Misurazione delle proprietà dello scheletro periodico della membrana del segmento iniziale dell'assone mediante microscopia a illuminazione strutturata in 3D (3D-SIM)
February 11th, 2022
Il presente protocollo descrive un metodo per visualizzare e misurare gli anelli di actina e altri componenti dello scheletro periodico di membrana del segmento iniziale dell'assone utilizzando neuroni ippocampali di ratto in coltura e microscopia a illuminazione strutturata in 3D (3D-SIM).
Questo protocollo consente di risolvere lo scheletro periodico della membrana nel segmento iniziale dell'assone dei neuroni in coltura. Esaminando la localizzazione delle proteine, è possibile ottenere informazioni sulla funzione nello scheletro periodico della membrana. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua robustezza e facilità d'uso.
La microscopia ad illuminazione strutturata è in grado di risolvere lo scheletro periodico della membrana e la preparazione del campione è facile e diretta. Chiunque abbia precedenti esperienze nella microscopia a fluorescenza può facilmente implementare questa tecnica. Questo protocollo è progettato per massimizzare il rapporto segnale/rumore durante la preparazione del campione e l'imaging.
Per iniziare, fissare i neuroni usando il 4% di paraformaldeide per 12 minuti a temperatura ambiente. Lavare il coperchio scivolare una volta nello 0,2% di BSA in soluzione tampone fosfato e incubare per 10 minuti in una soluzione all'1% di Triton X in PBS a temperatura ambiente. Lavare il coperchio con BSA in soluzione tampone fosfato, diluire gli anticorpi anti anchirina G usando BSA in una soluzione tampone fosfato con rapporto da uno a 200.
Aggiungere una soluzione anticorpale al coperchio e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule una volta in soluzione tampone fosfato BSA una volta nello 0,1% di Triton X in soluzione tampone fosfato e una volta in soluzione tampone fosfato. Diluire Fluoro 4 marcato, aggiungere più anticorpi secondari nella soluzione tampone fosfato BSA e aggiungere al coperchio slip.
Lavare le cellule una volta in soluzione tampone fosfato BSA una volta in 0,1% Triton X in soluzione tampone fosfato, quindi una volta in soluzione tampone fosfato. Preparare una soluzione micromolare di Ferodin marcata in soluzione tampone fosfato e aggiungerla alle cellule. Lavare le cellule una volta in soluzione tampone di albumina fosfato sierica bovina una volta nello 0,1% di Triton X in soluzione tampone fosfato, quindi una volta in soluzione tampone fosfato.
Per montare il coperchio scivolare su un vetrino, applicare una goccia di supporto di montaggio su una diapositiva, immergere il coperchio in acqua deionizzata e picchiettarlo con un tovagliolo di carta morbida per rimuovere l'acqua in eccesso. Posizionare il coperchio scivolare sul vetrino e incubare a temperatura ambiente per 24 ore. Se possibile, consultare il personale della struttura di microscopia prima dell'imaging e utilizzare un calcolatore di olio ad immersione per selezionare l'olio ad immersione adatto al campione.
Una volta che i campioni sono pronti, assicurarsi che i coperchi siano puliti e privi di residui pulendoli con una punta di cotone imbevuta di acqua o etanolo. Posizionare il campione in un microscopio 3D-SIM e trovare la cella per catturare l'immagine. Regolare la potenza delle linee laser pertinenti.
E i tempi di esposizione per massimizzare il rapporto segnale/rumore senza sbiancare significativamente il campione. Impostate i limiti superiore e inferiore del campione nella dimensione Z e procedete all'acquisizione di una pila. Eseguire l'algoritmo di ricostruzione sullo stack per ottenere una ricostruzione super risolta.
Controllare le ricostruzioni per gli artefatti noti e, se necessario, regolare i parametri per correggerli. Confronta la ricostruzione della SIM con un'immagine a campo largo per osservare i miglioramenti della risoluzione. Quando si esegue la microscopia a illuminazione strutturata multicolore, utilizzare l'algoritmo di allineamento per allineare correttamente i diversi canali, una volta pronta una ricostruzione soddisfacente.
Gli anelli di actina nello scheletro periodico della membrana hanno un aspetto periodico distintivo. Crea un'immagine di proiezione di massima intensità nel software di analisi delle immagini utilizzando tutti i piani focali in cui sono visibili gli anelli di actina. Nell'immagine di proiezione di massima intensità, disegna una linea perpendicolare attraverso anelli adiacenti visibili e registra l'intensità di fluorescenza insieme alla funzione del profilo di grafico delle linee del software.
Per calcolare la distanza media tra i picchi, annotare i massimi locali nel profilo della linea e misurare la distanza tra i singoli picchi di intensità fluorescente adiacenti. Per valutare la colocalizzazione di diverse proteine con anelli di actina nello scheletro periodico della membrana, eseguire una procedura di analisi di colocalizzazione sulle ricostruzioni SIM dell'actina e della proteina candidata. Disegna manualmente una selezione per definire il segmento iniziale dell'assone come regione di interesse, per il plug-in di colocalizzazione facile nella piattaforma software ed esegui l'analisi per calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson per la colocalizzazione.
Durante l'analisi delle immagini SIM, le ricostruzioni delle pile di immagini, hanno mostrato una chiara periodicità degli anelli di actina. Un anticorpo anti anchirina G è stato utilizzato per visualizzare l'anchirina G.La colocalizzazione degli anelli di anchirina G e actina è stata testata nel segmento iniziale dell'assone utilizzando una procedura di analisi della colocalizzazione per calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson. Il coefficiente di correlazione di Pearson per la colocalizzazione della fluorescenza degli anelli di anchirina G e actina era 0,36 più o meno 0,03.
È essenziale utilizzare l'olio di immersione giusto e regolare la potenza del laser e il tempo di esposizione per rendere visibili le linee della griglia. Una volta determinato che la proteina fa parte dello scheletro periodico della membrana, la sua funzione può essere studiata e stabilita nel mantenimento dello scheletro periodico della membrana. Ad esempio, è possibile analizzare gli effetti dell'abbattimento della proteina sugli anelli di actina.
Lo sviluppo di tecniche di microscopia a super risoluzione è la ragione per cui sappiamo che il segmento iniziale dell'assone contiene scheletro periodico di membrana composto da anelli di actina, spettro e anchirina. SIM ha permesso ai ricercatori di visualizzare facilmente i componenti periodici dello scheletro della membrana e di osservare gli anelli di actina nelle cellule vive.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo studio delinea un protocollo per visualizzare e misurare gli anelli di actina all'interno dello scheletro periodico della membrana del segmento iniziale dell'assone utilizzando neuroni ippocampali di ratto coltivati e microscopia a illuminazione strutturata 3D (3D-SIM). La tecnica consente ai ricercatori di esplorare la localizzazione delle proteine, migliorando la comprensione della funzione dello scheletro periodico della membrana.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Tecnica di microscopia
Sfondo
- Il segmento iniziale dell'assone è cruciale per la segnalazione neuronale.
- Gli anelli di actina svolgono un ruolo significativo nel mantenimento dello scheletro periodico della membrana.
- La microscopia a illuminazione strutturata migliora la risoluzione nell'imaging di campioni biologici.
- Comprendere la localizzazione delle proteine offre informazioni sui loro ruoli funzionali.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un protocollo affidabile per l'imaging degli anelli di actina nei neuroni coltivati.
- Chiarire i componenti dello scheletro periodico della membrana.
- Facilitare l'analisi di colocalizzazione di varie proteine nel segmento iniziale dell'assone.
Metodi utilizzati
- È stata utilizzata la microscopia a illuminazione strutturata 3D per l'imaging.
- Il modello biologico chiave coinvolto erano neuroni ippocampali di ratto coltivati.
- Non è stata trovata menzione di flussi di lavoro multiomics nel testo.
- Le fasi critiche includevano la fissazione, l'incubazione con gli anticorpi e la preparazione per l'imaging.
- L'analisi delle immagini è stata eseguita per valutare la periodicità degli anelli di actina e la colocalizzazione delle proteine.
Risultati principali
- Il protocollo ha consentito la visualizzazione di anelli di actina con periodicità distintiva.
- La colocalizzazione di anchirina G e anelli di actina è stata quantificata, ottenendo un coefficiente di Pearson di 0,36 ± 0,03.
- L'identificazione degli anelli di actina supporta il loro ruolo nello scheletro periodico della membrana.
- SIM ha permesso miglioramenti chiari nella risoluzione rispetto ai tradizionali metodi di imaging a campo ampio.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo robusto per analizzare lo scheletro periodico della membrana nei neuroni.
- Le tecniche di imaging avanzate contribuiscono alla comprensione dell'architettura cellulare nelle cellule neuronali.
- Le intuizioni di questa ricerca gettano le basi per la futura esplorazione delle funzioni delle proteine neuronali e le loro implicazioni nella salute e nella malattia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding the structural organization of the axon initial segment's membrane periodic skeleton supports target validation in neuroscience drug discovery by clarifying the spatial context of ion channels and scaffolding proteins. This mechanistic insight enables predictive de-risking of therapeutic hypotheses related to neuronal excitability disorders. The method enhances confidence in target engagement studies by providing quantitative spatial data on protein localization within a disease-relevant subcellular compartment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving the nanoscale architecture of the axon initial segment membrane periodic skeleton.
- Operational Value: Provides a robust, accessible super-resolution method for validating target localization in neuronal models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through quantitative assessment of protein periodicity and colocalization with actin rings.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity profiles and Pearson's correlation coefficients for assessing protein-actin ring spatial relationships.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized imaging workflows compatible with multi-well neuronal culture formats.
- Assay Readiness: Produces super-resolved reconstructions that enable reliable detection of subcellular protein localization patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular target localization to functional maintenance of the membrane periodic skeleton in a disease-relevant neuronal system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether candidate proteins are structural components of the axon initial scaffold, informing target selection for neuropsychiatric indications.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by determining if a protein is part of the periodic skeleton prior to functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through subcellular resolution and enabling progression to mechanistic studies in neuronal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by determining if a protein exhibits periodic localization consistent with membrane periodic skeleton integration.
- Screening: Enables assay development for high-content analysis of protein localization patterns in fixed neuronal cultures.
- Analytics: Provides quantitative readouts including inter-peak distance measurements and colocalization coefficients for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to structural integrity of the axon initial segment, a key determinant of neuronal polarity and signaling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple targets across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the nanoscale spatial organization of axon initial segment proteins.
- Operational Value: Offers ease of use and robustness, requiring only standard fluorescence microscopy experience and accessible super-resolution instrumentation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by validating subcellular localization before investing in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their integration into the axon initial segment scaffold.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and super-resolution imaging principles.
- Dependent on access to 3D-SIM instrumentation and appropriate immersion oil optimization.
- Necessitates standardized antibody validation and blocking conditions to minimize nonspecific signal.
- Involves careful laser power and exposure calibration to balance signal-to-noise ratio with photobleaching.
- Applicable primarily to fixed neuronal cultures; live-cell applications require additional validation.
