Coltura di linfociti in microgravità simulata utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante

Questa tecnica ci permette di studiare gli effetti della microgravità simulata sulle cellule immunitarie per aiutarci a capire meglio come gli aspetti dell'ambiente spaziale influenzano la fisiologia umana a livello molecolare. Questa tecnica è economicamente fattibile ed è relativamente facile da impostare e mantenere rispetto all'invio di colture cellulari nello spazio o ad altri metodi di sottoporre la coltura cellulare alla microgravità simulata sulla terra. Si consiglia di andare lentamente mentre si riempiono i vasi per evitare trabocchi e fuoriuscite.

Dopo la rimozione iniziale delle bolle, assicurarsi che i vasi siano completamente pieni utilizzando le siringhe. Ciò ridurrà al minimo le possibilità di formazione di grandi bolle durante il trattamento. Inizia togliendo i vasi di coltura dall'imballaggio di plastica.

Etichettare ogni recipiente sul bordo in base al tipo di cellula o alla linea utilizzata sia nel controllo che nel trattamento e qualsiasi altra informazione pertinente. Stabilizzare il recipiente e aprire con attenzione la porta di riempimento senza toccare il piolo del tappo della porta di riempimento o l'O-ring. Posizionare il tappo su un tampone di etanolo con il piolo o l'O-ring rivolto verso l'alto mentre il recipiente è pieno.

Non rimuovere i cappucci dalle porte della siringa. Caricare il recipiente con 10 ml del mezzo completo appropriato per la coltura cellulare utilizzando un pipetta sierologica sterile e posizionare con attenzione il tappo sulla porta di riempimento. Assicurarsi che i tappi della porta della siringa e la porta di riempimento siano ben chiusi.

Quindi, posizionare i vasi riempiti in un'incubatrice mentre si eseguono i passaggi successivi per innescare i vasi per la coltura cellulare. Recuperare i vasi adescati dal supporto dall'incubatore. Per un controllo del pallone, caricare un pallone per colture in sospensione T25 con 10 ml di coltura cellulare dal materiale preparato sopra.

Aggiungere 10 mL di coltura di cellule madre in un tubo conico separato da 15 ml, che verrà utilizzato per caricare le siringhe. Svitare i tappi delle porte della siringa per rimuoverli dal recipiente e assicurarsi che i rubinetti di arresto siano in posizione aperta. Stabilizzare il recipiente e aprire con attenzione la porta di riempimento senza toccare il piolo del tappo della porta di riempimento o l'O-ring.

Posizionare il tappo su un tampone di etanolo con il piolo o l'O-ring rivolto verso l'alto mentre il recipiente viene riempito. Assicurarsi che i rubinetti di arresto siano in posizione aperta. Il recipiente può essere svuotato versando il mezzo dal recipiente in un contenitore per rifiuti utilizzando una pipetta sierologica.

In alternativa, aspirare il fluido utilizzando un vetro sterile oltre la pipetta collegata a un sistema di vuoto. Durante l'utilizzo di una pipetta o del sistema a vuoto, assicurarsi di non toccare la membrana di ossigenazione in quanto ciò potrebbe danneggiarla e rendere il recipiente inutilizzabile. Chiudere ermeticamente il tubo conico da 50 mL contenente la coltura di cellule madre preparata e capovolgerlo delicatamente alcune volte per mescolare accuratamente il contenuto.

Prelevare 10 mL di materiale di coltura cellulare dalla provetta da 50 mL con un pipet sierologico sterile fresco. Raccogli il recipiente e inclinalo, in modo che la porta di riempimento sia verso l'alto. Quindi erogare con attenzione lo stock di coltura cellulare nel recipiente attraverso la porta di riempimento.

Riempire il recipiente fino alla punta della porta di riempimento, inclinando il recipiente verso il basso per evitare fuoriuscite. Fare attenzione a non toccare la membrana di ossigenazione con la pipetta poiché è molto fragile. Una volta caricato il recipiente, riposizionare con attenzione il tappo della porta di riempimento senza toccare l'O-ring.

Rimuovere la prima siringa da 3 ml dalla confezione e pomparla alcune volte per allentarla. Quindi collegare la siringa a una delle porte della siringa, assicurandosi che la siringa sia completamente premuta. Chiudere saldamente il tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di coltura cellulare aliquota e capovolgerlo delicatamente alcune volte per mescolare accuratamente il contenuto.

Allo stesso modo, rimuovere la seconda siringa da 3 ml dalla confezione e pomparla alcune volte. Quindi semi-immergere accuratamente questa siringa nella coltura cellulare dal tubo conico da 15 mL e prelevare un po 'di coltura. Ridurre al minimo le bolle d'aria erogando completamente la siringa nel tubo e aspirando 3 ml di coltura.

Collegare la siringa riempita alla porta della siringa rimanente e disinfettare accuratamente le siringhe e intorno alla porta di riempimento con un tampone di etanolo. Non ottenere etanolo sulla membrana di ossigenazione. Ripetere il processo per le navi rimanenti.

Se nella provetta conica da 50 mL è rimasta una coltura cellulare leggermente insufficiente, recuperare la quantità rimanente dal tubo conico da 15 mL utilizzato per caricare le siringhe. Assicurarsi che i rubinetti della porta della siringa siano chiusi per limitare la migrazione di cellule e bolle dalle siringhe nei vasi. Capovolgi la nave e colpiscila di lato un paio di volte per raccogliere le bolle iniziali.

Capovolgere rapidamente la nave verso l'alto, e poi con una leggera angolazione rivolta verso l'esterno, in modo che le bolle galleggino tutte verso l'alto della nave. Manovra le bolle sotto la porta con la siringa vuota e guardale iniziare a entrare nella porta. Aprire entrambi i rubinetti della porta della siringa.

Colpire delicatamente il recipiente per incoraggiare le bolle a galleggiare nella siringa vuota. Aspirare lentamente le bolle più grandi con la siringa vuota mentre si preme attentamente la siringa piena per mantenere la pressione nel recipiente, in modo che la membrana di ossigenazione non scoppi. Ripeti questo processo alcune volte per assicurarti che tutte le bolle vengano rimosse.

Quando le bolle sono state efficacemente rimosse, chiudere i rubinetti della porta della siringa. Tenere le siringhe durante il trattamento per consentire la successiva rimozione delle bolle, assicurandosi che il volume in entrambe le siringhe sia approssimativamente uguale. Pulire accuratamente la superficie della base rotante e del cavo a nastro con etanolo al 70%.

Assicurarsi che il cavo a nastro sia collegato all'alimentatore. Posizionare la base rotante nell'incubatore e collegare il cavo a nastro alla base. Posizionare l'alimentatore vicino, ma all'esterno dell'incubatore.

Fissare il recipiente di trattamento SMG allineando i fili del recipiente al piolo rotante e ruotando delicatamente il piolo rotante sulla base in senso antiorario. Assicurarsi che la nave sia fissata saldamente. Mantenere l'incubatore a circa il 100% di umidità riempiendo il vassoio dell'acqua con acqua RO dell'autoclave.

Regolare la velocità di rotazione dell'incubatore in modo che corrisponda alla velocità di sedimentazione delle cellule, in modo che le cellule non cadano attraverso il supporto. Il primo giorno di preparazione del trattamento, controllare la formazione di bolle ogni poche ore come descritto nel manoscritto del testo. Rimuovere le bolle almeno una volta al giorno andando avanti fino alla fine della durata del trattamento desiderata.

Una volta trascorsa la durata prevista del trattamento, interrompere la rotazione e smontare l'apparecchio. Rimuovere il recipiente di trattamento tenendo delicatamente il recipiente fermo mentre si ruota il piolo rotante del dispositivo in senso orario. Portare il pallone di controllo, il recipiente di controllo e il recipiente trattato in un armadio di sicurezza biologica sterile.

Prendere ogni recipiente escluso il pallone di controllo e capovolgerlo, in modo che sia rivolto verso il basso. Quindi colpirlo delicatamente per portare tutte le cellule in sospensione. Quindi ruotare il recipiente su un lato con la porta di riempimento verso il basso e colpirlo di nuovo per guidare le celle verso la porta di riempimento per un'aspirazione efficiente.

Maneggiare ogni nave individualmente. Svitare le siringhe dalle due porte e distribuirle nei rifiuti a rischio biologico. Aprire i rubinetti di arresto sulle porte della siringa.

Rimuovere con cautela il tappo della porta di riempimento e aspirare il contenuto utilizzando una pipetta sierologica sterile da 10 ml, inclinando il recipiente mentre viene svuotato. Erogare il contenuto di tutti i gruppi di controllo e trattamento in provette coniche da 15 mL etichettate individualmente. Chiudi ogni tubo e capovolgilo delicatamente alcune volte per assicurarti che siano miscelati correttamente.

Utilizzare il metodo preferito per determinare la concentrazione e la vitalità della coltura cellulare risultante per prepararsi ai successivi saggi sperimentali. La vitalità iniziale della linea cellulare NK-92 e le densità di seduta sono state confrontate con la vitalità finale risultante e le concentrazioni finali. Dopo un trattamento SMG di 72 ore, sono stati confrontati due casi di esiti negativi e positivi.

Per confronto, l'intervallo di concentrazione ottimale della linea cellulare NK-92 utilizzata era compreso tra 0,3 e 1,2 milioni di cellule per millilitro con un tempo di raddoppio di circa due o tre giorni. La proliferazione nel gruppo di trattamento SMG è stata approssimativamente uguale tra i gruppi di controllo e di trattamento. Questi parametri sono stati essenziali per il successo sperimentale a valle e le cellule risultanti dai due gruppi di controllo hanno funzionato in modo simile nei saggi sperimentali a valle.

È fondamentale monitorare e tenere conto della formazione di bolle durante tutto il corso del trattamento, specialmente nella coltura cellulare sottoposta a microgravità simulata. La formazione di grandi bolle può causare interruzioni alla fluidodinamica all'interno del vaso, e questo essenzialmente annullerà la condizione di microgravità simulata.