Approcci cartografici chimici per studiare l'infezione da tripanosomatidi

Questo protocollo può essere utilizzato per costruire modelli 3D di distribuzione di metaboliti e parassiti. Questo può aiutare a comprendere la relazione tra perturbazione metabolica dei tessuti locali, distribuzione dei parassiti e sintomi clinici della malattia. Il vantaggio principale di questo metodo è che consente la mappatura tra organi su scala reale della distribuzione dei metaboliti rispetto alla distribuzione dei patogeni e la sua analisi statistica.

Teoricamente, la cartografia chimica può esplorare lo sviluppo e l'impatto della malattia sull'ospite esaminando direttamente i metaboliti responsabili della patogenesi e gli effetti del trattamento. Inizia pesando ed etichettando i tubi. Sezionare sistematicamente i tessuti con una sezione per tubo.

Pesare le provette contenenti campioni di tessuto per determinare il peso del campione e registrare il peso. Per eseguire l'omogeneizzazione a base d'acqua dei campioni di tessuto, aggiungere una perla di acciaio inossidabile da cinque millimetri alle due provette di microcentrifuga da millilitri contenenti campioni di tessuto. Fare un tubo vuoto contenente acqua di grado LCMS.

Portare il volume a 500 microlitri per 50 milligrammi del campione aggiungendo acqua refrigerata di grado LCMS, quindi omogeneizzare i campioni a 25 hertz per tre minuti. I campioni devono essere accuratamente omogeneizzati. Raccogliere 1/10 del volume di omogeneizzazione per l'estrazione del DNA e altre analisi.

Aggiungere metanolo di grado LCMS ghiacciato con quattro micromolari di sulfacloropiridazina all'omogeneizzato. Omogeneizzare i campioni in un omogeneizzatore tissutale a 25 hertz per tre minuti, seguito da centrifugazione per 10 minuti. Raccogliere un volume uguale di surnatante in una piastra da 96 pozzetti e mantenere i residui solidi sul ghiaccio mentre si raccolgono i supernatanti.

Asciugare completamente il surnatante di estrazione acquosa utilizzando la massima velocità e nessun riscaldamento. Eseguire l'estrazione organica aggiungendo 1.000 microlitri di metanolo di diclorometano pre-refrigerato con due sulfacloropiridazina micromolare per 50 milligrammi di campione di residuo solido. Omogeneizzare i campioni a 25 hertz per cinque minuti, seguiti da centrifugazione per 10 minuti.

Raccogliere un volume uguale di surnatante in un piatto da 96 pozzetti. Scatta una foto dell'organo di interesse. Fai clic su File, quindi su Importa nel software SketchUp per importare un'immagine degli organi di interesse.

Fare clic sullo strumento linee e selezionare l'opzione a mano libera. Usa lo strumento matita per tracciare e disegnare i contorni degli organi di interesse. Selezionate lo strumento push/pull e posizionate l'area ombreggiata per convertire il disegno da 2D a 3D.

Esportare il file in formato dae facendo clic su Esporta file e quindi su Modello 3D. Per migliorare il realismo del modello, importare il modello nel software MeshLab selezionando File, quindi facendo clic su Importa mesh. Selezionate Wireframe dal menu in alto, quindi Filtri, fate clic su Rimeshing Simplification and Reconstruction (Remeshing Simplification and Reconstruction), quindi su Punto medio superfici di suddivisione (Subdivision Surfaces Midpoint).

Lasciare tutti i valori come predefiniti e selezionare Applica due volte. Esportare il modello in formato sdl facendo clic su File, quindi su Esporta mesh come e quindi selezionando Formato file SDL nel menu a discesa Tipo file. Salvalo e seleziona OK nel menu a comparsa successivo.

Aprire il software Meshmixer e importare il file sdl generato nel passaggio precedente. Usa gli strumenti sculpt, brushes, dragon sculpt, brushes, inflate tools per estrarre le superfici del modello che devono essere arrotondate. Salvalo in formato sdl una volta che il modello ha l'aspetto desiderato facendo clic su File ed esporta.

Assegnare al file il nome desiderato, selezionare SDL Binary Format e salvarlo. Aprire il modello 3D nel software MeshLab. Fare clic su OK nella finestra popup di elaborazione post-aperta.

Ottenete le coordinate X, Y e Z per ogni punto di campionamento selezionando lo strumento punti di prelievo, quindi fate clic con il pulsante destro del mouse a intervalli regolarmente distanziati sulla superficie del modello 3D. Una volta selezionate tutte le coordinate desiderate, fai clic sul pulsante Salva più in alto nella finestra popup del modulo. Nel software per fogli di calcolo, apri il file pp generato nel passaggio precedente.

Regolare la visualizzazione dei dati facendo clic su Testo dati in colonne, quindi delimitato. Fare clic su Avanti e quindi selezionare Spazio e fare clic su Fine. Riformattare in modo che solo i valori numerici rimangano nelle celle del foglio di calcolo selezionando Trova home e Seleziona Sostituisci.

Nella casella Trova cosa, inserisci Y cappotto uguale e lascia vuota la casella di sostituzione. Fare clic su Sostituisci tutto e quindi su OK. Ripetere per X cappotto uguale e per Z cappotto uguale e per cappotto slash maggiore di. Nella tabella del software del foglio di calcolo, le righe corrispondono a ciascuna posizione e le colonne ai dati.

Incolla i metadati appropriati e l'abbondanza di funzionalità del metabolita nelle colonne successive del foglio di calcolo. Nella colonna raggio, immettete la dimensione desiderata dei punti di campionamento da visualizzare sul modello. Determinare empiricamente i valori per il raggio e salvare il file in formato CSV.

Passare al software ELI Plot, selezionare Surface, quindi trascinare e rilasciare il modello 3D creato nella finestra del browser. Trascinate e rilasciate la tabella delle feature creata nella stessa finestra del browser. Utilizzare la legenda nell'angolo in basso a destra per proiettare la colonna di dati desiderata sul modello 3D.

Selezionare consecutivamente ogni colonna di dati per valutare la distribuzione di questa caratteristica metabolita sul modello 3D. Questa analisi ha portato a una tabella di 5.502 caratteristiche e alla loro visualizzazione in 3D. Questo approccio consente la visualizzazione delle caratteristiche dei metaboliti in singoli animali che sono elevati nel sito di alto carico di parassiti, metaboliti con distribuzione differenziale tra le regioni dei tessuti e caratteristiche dei metaboliti che si trovano a livelli comparabili nell'intestino tenue e crasso.

È importante ricordare di utilizzare solo solventi LCMS e di raccogliere tutto il tessuto adiacente ed estrarre i metaboliti per tutti i campioni raccolti per evitare lacune nelle mappe spaziali. Questa tecnica può essere utilizzata per esplorare i requisiti nutrizionali per la colonizzazione dei tessuti da parte dei parassiti tripanosomatidi per comprendere la patogenesi della malattia attraverso il confronto delle mappe di distribuzione dei metaboliti 3D all'infezione.