Biotest di applicazione topica per quantificare la tossicità degli insetticidi per zanzare e moscerini della frutta

Applicando direttamente l'insetticida sull'insetto piuttosto che attraverso il contatto superficiale, c'è una variazione minima nell'esposizione agli insetticidi e questo ci consente di misurare il profilo di suscettibilità delle popolazioni di zanzare in modo più accurato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di calcolare le dosi letali relativizzate in massa di un insetticida piuttosto che le concentrazioni letali, il che migliora notevolmente i confronti del rapporto di resistenza. Fare attenzione a conservare correttamente gli insetticidi, evitare di contaminare gli strumenti e assicurarsi che le parti della siringa siano in buone condizioni.

Questo ti aiuterà a ottenere risultati coerenti. Per iniziare, rimuovere le soluzioni insetticide necessarie dal congelatore. Ruotare immediatamente la soluzione o invertire cinque volte e metterla in un contenitore resistente alla luce a temperatura ambiente per lasciare che gli insetticidi si scaldino a temperatura ambiente prima dell'uso.

Disporre cinque tubi di microcentrifuga con 0,5 millilitri di acetone ciascuno. Riempire completamente la canna della siringa con acetone dal primo tubo. Quindi espellere l'acetone in un contenitore di rifiuti spingendo rapidamente verso il basso sullo stantuffo e ripetere altre quattro volte per completare un totale di cinque lavaggi di acetone dalla stessa aliquota di acetone.

Quindi, riempire completamente il barile della siringa con aria ed espellere l'aria e i potenziali resti di acetone nel contenitore dei rifiuti. Ripeti altre due volte per completare tre lavaggi con l'aria. Creare una sacca d'aria all'interno della canna tra lo stantuffo della siringa e la parte superiore dell'ago tirando su lo stantuffo di circa cinque millimetri nella canna.

Etichettare i bicchieri di plastica con l'ID casuale per la valutazione della mortalità cieca. Utilizzando un aspiratore alimentato dall'aspirazione dall'inalazione, aspirare il numero desiderato di zanzare adulte da tre a cinque giorni. Posizionare la punta dell'aspiratore nel tubo con il cotone avvolto attorno alla punta.

Espirare delicatamente e toccare l'aspiratore per trasferire le zanzare in un tubo conico. Utilizzare il cotone per collegare il tubo quando viene rimossa la punta dell'aspiratore, quindi chiudere con il coperchio. Abbattere brevemente le zanzare nei tubi mettendole per un minimo di 10 minuti a quattro gradi Celsius o seppellendole sotto il ghiaccio in un vassoio di ghiaccio.

Trasferisci le zanzare abbattute nella tenda per la gestione degli insetti. Punta con attenzione le zanzare su un vassoio di plastica posto sul ghiaccio e versa circa 50 zanzare alla volta per assicurarti che ognuna tocchi il vassoio fresco sotto di esso e rimanga abbattuta. Ordina le zanzare per sesso raccogliendole delicatamente per le gambe o le ali con una pinza, seguita dal posizionamento di ogni sesso in una tazza separata e fermati quando viene raggiunto il numero desiderato.

Durante lo smistamento, rimuovere eventuali zanzare che sono ferite o sono extra grandi o piccole. Per registrare il peso della tazza di zanzara, posizionare una tazza vuota con una capsula di Petri come coperchio sulla bilancia e tarare la bilancia. Versare le zanzare nel contenitore e posizionare il coperchio sopra.

Posiziona il contenitore sulla bilancia e registra il peso finale, insieme al numero di zanzare. Riposizionare immediatamente la tazza di campioni sul ghiaccio per tenerli immobilizzati fino a quando tutte le tazze del campione non vengono pesate. Dividere le zanzare preparate in cinque a 10 tazze separate poste sul ghiaccio, etichettate con ID casuali.

Usa una pinzetta e un contatore portatile per ottenere da 20 a 25 zanzare per tazza. Per ordinare i moscerini della frutta, anestetizzare le mosche usando anidride carbonica per sette secondi. Versare le mosche su un impacco di ghiaccio avvolto in carta da banco.

Usando un pennello a punta fine, separare e contare i maschi e le femmine. Usa il pennello per raccogliere delicatamente le mosche scelte e metterle in una bottiglia pulita e vuota. Dopo aver scelto lo stesso numero di moscerini della frutta maschi e femmine, etichettare le bottiglie stock con il nome del ceppo e il totale del moscerino della frutta.

Anestetizzare la bottiglia di moscerini della frutta usando l'anidride carbonica per sette secondi. Versare i moscerini della frutta sulla carta pesata e utilizzare la carta come imbuto per introdurre le mosche in una fiala tarata etichettata con un ID casuale.Dopo aver posizionato il coperchio della capsula di Petri sopra la fiala dei moscerini della frutta, posizionarlo sulla bilancia. Registrare il peso combinato e il numero di campioni sul foglio di punteggio.

Posizionare immediatamente la fiala di moscerini della frutta in un vassoio di ghiaccio con il coperchio ancora in cima per evitare che le mosche fuoriescano. Caricare la siringa con la giusta concentrazione di insetticida, iniziando con la dose meno concentrata e lavorare verso la dose più concentrata con ciascun gruppo di organismi. Rovesciare i campioni su carta pesata posta in cima a un vassoio sul ghiaccio.

Separare i campioni che sono vicini tra loro utilizzando un pennello pulito privo di insetticidi o un batuffolo di cotone per consentire un facile accesso a ciascun campione per il dosaggio. Usando la siringa, applicare una goccia di soluzione insetticida sul torace ventrale e sull'area dell'addome per le zanzare e il dorso per i moscerini della frutta. Versare immediatamente i campioni nel bicchiere di plastica etichettato.

Coprire la tazza con una rete e un elastico. Nota un conteggio aggiornato del campione sulla tazza se alcuni esemplari sono stati uccisi, danneggiati o fuggiti in questo processo. Posizionare la tazza completata in un vassoio di contenimento.

Per la prima tazza, registrare il tempo in cui il dosaggio è completato. Ripetere il dosaggio per ogni tazza fino a quando tutti i campioni sono stati dosati con le concentrazioni di insetticida appropriate e registrare il tempo finale in cui tutti i campioni sono stati dosati. Fornire una soluzione di saccarosio al 10% a ogni tazza tramite un batuffolo di cotone bagnato e conservare le zanzare e i moscerini della frutta alla temperatura e all'umidità desiderate.

Registrare la mortalità del campione a 24 ore dopo l'inizio dell'esposizione agli insetticidi. Classificare le zanzare come vive se possono volare e tenersi in posizione eretta e morta se sono immobili o atassiche, come descritto dall'OMS. Seguire la stessa valutazione della mortalità per i moscerini della frutta.

Dopo aver eseguito il biotest, sono stati ottenuti dati dose-risposta con due ceppi che sono il genotipo Rockefeller e IICC per il maschio e la femmina Aedes aegypti. La dose letale mediana relativizzata di massa per Rockefeller e IICC era rispettivamente di 0,008 e 0,336 nanogrammi per milligrammo. I risultati non hanno rivelato differenze tra le curve di risposta alla dose delle zanzare femmine e maschi all'interno di ciascun ceppo.

Pertanto, i dati di entrambi i sessi sono stati combinati per calcolare i valori mediani della dose letale. Poiché gli intervalli di confidenza del 95% per la dose letale mediana di questi due ceppi non si sovrapponevano, questi valori sono stati considerati significativamente diversi. Inoltre, nel calcolare i rapporti di resistenza, il ceppo IICC era oltre 40 volte più resistente del ceppo Rockefeller suscettibile.

Sono stati ottenuti anche i dati di risposta alla dose per il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, ceppo Canton-S, e la dose letale mediana relativizzata di massa è risultata essere di 0,213 nanogrammi per milligrammo. La coerenza è fondamentale, specialmente quando si conserva e si applica l'insetticida e si valuta la mortalità. Inoltre, fare attenzione quando si maneggia il campione per evitare danni o morte non indotti dall'insetticida.

Con questo metodo, ora possiamo determinare con precisione la resistenza tecnica di una popolazione di zanzare e come le condizioni ambientali influiscono sulla resistenza o come la resistenza tecnica predice la resistenza pratica.