Auustofori microfluidica per la separazione flowthrough di batteri Gram-negativi utilizzando perline di affinità aptamero

Questo protocollo descrive la nostra tecnologia di acoustophoresis microfluidica che può essere utilizzata per la separazione rapida ed efficiente dei batteri Gram-negativi da un mezzo utilizzando micro sfere modificate con aptamero. I sistemi di acoustophoresis microfluidica consentono la separazione dei batteri Gram-negativi con un throughput ragionevole e l'isolamento cellulare senza contatto. L'acoustophoresis microfluidica può essere ottimizzata per isolare i batteri da campioni medici e ambientali.

Per iniziare, progettare un chip di acoustophoresis microfluidica che raccoglie le sfere di PS all'uscita di destinazione e scarta il resto dopo aver iniettato una miscela di campioni PS nell'ingresso del campione. Preparare un chip con gli strati sopra e sotto lo strato di silicio legato al vetro borosilicato. E un terzo strato di vetro borosilicato, usando l'anodizzazione, aggiunge 1000 volt e 400 gradi Celsius.

Attaccare un PZT allo strato di vetro borosilicato lungo il canale microfluidico utilizzando meno di 10 microlitri di adesivo cianoacrilato. Inoculare i batteri GN e GP nel mezzo Luria-Bertani e incubarlo a 37 gradi Celsius e 220 giri al minuto per 16 ore. Centrifugare i batteri coltivati a 9, 056 RCF per un minuto a temperatura ambiente.

Quindi lavare due volte con tampone PBS 1X. Preparare i batteri GN e GP selezionati per l'analisi risospendendoli nel tampone di legame. Risospendere la miscela di microsfere rivestita di streptavidina da 10 micrometri prima dell'uso.

Vortice la miscela per 20 secondi. Preparare l'aptamero denaturandolo a 95 gradi Celsius per tre minuti, quindi ripiegandolo a zero gradi Celsius per due minuti. Trasferire 250 microlitri della miscela di microsfere rivestita di streptavidina ricoperta in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungere 100 microlitri di aptamero di DNA biotinilato al tubo.

Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti ruotando a 25 giri al minuto. Centrifugare la miscela di reazione a 9, 056 RCF per 40 secondi a temperatura ambiente. Quindi lavare il tubo due volte con 200 microlitri di tampone Tris-HCl.

Aggiungere 10 microlitri di 100 milligrammi per millilitro di BSA alla provetta lavata e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente ruotando a 25 giri al minuto. Infine, lavare due volte le microsfere modificate aptamero nel tampone Tris-HCl mediante centrifugazione a 9.056 RCF per 40 secondi a temperatura ambiente. Collegare i tubi PEEK ai due ingressi per iniettare due campioni e tampone e le due uscite per la raccolta e lo scarico dei rifiuti.

Utilizzando una siringa da 10 millilitri, riempire il canale di acoustophoresis microfluidica con acqua demineralizzata senza bolle. Preparare un regolatore di pressione di precisione con due o più canali di uscita per controllare il flusso del fluido. Dopo aver preparato il dispositivo, iniettare il campione e il tampone applicando una pressione di due kilopascal all'ingresso del campione e quattro kilopascal all'ingresso del tampone utilizzando il dispositivo di controllo della pressione di precisione.

Utilizzando un microscopio, concentrarsi su una perlina e spostarla al centro del canale microfluidico utilizzando il PZT. Generare una frequenza di risonanza di 3,66 megahertz utilizzando un generatore di funzioni a canale singolo e amplificare un segnale tipico di 16 decibel utilizzando un amplificatore di potenza. Osservare i processi di separazione e arricchimento sul chip acustofluidico con un microscopio a fluorescenza e una telecamera ad alta velocità funzionante a 1.200 fotogrammi al secondo.

Il chip acustoforetico introdotto in questo studio ha confermato che, all'aumentare della tensione del PZT, la concentrazione centrale delle perle di dimensioni 10 micrometriche è aumentata. A cinque volt della tensione PZT, la maggior parte delle perle di dimensioni di 10 micrometri erano concentrate al centro. Il rapporto tra il numero di perle raccolte all'uscita e il numero totale di perle iniettate di dimensioni di 10 micrometri è stato indicato come tasso di recupero.

Il rapporto tra il numero di perle di dimensioni di 10 micrometri e il numero totale di perle raccolte è stato indicato come purezza. I risultati hanno indicato che il dispositivo aveva un'elevata efficienza di separazione per perline con una dimensione di 10 micrometri. Il numero di batteri GN e GP legati a ciascun micro tallone modificato aptamero è stato misurato utilizzando un microscopio con una telecamera ad alta velocità.

Tutti e cinque i batteri GN erano legati alle perle mentre significativamente meno batteri GP erano legati alle sostanze testate. La potenza del segnale differiva significativamente tra i batteri GN e GP. L'adesivo utilizzato per fissare il PZT deve essere usato il meno possibile per la precisione dell'ondulazione e il PZT e il microcanale devono essere paralleli.

Questo dispositivo può essere utilizzato per rilevare batteri vivi o biomarcatori derivati da batteri nel periodo di diagnosi precoce delle malattie infettive batteriche.