Misurazione delle proprietà dello scheletro periodico della membrana del segmento iniziale dell'assone mediante microscopia a illuminazione strutturata in 3D (3D-SIM)
11 febbraio 2022
Il presente protocollo descrive un metodo per visualizzare e misurare gli anelli di actina e altri componenti dello scheletro periodico di membrana del segmento iniziale dell'assone utilizzando neuroni ippocampali di ratto in coltura e microscopia a illuminazione strutturata in 3D (3D-SIM).
Questo protocollo consente di risolvere lo scheletro periodico della membrana nel segmento iniziale dell'assone dei neuroni in coltura. Esaminando la localizzazione delle proteine, è possibile ottenere informazioni sulla funzione nello scheletro periodico della membrana. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua robustezza e facilità d'uso.
La microscopia ad illuminazione strutturata è in grado di risolvere lo scheletro periodico della membrana e la preparazione del campione è facile e diretta. Chiunque abbia precedenti esperienze nella microscopia a fluorescenza può facilmente implementare questa tecnica. Questo protocollo è progettato per massimizzare il rapporto segnale/rumore durante la preparazione del campione e l'imaging.
Per iniziare, fissare i neuroni usando il 4% di paraformaldeide per 12 minuti a temperatura ambiente. Lavare il coperchio scivolare una volta nello 0,2% di BSA in soluzione tampone fosfato e incubare per 10 minuti in una soluzione all'1% di Triton X in PBS a temperatura ambiente. Lavare il coperchio con BSA in soluzione tampone fosfato, diluire gli anticorpi anti anchirina G usando BSA in una soluzione tampone fosfato con rapporto da uno a 200.
Aggiungere una soluzione anticorpale al coperchio e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule una volta in soluzione tampone fosfato BSA una volta nello 0,1% di Triton X in soluzione tampone fosfato e una volta in soluzione tampone fosfato. Diluire Fluoro 4 marcato, aggiungere più anticorpi secondari nella soluzione tampone fosfato BSA e aggiungere al coperchio slip.
Lavare le cellule una volta in soluzione tampone fosfato BSA una volta in 0,1% Triton X in soluzione tampone fosfato, quindi una volta in soluzione tampone fosfato. Preparare una soluzione micromolare di Ferodin marcata in soluzione tampone fosfato e aggiungerla alle cellule. Lavare le cellule una volta in soluzione tampone di albumina fosfato sierica bovina una volta nello 0,1% di Triton X in soluzione tampone fosfato, quindi una volta in soluzione tampone fosfato.
Per montare il coperchio scivolare su un vetrino, applicare una goccia di supporto di montaggio su una diapositiva, immergere il coperchio in acqua deionizzata e picchiettarlo con un tovagliolo di carta morbida per rimuovere l'acqua in eccesso. Posizionare il coperchio scivolare sul vetrino e incubare a temperatura ambiente per 24 ore. Se possibile, consultare il personale della struttura di microscopia prima dell'imaging e utilizzare un calcolatore di olio ad immersione per selezionare l'olio ad immersione adatto al campione.
Una volta che i campioni sono pronti, assicurarsi che i coperchi siano puliti e privi di residui pulendoli con una punta di cotone imbevuta di acqua o etanolo. Posizionare il campione in un microscopio 3D-SIM e trovare la cella per catturare l'immagine. Regolare la potenza delle linee laser pertinenti.
E i tempi di esposizione per massimizzare il rapporto segnale/rumore senza sbiancare significativamente il campione. Impostate i limiti superiore e inferiore del campione nella dimensione Z e procedete all'acquisizione di una pila. Eseguire l'algoritmo di ricostruzione sullo stack per ottenere una ricostruzione super risolta.
Controllare le ricostruzioni per gli artefatti noti e, se necessario, regolare i parametri per correggerli. Confronta la ricostruzione della SIM con un'immagine a campo largo per osservare i miglioramenti della risoluzione. Quando si esegue la microscopia a illuminazione strutturata multicolore, utilizzare l'algoritmo di allineamento per allineare correttamente i diversi canali, una volta pronta una ricostruzione soddisfacente.
Gli anelli di actina nello scheletro periodico della membrana hanno un aspetto periodico distintivo. Crea un'immagine di proiezione di massima intensità nel software di analisi delle immagini utilizzando tutti i piani focali in cui sono visibili gli anelli di actina. Nell'immagine di proiezione di massima intensità, disegna una linea perpendicolare attraverso anelli adiacenti visibili e registra l'intensità di fluorescenza insieme alla funzione del profilo di grafico delle linee del software.
Per calcolare la distanza media tra i picchi, annotare i massimi locali nel profilo della linea e misurare la distanza tra i singoli picchi di intensità fluorescente adiacenti. Per valutare la colocalizzazione di diverse proteine con anelli di actina nello scheletro periodico della membrana, eseguire una procedura di analisi di colocalizzazione sulle ricostruzioni SIM dell'actina e della proteina candidata. Disegna manualmente una selezione per definire il segmento iniziale dell'assone come regione di interesse, per il plug-in di colocalizzazione facile nella piattaforma software ed esegui l'analisi per calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson per la colocalizzazione.
Durante l'analisi delle immagini SIM, le ricostruzioni delle pile di immagini, hanno mostrato una chiara periodicità degli anelli di actina. Un anticorpo anti anchirina G è stato utilizzato per visualizzare l'anchirina G.La colocalizzazione degli anelli di anchirina G e actina è stata testata nel segmento iniziale dell'assone utilizzando una procedura di analisi della colocalizzazione per calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson. Il coefficiente di correlazione di Pearson per la colocalizzazione della fluorescenza degli anelli di anchirina G e actina era 0,36 più o meno 0,03.
È essenziale utilizzare l'olio di immersione giusto e regolare la potenza del laser e il tempo di esposizione per rendere visibili le linee della griglia. Una volta determinato che la proteina fa parte dello scheletro periodico della membrana, la sua funzione può essere studiata e stabilita nel mantenimento dello scheletro periodico della membrana. Ad esempio, è possibile analizzare gli effetti dell'abbattimento della proteina sugli anelli di actina.
Lo sviluppo di tecniche di microscopia a super risoluzione è la ragione per cui sappiamo che il segmento iniziale dell'assone contiene scheletro periodico di membrana composto da anelli di actina, spettro e anchirina. SIM ha permesso ai ricercatori di visualizzare facilmente i componenti periodici dello scheletro della membrana e di osservare gli anelli di actina nelle cellule vive.
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Panoramica
Questo studio descrive un protocollo per la visualizzazione e la misurazione degli anelli di actina all'interno dello scheletro periodico della membrana del segmento iniziale dell'assone, utilizzando neuroni ippocampali di ratto in coltura e microscopia a illuminazione strutturata 3D (3D-SIM). La tecnica consente ai ricercatori di esplorare la localizzazione delle proteine, migliorando la comprensione della funzione dello scheletro periodico della membrana.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecnica di microscopia
Sfondo
- Il segmento iniziale dell'assone è cruciale per la segnalazione neuronale.
- Gli anelli di actina svolgono un ruolo significativo nel mantenimento dello scheletro periodico della membrana.
- La microscopia a illuminazione strutturata migliora la risoluzione nell'immagine di campioni biologici.
- Comprendere la localizzazione delle proteine fornisce informazioni sui loro ruoli funzionali.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo affidabile per l'immagine degli anelli di actina nei neuroni coltivati.
- Chiarire i componenti dello scheletro periodico della membrana.
- Facilitare l'analisi di colocalizzazione di varie proteine nel segmento iniziale dell'assone.
Metodi Utilizzati
- Utilizzato un microscopio a illuminazione strutturata 3D per l'acquisizione di immagini.
- Il modello biologico principale comprendeva neuroni dell'ippocampo di ratto in coltura.
- Nel testo non è stata trovata alcuna menzione di flussi di lavoro di multiomica.
- I passaggi critici includevano la fissazione, l'incubazione con anticorpi e la preparazione per l'acquisizione delle immagini.
- È stata effettuata l'analisi delle immagini per valutare la periodicità degli anelli di actina e la codistribuzione delle proteine.
Risultati principali
- Il protocollo ha permesso la visualizzazione degli anelli di actina con una periodicità distintiva.
- È stata quantificata la codistribuzione di ankirina G e anelli di actina, ottenendo un coefficiente di Pearson di 0,36 ± 0,03.
- L'identificazione degli anelli di actina ne supporta il ruolo nello scheletro periodico della membrana.
- La SIM ha consentito miglioramenti chiari nella risoluzione rispetto ai tradizionali metodi di imaging a campo largo.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo robusto per analizzare lo scheletro periodico della membrana nei neuroni.
- Tecniche di imaging avanzate contribuiscono alla comprensione dell'architettura cellulare nelle cellule neuronali.
- Le intuizioni derivanti da questa ricerca gettano le basi per future esplorazioni delle funzioni delle proteine neuronali e delle loro implicazioni nella salute e nelle malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Comprendere l'organizzazione strutturale dello scheletro periodico della membrana del segmento iniziale dell'assone supporta la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze, chiarendo il contesto spaziale dei canali ionici e delle proteine di ancoraggio. Questa conoscenza meccanicistica permette una riduzione predittiva del rischio associato a ipotesi terapeutiche relative ai disturbi dell'eccitabilità neuronale. Il metodo aumenta la fiducia negli studi sull'interazione con l'obiettivo fornendo dati spaziali quantitativi sulla localizzazione delle proteine all'interno di un compartimento subcellulare rilevante per la patologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche risolvendo l'architettura su scala nanometrica dello scheletro periodico della membrana del segmento iniziale dell'assone.
- Valore operativo: Fornisce un metodo accessibile e robusto di super-risoluzione per la validazione della localizzazione del bersaglio in modelli neuronali.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica attraverso la valutazione quantitativa della periodicità proteica e della codistribuzione con gli anelli di actina.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera profili quantitativi di intensità della fluorescenza e coefficienti di correlazione di Pearson per valutare le relazioni spaziali tra proteine e anelli di actina.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro di imaging riproducibili e standardizzati, compatibili con formati di colture neuronali multi-pozzetto.
- Prontezza del saggio: Produce ricostruzioni a super-risoluzione che consentono il rilevamento affidabile di pattern di localizzazione subcellulare delle proteine.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la localizzazione del bersaglio molecolare al mantenimento funzionale dello scheletro periodico della membrana in un sistema neuronale rilevante per la malattia.
- De-risking Meccanicistico: Chiarisce se le proteine candidate siano componenti strutturali dell'impalcatura iniziale dell'assone, fornendo indicazioni per la selezione dei bersagli in condizioni neuropsichiatriche.
- Conferma Predittiva: Supporta le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto determinando se una proteina faccia parte dello scheletro periodico prima della validazione funzionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la validazione del bersaglio mediante risoluzione subcellulare e consentendo il passaggio a studi meccanicistici in modelli neuronali.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi determinando se una proteina mostra una localizzazione periodica compatibile con l'integrazione nello scheletro periodico della membrana.
- Screening: Permette lo sviluppo di saggi per l'analisi ad alto contenuto di modelli di localizzazione proteica in colture neuronali fissate.
- Analisi: Fornisce letture quantitative, inclusa la misurazione delle distanze inter-picchi e i coefficienti di codistribuzione, per un confronto oggettivo tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati molecolari all'integrità strutturale del segmento iniziale dell'assone, un determinante chiave della polarità neuronale e della trasmissione del segnale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata di imaging applicabile a diversi bersagli nei programmi di scoperta nel campo delle neuroscienze.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica definendo l'organizzazione spaziale a scala nanometrica delle proteine del segmento iniziale dell'assone.
- Valore operativo: Offre semplicità d'uso e robustezza, richiedendo soltanto esperienza standard nella microscopia a fluorescenza e strumentazione super-risolvente accessibile.
- Valore strategico: Migliora la fiducia nella selezione delle proteine bersaglio mediante la validazione della localizzazione subcellulare prima di investire in saggi funzionali.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, in funzione della loro integrazione all'interno dello scheletro del segmento iniziale dell'assone.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede familiarità con i principi della microscopia a fluorescenza e dell'imaging super-risolutivo.
- È subordinato all'accesso a strumentazione 3D-SIM e all'ottimizzazione dell'olio di immersione appropriato.
- Necessita di una validazione standardizzata degli anticorpi e di condizioni di bloccaggio per ridurre al minimo il segnale non specifico.
- Comporta una precisa calibrazione della potenza del laser e del tempo di esposizione per bilanciare il rapporto segnale-rumore con il fotoblecamento.
- È applicabile principalmente a colture neuronali fissate; per applicazioni su cellule vive sono necessarie ulteriori validazioni.
