del foglio di calcolo selezionando Trova home e Seleziona Sostituisci.Nella casella Trova cosa, inserisci Y cappotto uguale e lascia vuota la casella di sostituzione. Fare clic su Sostituisci tutto e quindi su OK. Ripetere per X cappotto uguale e per Z cappotto uguale e per cappotto slash maggiore di. Nella tabella del software del foglio di calcolo, le righe corrispondono a ciascuna posizione e le colonne ai dati.Incolla i metadati appropriati e l'abbondanza di funzionalità del metabolita nelle colonne successive del foglio di calcolo. Nella colonna raggio, immettete la dimensione desiderata dei punti di campionamento da visualizzare sul modello. Determinare empiricamente i valori per il raggio e salvare il file in formato CSV.Passare al software ELI Plot, selezionare Surface, quindi trascinare e rilasciare il modello 3D creato nella finestra del browser. Trascinate e rilasciate la tabella delle feature creata nella stessa finestra del browser. Utilizzare la legenda nell'angolo in basso a destra per proiettare la colonna di dati desiderata sul modello 3D.Selezionare consecutivamente ogni colonna di dati per valutare la distribuzione di questa caratteristica metabolita sul modello 3D. Questa analisi ha portato a una tabella di 5.502 caratteristiche e alla loro visualizzazione in 3D. Questo approccio consente la visualizzazione delle caratteristiche dei metaboliti in singoli animali che sono elevati nel sito di alto carico di parassiti, metaboliti con distribuzione differenziale tra le regioni dei tessuti e caratteristiche dei metaboliti che si trovano a livelli comparabili nell'intestino tenue e crasso.È importante ricordare di utilizzare solo solventi LCMS e di raccogliere tutto il tessuto adiacente ed estrarre i metaboliti per tutti i campioni raccolti per evitare lacune nelle mappe spaziali. Questa tecnica può essere utilizzata per esplorare i requisiti nutrizionali per la colonizzazione dei tessuti da parte dei parassiti tripanosomatidi per comprendere la patogenesi della malattia attraverso il confronto delle mappe di distribuzione dei metaboliti 3D all'infezione.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo manoscritto descrive l'uso di un ceppo bioluminescente di tripanosomi africani per consentire il monitoraggio dell'infezione in fase avanzata e dimostra come l'imaging dal vivo in vivo possa essere utilizzato per visualizzare le infezioni all'interno del sistema nervoso centrale in tempo reale.

Bioluminescenza Imaging per rilevare fase avanzata di infezione di africani Tripanosomiasi

I tripanosomi africani cresciuti in vitro subiscono variazioni antigeniche a un tasso basso, in modo tale che le popolazioni sono costituite da parassiti che esprimono una variante dominante di tipo glicoproteina di superficie (VSG) e una piccola popolazione di varianti "commutate".  Questo protocollo descrive un metodo rapido per rilevare e quantificare queste popolazioni.

rilevamento di<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

In questo protocollo, fluorescente contrassegnati T. cruzi sono stati iniettati in larve di zebrafish trasparente e motilità del parassita è stata osservata in vivo mediante microscopia a fluorescenza foglio leggero.

Stabilimento di larvale Zebrafish come modello animale per indagare Trypanosoma cruzi motilità In Vivo

L'agente di Trypanosoma cruzi di malattia di Chagas produce infezioni asintomatiche di lunga durata che improvvisamente trasformarsi in patologia clinicamente riconosciuta. Il seguente protocollo di ricerca descrive uno studio epidemiologico a breve termine basati sulla famiglia per svelare il T. cruzi infezione sessualmente trasmessa dal padre alla progenie.

Trasmissione sessuale dell'americano Trypanosomes da maschi e femmine ai compagni di Naive

Questo metodo di separazione Tripanosoma dal sangue dipende dalla loro carica superficiale essendo meno negativo rispetto a cellule del sangue dei mammiferi. Sangue infetto è collocato e trattati su una colonna di scambiatore di anioni. Questo metodo, più il montaggio diagnostico per la tripanosomiasi africana, fornisce parassiti purificati per indagini immunologiche, biologiche, biochimiche, farmaceutiche e biologia molecolare.

Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

Il presente protocollo descrive la microscopia fluorescente a foglio luminoso e metodi automatizzati assistiti da software per visualizzare e quantificare con precisione i parassiti proliferanti e dormienti del Trypanosoma cruzi e le cellule T in organi e tessuti intatti e cancellati. Queste tecniche forniscono un modo affidabile per valutare i risultati del trattamento e offrono nuove informazioni sulle interazioni parassita-ospite.

Imaging 3D quantitativo di cellule infette da Trypanosoma cruzi, amastigoti dormienti e cellule T in organi chiarificati intatti

Questo studio mostra un protocollo dettagliato per eseguire la microscopia ad espansione ultrastrutturale in tre fasi del ciclo di vita in vitro di Trypanosoma cruzi, il patogeno responsabile della malattia di Chagas. Includiamo la tecnica ottimizzata per le proteine del citoscheletro e la marcatura del pan-proteoma.

Microscopia ad espansione ultrastrutturale in tre fasi del ciclo di vita in vitro di Trypanosoma cruzi

I parassiti del sangue medici in tutto il mondo sono stati sottoposti a screening automatico utilizzando semplici passaggi su una piattaforma di intelligenza artificiale low-code. La diagnosi prospettica dei film di sangue è stata migliorata utilizzando un metodo di rilevamento e classificazione degli oggetti in un modello ibrido di deep learning. La collaborazione tra il monitoraggio attivo e modelli ben addestrati aiuta a identificare i punti caldi di trasmissione del tripanosoma.

Identificazione automatica superiore dei parassiti del tripanosoma utilizzando un modello ibrido di deep learning

Descriviamo un metodo per studiare come il pH risponde ai segnali ambientali nei glicosomi della forma del flusso sanguigno dei tripanosomi africani. Questo approccio prevede l'utilizzo di un sensore di proteine ereditarie sensibile al pH in combinazione con la citometria a flusso per misurare la dinamica del pH, sia come saggio del corso temporale che in un formato di schermo ad alto rendimento.

Misurazione delle variazioni dinamiche del pH glisomiale nel Trypanosoma brucei vivente

Il protocollo qui fornito descrive i passaggi dettagliati per eseguire studi di efficacia dei farmaci in un modello bioluminescente di infezione da Trypanosoma cruzi , con particolare attenzione all'acquisizione, all'analisi e all'interpretazione dei dati. Vengono inoltre fornite procedure di risoluzione dei problemi e controllo qualità per ridurre al minimo i problemi tecnici.

Demistificazione dell'imaging in bioluminescenza in vivo di un modello murino della malattia di Chagas per studi sull'efficacia dei farmaci

Impara la cartografia chimica per modellare la distribuzione 3D di metaboliti e parassiti tripanosomatidi nei tessuti. Questo metodo consente di analizzare le perturbazioni metaboliche locali e i sintomi clinici.

Approcci cartografici chimici per studiare l'infezione da tripanosomatidi

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