Modellazione dell'emorragia intraventricolare neonatale attraverso l'iniezione intraventricolare di emoglobina
25 agosto 2022
Presentiamo un modello di emorragia intraventricolare neonatale utilizzando cuccioli di ratto che imita la patologia osservata negli esseri umani.
Questo protocollo è significativo perché sviluppiamo un modello clinicamente rilevante di danno cerebrale indotto da IVH e idrocefalo, utilizzando l'iniezione di emoglobina nei ventricoli, che consente la successiva quantificazione dei volumi del ventricolo nell'applicazione, per testare nuove strategie terapeutiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio della patologia dell'IVH che è specificamente mediata dall'emoglobina e dai prodotti di degradazione del sangue della via del ferro. Questa tecnica è anche facile da usare e versatile.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di terapie per l'idrocefalo post-emorragico, in quanto consente un'ulteriore comprensione della fisiopatologia IVH e la valutazione di strategie di trattamento clinicamente rilevanti per la prevenzione delle sequele neurologiche dopo IVH. A dimostrare la procedura sarà Sruthi Ramagiri, un post-doc associato dell'Australia Laboratory. Per iniziare posizionare il ratto anestetizzato incline nell'apparato stereotassico con il naso posizionato nell'adattatore per anestesia.
Quindi fissare la testa stringendo le barre auricolari non di rottura sul meato uditivo esterno. Per pulire la testa, toccare prima un applicatore sterile con punta di cotone imbevuto di Betadine al centro della testa e spostarsi verso l'esterno per diffondere il Betadine in cerchi. Quindi ripetere il processo con un applicatore imbevuto di etanolo al 70%.
Successivamente, usando un bisturi, fai un'incisione di 0,3 centimetri verticalmente lungo il centro della testa per esporre il bregma del cranio. Quindi asciugare l'area utilizzando un applicatore con punta di cotone. Per impostare l'iniettore stereotassico, aspirare la soluzione di emoglobina precedentemente preparata in una siringa da 0,3 o 0,5 millilitri e posizionare la siringa nel sistema di iniettori stereotassici.
Quindi, attivare l'interfaccia dell'iniettore stereotassico e fare clic sul pulsante di configurazione per inserire il volume di iniezione e le impostazioni della velocità. Fare clic sul volume e impostare il volume su 20.000 nanolitri. Quindi fare clic sulla velocità di infusione e impostare la velocità su 8.000 nanolitri al minuto.
Fare clic sul pulsante di ripristino della posizione per uscire dalla configurazione. Lavare la punta dell'ago facendo clic sul pulsante di infusione fino a quando una piccola perla di emoglobina appare sulla punta dell'ago, quindi utilizzare un applicatore con punta di cotone per rimuovere delicatamente il tallone. Per iniziare l'iniezione animale, impostare il bregma come zero sul sistema di iniezione stereotassica regolando le posizioni mediolaterale e anteroposteriore della siringa.
Quindi abbassare l'ago della siringa per toccare delicatamente il cranio al bregma. Dopo aver identificato le coordinate di scelta, sollevare l'ago della siringa un centimetro sopra il cranio per liberare il cuoio capelluto. Impostare le coordinate mediolaterali e anteroposteriori.
Quindi abbassare la siringa affinché l'ago tocchi delicatamente il cranio e impostare la coordinata dorsoventrale nell'arco di 30 secondi. Una volta impostate le coordinate, iniziare l'iniezione facendo clic sul pulsante di esecuzione sull'interfaccia dell'iniettore stereotassico. Al termine dell'iniezione, lasciare l'ago in posizione per due minuti per ridurre al minimo il riflusso della soluzione.
Quindi, ritirare lentamente la siringa lungo la coordinata dorsoventrale per due minuti, fino a quando la punta dell'ago è due centimetri sopra il cuoio capelluto. Quindi ruotare il braccio iniettore stereotassico lontano dal campo operatorio e chiudere il cuoio capelluto con una sutura monofilamento 6-O. Per la risonanza magnetica, eseguire l'imaging pesato T2 selezionando una sequenza di eco a rotazione rapida pesata T2.
Dopo aver impostato i parametri MRI come descritto nel testo, fare clic sul pulsante Continua per avviare la sequenza. Per l'elaborazione delle immagini e l'analisi del volume cerebrale, aprire i dati pesati T2 nativi nel software di segmentazione. Per delineare manualmente i ventricoli laterali, fare clic sulla modalità pennello e selezionare lo stile del pennello quadrato, quindi regolare la dimensione del pennello su uno.
Quindi, fai clic su Impostazioni layout, seleziona Vista assiale e fai clic su Zoom per adattare. Quindi posizionare il cursore sull'immagine e tracciare e riempire lo spazio del ventricolo laterale. Infine, fai clic sulla segmentazione nella barra degli strumenti, seguita da volume e statistiche per visualizzare i volumi segmentati.
Gli animali sottoposti a iniezione di emoglobina hanno sviluppato ventricolomegalia moderata quando valutati tramite risonanza magnetica. Con ventricoli laterali significativamente più grandi a 24 ore e 72 ore dopo l'iniezione di emoglobina, rispetto agli animali iniettati con ACSF. Sebbene la differenza nel volume ventricolare laterale tra i due gruppi di ratti non fosse significativa dopo 38 giorni, le scansioni MRI hanno dimostrato che il 44% dei ratti trattati con emoglobina aveva ancora ventricolomegalia irrisolta.
Inoltre, rispetto all'ACSF, l'iniezione di emoglobina ha comportato una significativa diminuzione del volume della sostanza bianca dopo 38 giorni. L'emoglobina ha anche promosso una risposta infiammatoria in vivo, come evidente dal livello significativamente più alto del fattore di necrosi tumorale delle citochine pro-infiammatorie alfa dopo l'iniezione di emoglobina, ma non di sangue salino o intero. Inoltre, la colorazione immunoistochimica della proteina acida fibrillare gliale ha rivelato un'attivazione significativamente più elevata degli astrociti dopo l'iniezione di emoglobina, rispetto a dopo l'iniezione di ACSF.
La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è impostare le coordinate di iniezione corrette per garantire la consegna dell'emoglobina nei ventricoli laterali. Seguendo questa procedura, i traccianti CSF possono essere consegnati nello spazio CSF per valutare i cambiamenti nella circolazione del CSF e i modelli di efflusso dopo IVH. Questo metodo aggiuntivo affronta il modo in cui il flusso CSF viene alterato in IVH PHH.
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Panoramica
Questo articolo presenta un modello animale semplice e clinicamente rilevante per lo studio dell'idrocefalo post-emorragico (PHH) successivo a emorragia intraventricolare neonatale (IVH). Iniettando emoglobina nei ventricoli laterali di ratti neonati, il modello induce in modo affidabile un allargamento ventricolare, un danno alla sostanza bianca e un'infiammazione, riproducendo fedelmente le caratteristiche cliniche del PHH. Il protocollo descrive inoltre metodi per quantificare le dimensioni dei ventricoli mediante risonanza magnetica (MRI) e analisi delle immagini.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Disturbi dello sviluppo neurologico
- Modellistica animale
Sfondo
- L'emorragia intraventricolare (IVH) è una complicanza comune della nascita pretermine, che spesso porta a idrocefalo post-emorragico (PHH) e deficit neurologici a lungo termine.
- Le attuali terapie per il PHH si limitano alla derivazione chirurgica del liquido cefalorachidiano (CSF); non esistono terapie farmacologiche per prevenire o trattare il danno cerebrale indotto da IVH.
- I modelli animali esistenti richiedono spesso iniezioni di grande volume, che possono introdurre variabilità e complicare la modellizzazione della patologia.
- Negli studi clinici, l'emoglobina e la ferritina sono state implicate nell'ingrandimento ventricolare dopo IVH.
Scopo dello studio
- Sviluppare un modello animale semplice e riproducibile di PHH indotta da IVH, utilizzando iniezioni di emoglobina in piccolo volume.
- Permettere l'induzione affidabile di idrocefalo e delle lesioni cerebrali associate, per studi di patofisiologia.
- Fornire una piattaforma per testare nuove strategie terapeutiche mirate a IVH e PHH.
Metodi Utilizzati
- Iniezione stereotassica di soluzione di emoglobina nei ventricoli laterali di ratti neonati anestetizzati.
- Controllo preciso del volume di iniezione (20.000 nanolitri) e della velocità di iniezione (8.000 nanolitri/minuto) mediante un iniettore stereotassico.
- Risonanza magnetica post-iniezione (imaging pesato in T2) per valutare l'ingrandimento ventricolare e le alterazioni della sostanza bianca.
- Segmentazione manuale e analisi volumetrica dei ventricoli mediante software di elaborazione delle immagini.
- Immunohistochimica e saggi citochinici per valutare l'infiammazione e l'attivazione degli astrociti.
Risultati principali
- L'iniezione di emoglobina ha indotto una ventricolomegalia moderata a 24 e 72 ore dall'iniezione rispetto ai controlli.
- A 38 giorni dall'iniezione, il 44% dei ratti trattati con emoglobina presentava ancora ventricolomegalia non risolta.
- È stata osservata una riduzione significativa del volume della sostanza bianca negli animali trattati con emoglobina dopo 38 giorni.
- L'emoglobina ha innescato una risposta infiammatoria robusta, caratterizzata da un aumento del TNF-alfa e da una maggiore attivazione degli astrociti.
Conclusioni
- Questo modello replica in modo affidabile le caratteristiche principali della PHH indotta da IVH, inclusi idrocefalo, danno alla sostanza bianca e infiammazione.
- Il protocollo è semplice, riproducibile e consente uno studio preciso della patologia mediata dall'emoglobina.
- Fornisce una piattaforma preziosa per indagare la patofisiologia della IVH e valutare potenziali interventi terapeutici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una modellizzazione affidabile dell'emorragia intraventricolare neonatale (IVH) e dell'idrocefalo post-emorragico (PHH) è fondamentale per la neuroscienza traslazionale e la scoperta di neuroterapie. Questo modello su ratto basato sull'emoglobina permette un'analisi precisa dei meccanismi di danno mediati dall'emoglobina, sostenendo una previsione affidabile nella validazione precoce dei bersagli e nella selezione terapeutica. L'approccio affronta un punto critico per ridurre i rischi nei portafogli farmaceutici per lo sviluppo neurologico mirati al danno cerebrale e all'idrocefalo indotti da IVH.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette di ridurre i rischi meccanicistici legati al coinvolgimento dell'emoglobina e delle vie del ferro nella patologia dell'IVH.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi per le vie della neuroinfiammazione e del danno alla sostanza bianca.
- Facilita la valutazione basata su ipotesi di interventi neuroprotettivi candidati.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema in vivo riproducibile per la valutazione quantitativa dell'ingrandimento ventricolare e della perdita della sostanza bianca.
- Standardizza letture volumetriche basate su risonanza magnetica per consentire il confronto tra studi.
- Permette uno screening accurato di agenti farmacologici mirati ai meccanismi di danno indotti da IVH.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a endpoint rilevanti per la malattia, come l'idrocefalo e la neuroinfiammazione osservati nella PHH clinica.
- Permette una continuità dalla scoperta dei meccanismi alla valutazione preclinica dell'efficacia dei neurofarmaci.
- Facilita lo sviluppo di biomarcatori per studi traslazionali sul danno cerebrale neonatale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica dei disturbi dello sviluppo neurologico, collegando gli studi meccanicistici alla valutazione di potenziali terapie.
- Biologia della scoperta: Permette la verifica di ipotesi relative al danno mediato dall'emoglobina e ai percorsi infiammatori nel danno cerebrale neonatale.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi di risonanza magnetica e dati istologici per la valutazione dei composti.
- Analisi: Offre misurazioni volumetriche e dei citochine per confrontare gli effetti delle interazioni tra diversi gruppi.
- Ricerca traslazionale: Allinea i risultati preclinici con le caratteristiche cliniche dell'ipertensione intracranica post-emorragica (PHH), supportando la selezione di biomarcatori e endpoint.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma scalabile e riproducibile per lo sviluppo continuo di pipeline di neuroterapie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico per IVH e PHH.
- Valore operativo: Standardizza la modellizzazione animale e la quantificazione mediante risonanza magnetica per ottenere risultati riproducibili.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione per candidati farmaci neuroprotettivi e antinfiammatori.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei programmi terapeutici rivolti alle lesioni cerebrali neonatali adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle iniezioni stereotassiche e nella manipolazione di animali neonati.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per l'immagine mediante risonanza magnetica e l'analisi delle immagini per la quantificazione volumetrica.
- Richiede una rigorosa standardizzazione delle coordinate e dei volumi di iniezione per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a ulteriori studi con traccianti del liquido cerebrospinale per approfondire le conoscenze sui meccanismi coinvolti.
- Limitato alla modellizzazione del danno mediato dall'emoglobina; potrebbe non riprodurre tutte le eziologie dell'emorragia intraventricolare (IVH).
