Un metodo passo-passo per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro l'AAV utilizzando un test colorimetrico basato su cellule

Gli anticorpi preesistenti che neutralizzano l'AAV rappresentano una barriera al progresso delle terapie geniche AAV. Questo test è uno strumento di screening per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro l'AAV. Il vantaggio principale è che è conveniente, efficiente in termini di tempo, facile da configurare e richiede competenze tecniche minime, attrezzature di laboratorio e reagenti.

Iniziare a placcare le cellule HT1080 il primo giorno diluendo le cellule ad una concentrazione di 1 x 10 alla quinta cella per millilitro in mezzi DMEM completi preriscaldati. Quindi seminare 100 microlitri di cellule per pozzo in piastre chiare a fondo piatto a 96 pozzetti alla concentrazione di 1 x 10 alle quarte cellule per pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte per 16-22 ore.

Il secondo giorno, generare diluizioni seriali dei campioni di siero di interesse in tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri utilizzando DMEM completo preriscaldato. A ciascun tubo con campioni di siero diluiti, aggiungere 66 microlitri del 7,5x10 alla soluzione funzionante a sei genomi virali per microlitro. Mescolare la diluizione del siero del virus mediante pipettaggio e quindi posizionare i tubi contenenti le miscele di siero del virus in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 30 minuti per consentire la potenziale neutralizzazione.

Dopo 30 minuti, pipettare 100 microlitri della miscela di siero del virus per ogni pozzetto sulla piastra a 96 pozzetti contenente 1x10 alle quarte cellule per pozzetto, quindi avvolgere la piastra in un foglio da posizionare in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte per 16-24 ore. Il terzo giorno, aspirare il fluido dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti usando un aspirapolvere con cappa aspirante senza interrompere le celle aderenti e aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 4% a ciascun pozzo. Dopo aver avvolto la piastra in un foglio, lasciarla per 10 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, lavare e aspirare le celle due volte con 200 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Dopo il secondo lavaggio, pipettare 200 microlitri di PBS preriscaldato in ciascun pozzetto e avvolgere la piastra in un foglio seguito da incubazione a 65 gradi Celsius per 90 minuti per denaturare l'attività endogena della fosfatasi alcalina, dopo l'incubazione a 50 microlitri del BCIP/NBT disciolto appena preparato in ciascun pozzetto e incubare le piastre avvolte a temperatura ambiente per due o 24 ore. Successivamente, scatta foto di ciascun pozzo utilizzando un obiettivo 4X in una fotocamera con microscopio ottico, garantendo l'uso coerente della stessa esposizione, bilanciamento del bianco e impostazioni della luce per tutti i test.

Per analizzare l'immagine in ImageJ, selezionare il file e fare clic su Apri. Per le immagini colorate, convertitele in scala di grigi selezionando le schede Immagine, Tipo e 8 bit in ordine. Quindi vai alla scheda Immagine e seleziona Regola e Soglia per modificare la soglia fino a quando tutte le aree colorate sono colorate e rosse ma lo sfondo non lo è.

fare clic su Analizza e imposta misurazioni e selezionare le caselle di controllo per Area, Frazione di area, Limite alla soglia e Visualizza etichetta prima di premere OK.To determinare la lettura del segnale di un determinato pozzo, fare clic su Analizza e misura in modo che la colonna dell'area percentuale della finestra popup visualizzi la lettura del segnale. Lo studio ha stabilito il dosaggio virale ottimale aggiungendo il gene reporter AAV6-hPLAP nelle cellule a una gamma di concentrazioni del genoma virale. Una molteplicità di infezioni di 15.000 ha conferito una colorazione della piastra del 36% ed è stata selezionata come dosaggio virale ottimale.

L'analisi rappresentativa mostra la correlazione tra colorazione e molteplicità di infezione. È stata ottenuta la più alta concentrazione testata che non ha influenzato la correlazione lineare tra colorazione e concentrazione virale. Lo studio dell'attività neutralizzante su un anticorpo monoclonale anti-AAV6 contro il virus adeno-associato o AAV6 alla diluizione log 10 ha mostrato un'inibizione del 50% della trasduzione AAV6 o TI50 ad una concentrazione di 10 nanogrammi per millilitro.

Nel test dell'anticorpo neutralizzante o NAb, il grado di neutralizzazione AAV variava all'interno della popolazione campione naïve con valori di titolo TI50 compresi tra 1/2 e 1/80. I risultati del test hanno indicato che i valori del titolo TI50 di inibizione AAV prima della somministrazione di AAV variavano da 1/4 a 1/80. Dopo la somministrazione di AAV, il titolo TI50 è aumentato tra 1/2000 e superiore a 1/32.000, dimostrando un chiaro contrasto nei valori di titolo tra la somministrazione pre e post-AAV.

Quando si scattano foto dei pozzetti, è importante utilizzare costantemente le stesse impostazioni del microscopio durante il test e assicurarsi anche che le foto siano scattate direttamente al centro dei pozzetti.