Tecnica di frazionamento quantitativo dei microtubuli per separare microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera nei tessuti di topo
17 novembre 2023
I microtubuli, che sono polimeri di tubulina, svolgono un ruolo cruciale come componente del citoscheletro nelle cellule eucariotiche e sono noti per la loro instabilità dinamica. Questo studio ha sviluppato un metodo per frazionare i microtubuli per separarli in microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera per valutare la stabilità dei microtubuli in vari tessuti di topo.
Il nostro nuovo protocollo aiuta a distinguere e quantificare tre stati degli anelli tubolari, come i microtubuli stabili, i microtubuli labili e i tubuli liberi nei tessuti animali. Questa tecnica è composta da semplici passaggi e può valutare la stabilità strutturale del tubo, che non può essere rilevata dalla quantificazione della modifica post-traduzionale del tubo. Questo metodo è essenziale per la ricerca e lo sviluppo di metodi terapeutici per le malattie in cui la stabilità dei microtubuli è fondamentale, come il morbo di Alzheimer e i tumori.
Iniziare la procedura preparando l'abbigliamento da laboratorio per la dissezione dei tessuti. Riempi una scatola con ghiaccio tritato e posizionaci sopra due piastre di Petri. Riempire un piatto con soluzione tampone fosfato ghiacciata o PBS per il lavaggio transitorio e la conservazione dei tessuti sezionati.
Adagiare la carta da filtro inumidita con PBS sul secondo piatto. Successivamente, pesare le microprovette da 1,5 millilitri riempite con PBS per la conservazione dei tessuti dissezionati. Dopo aver estratto i tessuti da un topo sottoposto a eutanasia, trasferirli nelle provette e pesare nuovamente ogni microprovetta.
Spostare i tessuti in un omogeneizzatore di vetro con tampone stabilizzante dei microtubuli ghiacciato o MSB+medium e omogeneizzare immediatamente il tessuto utilizzando un omogeneizzatore refrigerato. Ora trasferisci l'omogenato tissutale in una microprovetta da due millilitri utilizzando una pipetta Pasteur e centrifuga a 2.400 G per tre minuti a due gradi Celsius. Trasferire il surnatante in un nuovo microtubo da 1,5 millilitri per rimuovere i detriti.
Vorticare il surnatante o la frazione S1 in un nuovo microtubo da 1,5 millilitri. Pipettare immediatamente 200 microlitri della frazione S1 in una microprovetta di centrifugazione e centrifugare a 100.000 G utilizzando un rotore TLA-55 per 20 minuti a due gradi Celsius. Dopo la seconda centrifugazione, separare il surnatante S2 dal precipitato P2.
Trasferire immediatamente l'intera quantità della frazione S2 in una microprovetta di centrifugazione e utilizzare un rotore TLA-120.2 per farla girare a 500.000 G per 60 minuti a due gradi Celsius. Dopo la terza centrifugazione, separare il surnatante S3 dal precipitato P3. Sciogliere l'intera frazione S3 in 200 microlitri di 2X sodio dodecil solfato o tampone campione SDS.
Miscelare le restanti frazioni S1 con un volume uguale di tampone campione SDS 2X da utilizzare come curva standard per il western blotting. Successivamente, aggiungere 400 microlitri di tampone per campioni SDS alle provette della frazione P2 e P3. Quindi, sonicare brevemente la soluzione per sciogliere il precipitato prima di trasferire i campioni in nuove microprovette da 1,5 millilitri e posizionarle nella ghiacciaia.
Far bollire tutti i campioni a 100 gradi Celsius per tre minuti. I microtubuli nella frazione P2 rappresentavano il 34,86% dell'alfa-tubulina totale nel cervello di un topo, mentre quelli nelle frazioni P3 e S3 rappresentavano rispettivamente il 56,13% e il 9,01%. La percentuale di beta-3 tubulina nelle frazioni P2, P3 e S3 non era significativamente diversa da quella dell'alfa-tubulina.
La frazione S2 ha mostrato un passaggio limitato di tubulina attraverso una colonna di spin di ultrafiltrazione da 300 kilodalton, mentre la frazione S3 ha permesso il passaggio completo dei complessi di tubulina. La separazione cromatografica ha portato a un'eluizione di 100 kilodalton di tubulina S3. Proporzioni uguali di alfa e beta-tubulina sono state recuperate in ciascuna frazione.
Le frazioni P2 sono state significativamente arricchite con alfa-tubulina acetilata, mentre l'alfa-tubulina tirosinata era dominante nella frazione P3. Il congelamento del cervello prima dell'omogeneizzazione ha provocato una diminuzione della concentrazione di alfa-tubulina nelle frazioni P2. Tuttavia, l'alfa-tubulina è aumentata nella frazione P3.
Il congelamento ha anche diminuito i livelli di acetilazione e aumentato i livelli di tirosinazione dell'alfa-tubulina nella frazione P2. Il trattamento con nocodazolo ha ridotto l'alfa-tubulina nella frazione P2. A differenza del congelamento, il nocodazolo non ha influenzato le modificazioni post-traduzionali della tubulina P2.
Il tessuto cerebrale ha mostrato una concentrazione significativamente più elevata di tubuline P2, mentre le tubuline P3 erano concentrate nel tessuto proliferativo. Il Western blotting ha mostrato che la tubulina P2 specificamente presente nel sistema nervoso ha avuto origine da microtubuli stabili e la tubulina P3 ha avuto origine da microtubuli labili. La stabilità dei microtubuli è altamente dinamica.
È importante completare questo protocollo rapidamente, senza interruzioni, in un ambiente a basse temperature. Assicurarsi inoltre che i tessuti e le frazioni non siano stati congelati fino a quando non sono stati sciolti nel tampone del campione SDS. La combinazione della presentazione immunitaria utilizzando ciascuna frazione con la proteomica dovrebbe identificare i fattori coinvolti nella dinamica dei microtubuli.
Usando questo metodo, abbiamo rivelato come la tau normale esista sui microtubuli. Può anche essere utilizzato per studiare come diventa anormale nei cervelli invecchiati al fine di identificare nuovi bersagli farmacologici della demenza.
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Panoramica
Questo studio presenta un nuovo protocollo per distinguere e quantificare microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera nei tessuti animali. Il metodo valuta la stabilità strutturale dei microtubuli, aspetto fondamentale per comprendere malattie come l'Alzheimer e i tumori.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Dinamica dei microtubuli
Sfondo
- I microtubuli sono componenti essenziali del citoscheletro nelle cellule eucariotiche.
- Essi mostrano instabilità dinamica, influenzando le funzioni cellulari.
- Comprendere la stabilità dei microtubuli è fondamentale per lo sviluppo di terapie.
- Malattie come l'Alzheimer e alcuni tipi di cancro sono associate a disfunzioni dei microtubuli.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la frazionatura dei microtubuli nei tessuti di topo.
- Valutare la stabilità di diversi stati dei microtubuli.
- Migliorare la comprensione delle malattie correlate ai microtubuli.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dell'abbigliamento da laboratorio per la dissezione dei tessuti.
- Utilizzo di soluzione tampone fosfato fredda per la manipolazione dei tessuti.
- Frazionamento dei microtubuli in tubulina stabile, labile e libera.
- Quantificazione della stabilità dei microtubuli mediante il nuovo protocollo.
Risultati principali
- Il protocollo distingue efficacemente tra microtubuli stabili e labili.
- La quantificazione fornisce informazioni sulla stabilità dei microtubuli in diversi tessuti.
- Il metodo è semplice e riproducibile per l'uso in laboratorio.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della dinamica dei microtubuli in contesti patologici.
Conclusioni
- Questo nuovo protocollo rappresenta uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la stabilità dei microtubuli.
- Presenta potenziali applicazioni nella comprensione e nel trattamento di malattie associate a disfunzioni dei microtubuli.
- Ulteriori ricerche possono basarsi su questi risultati per esplorare nuove vie terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione accurata della stabilità dei microtubuli è essenziale per analizzare i meccanismi terapeutici nelle malattie neurodegenerative e nei tumori in cui la dinamica del citoscheletro influenza la risposta ai farmaci. Questa tecnica di frazionamento consente la quantificazione diretta dei pool di tubulina stabile, labile e libera in tessuti nativi, fornendo un'analisi biochimica che integra esami di imaging e saggi specifici per le modificazioni. Risolvendo gli stati funzionali dei microtubuli, il metodo supporta la validazione degli bersagli e la riduzione del rischio meccanicistico nei programmi precoci di scoperta incentrati su agenti modulatori dei microtubuli.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando le variazioni nelle popolazioni di microtubuli stabili rispetto a quelli labili in risposta al trattamento con un composto.
- Valore operativo: Fornisce un saggio biochimico su tessuto per convalidare l'interazione con l'obiettivo di agenti stabilizzanti o destabilizzanti i microtubuli.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafoglio correlando la stabilizzazione biochimica dei microtubuli con esiti funzionali in sistemi pertinenti alla malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera dati quantitativi di frazionamento della tubulina adatti a schermate ad alto contenuto di librerie di composti mirati alla dinamica dei microtubuli.
- Riproducibilità: Utilizza passaggi standardizzati di ultracentrifugazione per ottenere una separazione costante delle frazioni di microtubuli tra diversi esperimenti.
- Scalabilità: Compatibile con analisi mediante western blot e approfondimenti proteomici per identificare regolatori della stabilità dei microtubuli a partire da pool di tubulina frazionata.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Rileva variazioni tissuto-specifiche nella stabilità dei microtubuli correlate alla capacità proliferativa, consentendo la stratificazione di modelli preclinici.
- Continuità Traduzione: Collega gli stati biochimici dei microtubuli ai profili di modifiche post-traduzionali (ad esempio, acetilazione nei microtubuli stabili, tirosinazione in quelli labili) per allineare i biomarcatori.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione fornendo metriche quantitative di stabilità in grado di prevedere l'indice terapeutico nei programmi mirati ai microtubuli.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in cui la stabilità dei microtubuli funge da biomarcatore farmacodinamico per la conferma del meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando gli spostamenti indotti dai composti negli stati di polimerizzazione dei microtubuli in lisati di tessuti nativi.
- Screening: Permette la standardizzazione del saggio attraverso soglie definite di sedimentazione (100.000 × g per microtubuli stabili, 500.000 × g per microtubuli labili) per garantire una frazionamento riproducibile.
- Analisi: Produce letture quantitative della tubulina mediante western blot delle frazioni P2 (stabile), P3 (labile) e S3 (tubulina libera) per confrontare gli effetti dei composti.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati di frazionamento dei microtubuli ai profili di espressione e di modificazione specifici per tessuto, per la validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma biochimica riutilizzabile per valutare composti mirati ai microtubuli in diversi ambiti patologici e tipi di tessuto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica misurando direttamente gli stati di polimerizzazione dei microtubuli, anziché basarsi esclusivamente sulle modifiche post-traduzionali.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso parametri standardizzati di centrifugazione e un processo controllato per temperatura al fine di preservare l'integrità dei microtubuli.
- Valore strategico: Migliora la sicurezza delle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo una validazione ortogonale del meccanismo d'azione sui microtubuli, oltre ai saggi cellulari.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base all'efficacia quantitativa di stabilizzazione nei tessuti rilevanti per la malattia, corretta per il rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di omogeneizzazione dei tessuti e di ultracentrifugazione per mantenere la stabilità dei microtubuli durante il processo.
- Dipende dall'accesso a rotori ad alta velocità (TLA-55 e TLA-120.2) in grado di raggiungere 100.000 × g e 500.000 × g per la separazione delle frazioni.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i tempi e le temperature di frazionamento, al fine di garantire risultati coerenti tra diversi laboratori.
- Richiede l'adattamento della composizione dei tamponi e dei parametri di centrifugazione quando il metodo viene applicato a tessuti non neurali con diverse densità di microtubuli.
- È limitato dalla necessità di un'elaborazione immediata per prevenire la depolimerizzazione artifattuale dei microtubuli durante la manipolazione del campione.
