Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

L'optogenetica è stata utilizzata per ottenere titoli più elevati di diverse sostanze chimiche e proteine rispetto agli induttori tipici. Utilizzando questo protocollo, altri possono migliorare i propri processi con il controllo basato sulla luce. Il controllo optogenetico è non invasivo, altamente sintonizzabile e reversibile.

Queste qualità consentono un'ottimizzazione semplificata dei processi microbici e aprono anche opportunità uniche, come le fermentazioni trifase e il controllo multicromatico. Per qualsiasi nuova sostanza chimica, le condizioni di luce ottimali saranno diverse. Quindi, se si osserva una bassa produzione utilizzando i parametri di questo protocollo, è necessario testare diverse condizioni di luce.

Inizia ottenendo un ceppo di Saccharomyces cerevisiae con l'ossitrofia HIS3, un marcatore necessario per i plasmidi OptoINVRT. Se si cerca di controllare un gene nativo di Saccharomyces cerevisiae, assicurarsi che la copia endogena del gene venga eliminata prima di procedere. Per iniziare la costruzione della deformazione, linearizzare il plasmide contenente il circuito OptoINVRT7, come EZL439.

Se si utilizza EZL439, che contiene i componenti per reprimere il PIGA un promotore alla luce e attivarlo al buio, linearizzare nel sito di restrizione Pme1. Utilizzando metodi standard di trasformazione dell'acetato di litio, integrare il plasmide in un ceppo auxotrofico HIS3. Dopo la trasformazione, centrifugare le cellule a 150 G per un minuto.

Risospenare delicatamente le cellule in 200 microlitri di mezzo SC-HIS fresco. Placcare l'intero volume cellulare su una piastra di agar SC-HIS e incubare a 30 gradi Celsius per due o tre giorni fino alla comparsa delle colonie. Preparare celle competenti utilizzando protocolli standard di trasformazione dell'acetato di litio.

Trasforma le cellule con il plasmide contenente i geni che desideri controllare optogeneticamente a valle dei promotori PIGA1M o PIGA1S. Dopo la trasformazione, centrifugare la coltura a 150 G per un minuto e risospescere delicatamente il pellet cellulare in 200 microlitri di mezzo drop-out SC fresco. Placcare l'intero volume cellulare su una piastra di agar peptone destrosio estratto di lievito, se integrata in siti Delta o una piastra drop-out SC se trasformata con un plasmide contenente un marcatore di selezione.

Incubare le cellule a 30 gradi Celsius per 16 ore sotto luce blu costante per mantenere il gene optogeneticamente controllato represso. Utilizzare qualsiasi sorgente luminosa della lunghezza d'onda di 465 nanometri e posizionare un pannello LED a circa 40 centimetri sopra la piastra in modo tale che l'intensità della luce sia di circa 80-110 micromoli per metro quadrato al secondo. Misurare l'intensità utilizzando un misuratore quantistico.

Se si integra nei siti Delta, replicare la piastra su piastre di destrosio peptone estratto di lievito contenenti un intervallo di concentrazioni di Zeocin tra 400 microgrammi per millilitro e 1.200 microgrammi per millilitro per selezionare una varietà di numeri di copia di integrazione. Incubare le piastre replica a 30 gradi Celsius sotto luce blu costante o pulsata per due o tre giorni fino a quando non compaiono le colonie. Per eseguire lo screening preliminare, selezionare otto colonie da ciascuna piastra e utilizzarle per inoculare un millilitro di mezzo SC-HIS integrato con glucosio al 2% in singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.

Far crescere le cellule durante la notte a 30 gradi Celsius scuotendo a 200 giri al minuto sotto un'illuminazione costante a luce blu. Il giorno successivo, diluire ogni coltura in un mezzo SC-HIS fresco con glucosio al 2% per ottenere i valori di densità ottica che vanno da 0,01 a 0,3 a 600 nanometri e far crescere le colture in condizioni di agitazione 200 giri al minuto sotto luce costante o pulsata a 30 gradi Celsius fino a quando la densità ottica raggiunge tra due e nove. Quindi, avvolgere le piastre con un foglio di alluminio, spegnere il pannello luminoso e incubare le piastre al buio per quattro ore a 30 gradi Celsius con 200 giri al minuto.

Centrifugare le colture nella piastra a 24 pozzetti a 234 G per cinque minuti e risospese le cellule in un millilitro di mezzo di drop-out completo sintetico fresco con il 2% di glucosio. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione del prodotto desiderato utilizzando nastro sigillante sterile a micropiastre. Fermentare le piastre sigillate al buio per 48 ore a 30 gradi Celsius scuotendo a 200 giri al minuto.

Per raccogliere le fermentazioni, centrifugare le piastre per cinque minuti a 234 G e trasferire 800 microlitri del surnatante in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. A seconda della sostanza chimica di interesse, analizzare utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni, spettrometria di massa per gascromatografia o un altro metodo analitico utilizzando la tecnica di preparazione del campione più adatta allo strumento utilizzato. Selezionare otto colonie da ogni piastra e usarle per inoculare un millilitro di mezzo SC-HIS con il 2% di glucosio nei singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.

Far crescere le cellule durante la notte al buio a 30 gradi Celsius con 200 giri al minuto scuotendo. La mattina successiva, diluire ogni coltura in un mezzo SC-HIS fresco con una densità ottica dal 2% di glucosio a 0,1. Avvolgere le piastre in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce e far crescere la coltura al buio a 30 gradi Celsius con 200 giri al minuto scuotendo fino a raggiungere una densità ottica di tre.

Quindi, incubare le piastre sotto luce pulsata per 12 ore a 30 gradi Celsius con 200 giri al minuto scuotendo. Centrifugare le colture a 234 G per cinque minuti e risospenderle in mezzo fresco SC-HIS con il 2% di glucosio. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione del prodotto desiderato utilizzando nastro sigillante sterile a micropiastre.

Fermentare le piastre sigillate alla luce per 48 ore a 30 gradi Celsius scuotendo a 200 giri al minuto. Dopo aver eseguito fermentazioni optogenetiche, la produzione chimica è stata testata in una gamma di densità cellulari al momento dell'induzione con due circuiti. Il circuito OptoINVRT7 ha dimostrato alti titoli di acido lattico e isobutanolo con una densità cellulare ottimale del valore di induzione di 7,0 e 8,75 rispetto ai circuiti OptoINVRT1 e 2.

Le fermentazioni utilizzando i circuiti OptoAMP sono state studiate in tre fasi definite da diversi cicli di lavoro leggeri. La produzione di acido lattico può essere ottimizzata utilizzando una fase di crescita pulsata e fasi di induzione e produzione completamente illuminate. La produzione di isobutanolo è stata ottimizzata utilizzando una fase di crescita pulsata, una fase di induzione completamente illuminata e una fase di produzione pulsata.

Mentre la biosintesi della naringenina è stata ottimizzata al meglio utilizzando un'induzione a crescita pulsata completamente illuminata e una fase di produzione scura. Il sistema OptoLAC è stato utilizzato in E.Coli per produrre il fattore di trascrizione FDER a titoli paragonabili o superiori a quelli ottenuti utilizzando l'induzione chimica con IPDG. I circuiti OptoLAC sono stati applicati per produrre mevalonato e la produzione supera i titoli ottenuti utilizzando l'induzione IPDG.

La produzione di mevalonato a livello di bioreattore dimostra la scalabilità e la sintonizzazione della regolazione optogenetica per la produzione chimica e proteica nei batteri oltre i livelli di micropiastre. È importante assicurarsi che l'intensità della luce sia nell'intervallo corretto per i gradini illuminati e che la contaminazione della luce sia evitata per i passaggi che richiedono l'oscurità. Questa tecnica ha spianato la strada per ottenere titoli record di isobutanolo nel lievito, stabilizzare le popolazioni di consorzi con la luce e persino controllare il flusso metabolico usando organelli controllati dalla luce sintetica.