Name: Förster Resonance Energy Transfer Mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Scopri la metodologia FRET mapping per identificare siti di legame ligando e cambiamenti conformazionali nelle proteine. Questa tecnica in soluzione permette di studiare le dinamiche biomolecolari con precisione.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione R15GM135904 del National Institutes of Health (assegnata all'IM) e dalla sovvenzione GM110552 del National Institutes of Health (assegnata al DBO).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Attraverso l'uso della metodologia di mappatura FRET, abbiamo identificato il sito di legame della sequenza di segnale sulla proteina SecA. È importante sottolineare che la presenza di una struttura cristallina 3D del complesso ha notevolmente facilitato il nostro studio. La forza di questa metodologia di mappatura risiede nella capacità di utilizzare una struttura esistente per identificare le posizioni per l'etichettatura. Questa metodologia non può essere utilizzata per determinare una struttura 3D; tuttavia, la deter...

Per le proteine, la delucidazione della dinamica insieme alla conoscenza strutturale tridimensionale (3-D) porta a una migliore comprensione delle relazioni struttura-funzione dei sistemi biomolecolari. I metodi strutturali, come la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica criogenica, catturano una struttura statica e spesso richiedono la determinazione di più strutture per chiarire gli aspetti del legame e della dinamica delle biomolecole1. In questo articolo viene descritto un metodo basato su soluzione per la mappatura di elementi strutturali globali, ad esempio siti di associazione o interazioni di associazione, potenzialmente più transitori e meno facilmente acquisibili con metodi statici. I sistemi candidati forti per questa metodologia sono quelli in cui una struttura 3D è stata precedentemente determinata mediante cristallografia a raggi X, spettroscopia NMR o altri metodi strutturali. In questo caso, sfruttiamo la struttura cristallina a raggi X del complesso SecA-SecYEG, un attore centrale nella via secretoria generale della proteina, per mappare la posizione di un sito di legame peptidico del segnale utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) prima del trasporto della preproteina attraverso la membrana2. La manipolazione del sistema biologico attraverso modificazioni genetiche unita alla nostra conoscenza della struttura 3D ha permesso la determinazione della conformazione della sequenza del segnale e della regione precoce matura immediatamente prima dell'inserimento nel canale 3.
FRET comporta il trasferimento di energia senza radiazioni da una molecola (donatore) a un'altra (accettore) in modo dipendente dalla distanza che è attraverso lo spazio 4,5. L'efficienza di questo trasferimento viene monitorata attraverso una diminuzione del donatore o un aumento dell'intensità di fluorescenza dell'accettore. L'efficienza del trasferimento di energia può essere descritta come
E = R06/(R06 + R6)
in cui il valore R0 è la distanza alla quale il trasferimento è efficiente al 50%6. La tecnica è stata precedentemente descritta come un righello molecolare ed è efficace nel determinare distanze nell'intervallo 2,5-12 nm, a seconda dell'identità dei coloranti donatore-accettore 4,7,8,9. Le intensità di fluorescenza del donatore e la durata di vita con o senza accettore consentono di determinare le efficienze di trasferimento e, di conseguenza, le distanze 5,8. A causa della disponibilità della tecnologia, della sensibilità del metodo e della facilità d'uso, FRET ha anche trovato ampia applicazione in settori come la spettroscopia di fluorescenza a singola molecola e la microscopia confocale6. L'avvento di proteine fluorescenti come la proteina fluorescente verde ha reso l'osservazione della dinamica intracellulare e l'imaging delle cellule vive relativamente facile10,11. Molte applicazioni FRET come queste sono discusse in dettaglio in questo numero virtuale.
In questo studio, ci concentriamo in particolare sull'uso delle misurazioni FRET per produrre valori di distanza per determinare i dettagli strutturali. In precedenza, le misurazioni FRET sono state efficacemente utilizzate per determinare la conformazione delle molecole di DNA quando legate alla proteina 12,13,14, la dinamica interna delle proteine e le interazioni di legame proteico 15,16,17. I vantaggi di questo metodo risiedono nella capacità di determinare elementi strutturali flessibili e dinamici in una soluzione con quantità relativamente basse di materiale. Significativamente, questo metodo è particolarmente efficace se utilizzato in combinazione con le informazioni strutturali esistenti e non può essere utilizzato come mezzo di determinazione della struttura 3D. Il metodo fornisce la migliore comprensione e perfezionamento della struttura se il lavoro si basa su informazioni strutturali esistenti spesso accoppiate con la simulazione computazionale18,19. Qui, l'uso di distanze ottenute da misure FRET allo stato stazionario e risolte nel tempo è descritto per mappare un sito di legame, la cui posizione non era nota, su una struttura cristallografica esistente del complesso SecA-SecYEG, le principali proteine nella via secretoria generale3.
La via secretoria generale, un sistema altamente conservato dai procarioti agli eucarioti agli archaea, media il trasporto delle proteine attraverso o nella membrana fino alla loro posizione funzionale nella cellula. Per i batteri Gram-negativi, come E. coli, l'organismo utilizzato nel nostro studio, le proteine vengono inserite o traslocate attraverso la membrana interna al periplasma. Il complesso di canali SecY batterici (chiamato translocon) si coordina con altre proteine per traslocare la proteina appena sintetizzata, che viene diretta alla sua posizione corretta nella cellula attraverso una sequenza di segnali tipicamente situata al N-terminus20,21. Per le proteine legate al periplasma, la proteina ATPasi SecA si associa al tunnel di uscita del ribosoma e alla preproteina dopo che circa 100 residui sono stati tradotti22. Insieme alla proteina chaperone SecB, mantiene la preproteina in uno stato spiegato. SecA si lega al translocon SecYEG e, attraverso molti cicli di idrolisi dell'ATP, facilita il trasporto delle proteine attraverso la membrana23,24.
SecA è una proteina multi-dominio che esiste in forme citosoliche e legate alla membrana. Una proteina omodimerica nel citosol, SecA è costituita da un dominio di legame preproteico o cross-linking25, due domini leganti nucleotidi, un dominio alare elicoidale, un dominio elicoidale scaffold e il dito a due eliche (THF) 26,27,28,29 (Figura 1). In precedenti studi cristallografici del complesso SecA-SecYEG, la posizione del THF suggeriva che fosse attivamente coinvolto nella traslocazione delle proteine e nei successivi esperimenti di cross-linking con il peptide segnale ha ulteriormente stabilito il significato di questa regione nella traslocazione proteica30,31. Studi precedenti, utilizzando la metodologia di mappatura FRET, hanno dimostrato che i peptidi di segnale esogeni si legano a questa regione di SecA 2,32. Per comprendere appieno la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione precoce matura della preproteina prima dell'inserimento nel canale SecYEG, è stata creata una chimera proteica in cui la sequenza del segnale e i residui della regione della prima maturità sono stati attaccati alla SecA attraverso un linker Ser-Gly (Figura 1). Usando questo costrutto biologicamente vitale, è stato ulteriormente dimostrato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina si legano al THF in modo parallelo2. Successivamente, la metodologia di mappatura FRET è stata utilizzata per chiarire la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione di maturazione precoce in presenza di SecYEG come descritto di seguito3.
La conoscenza della struttura 3D del complesso SecA-SecYEG 33,34,35 e la possibile posizione del sito di legame ci hanno permesso di posizionare giudiziosamente le etichette donatore-accettore in luoghi in cui l'intersezione delle singole distanze FRET identifica la posizione del sito di legame. Queste misurazioni della mappatura FRET hanno rivelato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina formano una forcina con la punta situata alla bocca del canale SecYEG, dimostrando che la struttura della forcina è modellata prima dell'inserimento del canale.

<table><tbody><tr><td>490 nm LED laser</td><td>Horiba</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A10254</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10904</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10906</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra&shy; 4 Filtro centrifugo (50kDa MWCO)</td><td>Sigma</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilmaltoside (DDM)</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>E. coli peptide del segnale della fosfatasi alcalina SP22</td><td>Biomolecole Midwest</td><td>N/A</td><td>Sintetizzato oggetto personalizzato</td></tr><tr><td>peptide del segnale esteso SP41</td><td>Biomolecole Midwest</td><td>N/A</td><td>Sintetizzato oggetto personalizzato</td></tr><tr><td>FluorEssence</td>Programma di acquisizione spettrale <td>Horiba</td><td>versione 2.4</td><td>per spettrofluorimetro Fluoromax4</td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro Fluoromax 4</td><td>Horiba</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td><td></td><td>programma di analisi spettrale per decadimenti risolti nel tempo</td></tr><tr><td>H&shy; 4&timido; Azido&timido; Phe&shy; OH</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Miller) Brodo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 silice colloidale (40% in peso di sospensione in H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420816</td><td>diluizione è necessaria per creare una soluzione di diffusione adeguata</td></tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>Horiba</td><td>versione 4.1.0.4096</td><td>programma di acquisizione spettrale per PTI Time Master Instrument</td></tr><tr><td>PTI Time Master Strumento</td><td>Horiba</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol Programma di Grafica Molecolare</td><td>Schrödinger</td><td>versione 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

förster resonance energy transfer mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un metodo consolidato basato sulla fluorescenza utilizzato per misurare con successo le distanze all'interno e tra le biomolecole in vitro e all'interno delle cellule. In FRET, l'efficienza del trasferimento di energia, misurata dalle variazioni dell'intensità di fluorescenza o della durata, si riferisce alla distanza tra due molecole o etichette fluorescenti. Determinazione della dinamica e cambiamenti conformazionali dalle distanze sono solo alcuni esempi di applicazioni di questo metodo ai sistemi biologici. In determinate condizioni, questa metodologia può aggiungere e migliorare le strutture cristalline a raggi X esistenti fornendo informazioni riguardanti la dinamica, la flessibilità e l'adattamento alle superfici di legame. Descriviamo l'uso di FRET e le determinazioni della distanza associate per chiarire le proprietà strutturali, attraverso l'identificazione di un sito di legame o gli orientamenti delle subunità dimeri. Attraverso una scelta giudiziosa dei siti di etichettatura e spesso l'impiego di più strategie di etichettatura, abbiamo applicato con successo questi metodi di mappatura per determinare le proprietà strutturali globali in un complesso proteina-DNA e il sistema di traslocazione proteica SecA-SecYEG. Nel sistema SecA-SecYEG, abbiamo utilizzato metodi di mappatura FRET per identificare il sito di legame preproteico e determinare la conformazione locale della regione della sequenza del segnale legato. Questo studio delinea i passaggi per l'esecuzione di studi di mappatura FRET, tra cui l'identificazione di siti di etichettatura appropriati, la discussione di possibili etichette tra cui residui di amminoacidi non nativi, procedure di etichettatura, come eseguire misurazioni e interpretare i dati.

Questo studio si è concentrato sulla determinazione della posizione del sito di legame preproteico su SecA prima dell'inserimento della preproteina nel canale SecYEG. Per mappare il sito di legame, sono stati eseguiti esperimenti FRET tra diverse regioni della preproteina e tre posizioni distinte sulle proteine SecA e SecYEG (Figura 1A-D). Dalle distanze ottenute e dalle strutture tridimensionali di SecA, SecYEG e della preproteina, è stata prevista la posiz...

Lo studio descrive in dettaglio la metodologia della mappatura FRET, compresa la selezione dei siti di etichettatura, la scelta dei coloranti, l'acquisizione e l'analisi dei dati. Questa metodologia è efficace nel determinare i siti di legame, i cambiamenti conformazionali e i movimenti dinamici nei sistemi proteici ed è più utile se eseguita in combinazione con le informazioni strutturali 3D esistenti.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Abbiamo sviluppato una metodologia di mappatura FRET che consente l'identificazione e la caratterizzazione dei siti di legame del ligando, l'orientamento delle subunità, i cambiamenti conformazionali associati al legame del ligando e i movimenti dinamici delle proteine. Un vantaggio di questa tecnica è che può essere eseguita in soluzione e le molecole possono muoversi liberamente. Le distanze misurate con questa tecnica sono appropriate per i sistemi biologici.FRET è ampiamente applicabile a molti sistemi. La mappatura migliora il monitoraggio dei cambiamenti strutturali e dinamici in qualsiasi sistema biomolecolare ed è particolarmente efficace se esistono informazioni strutturali tridimensionali. Dopo aver purificato la proteina, la parte più difficile è etichettare con alta efficienza e rimuovere il colorante libero.Per gli esperimenti, aiuta ad avere il minor colorante libero possibile. Per iniziare, scegli i siti di etichettatura entro 25-75 angstrom dal sito di legame punitivo e in regioni relativamente statiche della proteina. La distanza determinerà la coppia di coloranti FRET specifica da utilizzare.Individuare i siti di etichettatura in regioni proteiche relativamente distinte l'una dall'altra. Quindi i siti descrivono i vertici di un triangolo, con il sito di legame punitivo situato al centro. Per misurare i valori di R0, a seconda della dimensione e del volume della cuvetta desiderati, preparare due campioni proteici alla stessa concentrazione di proteine totali.Uno con la proteina etichettata solo con il colorante del donatore e uno con la proteina etichettata solo con il colorante accettore. Accendere il fluorometro e aprire il programma di acquisizione e analisi spettrale nel software FluorEssence, se si utilizza uno spettrofluorometro. Fare clic sulla M rossa per collegare il computer allo strumento e scegliere Spettri di emissione.Immettere i parametri di scansione utilizzando la voce di menu raccogli esperimento, ad esempio la lunghezza d'onda di eccitazione, l'intervallo per la scansione delle emissioni, la temperatura e il campione cambiano posizione. Fare clic su RTC e sulle impostazioni ottimizzate dello strumento come descritto nel manoscritto, monitorando l'emissione di fluorescenza al picco utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione impostata al massimo di assorbimento del colorante. Posizionare il campione proteico etichettato dal donatore nel supporto del campione e fare clic su Esegui per generare una scansione delle emissioni della proteina etichettata solo con il colorante del donatore, emozionando il campione al massimo di assorbimento del colorante e scansionando oltre il picco di emissione.Stabilire una linea di base per la scansione estendendo la scansione a 25-50 nanometri oltre la fine del picco. Misurare la resa quantistica della sola proteina donatrice eseguendo assorbimenti e misurazioni di fluorescenza su campioni di diverse concentrazioni, come descritto nel manoscritto di testo. Preparare campioni di proteine solo donatore, solo proteine accettore e campioni proteici donatore-accettore, alla stessa concentrazione.Ottenere la scansione del donatore solo per generare spettri di emissione di fluorescenza. Eccitare la soluzione al massimo assorbimento del colorante del donatore e scansionare i picchi di emissione del donatore e dell'accettore. Scambia il campione con l'accettore solo proteina, o cambia il campione cambia la tua posizione nella cuvetta contenente solo la proteina dell'accettore.Ottenere una scansione delle emissioni della proteina etichettata solo con il colorante accettore. Eccitare il campione alla lunghezza d'onda di eccitazione del donatore. Scambia il campione con il campione di proteina donatore-accettore o cambia il campione cambia la tua posizione nella cuvetta contenente la proteina etichettata come donatore-accettore.Ottenere una scansione delle emissioni del campione proteico donatore-accettore utilizzando le stesse impostazioni. Per tutti gli spettri, correggere la fluorescenza di fondo sottraendo i conteggi di sfondo misurati alla fine della scansione. Utilizzare un programma di visualizzazione grafica 3D come PyMOL per mappare le distanze sulla struttura, inserendo direttamente i comandi dallo script nella finestra di comando con le informazioni sulla distanza appropriate.Generare una shell per ogni distanza misurata e l'errore associato. Mappare la posizione attraverso l'intersezione delle diverse conchiglie. Il sito di legame peptidico del segnale è stato mappato utilizzando tre diverse posizioni su SecA e SecYEG e quattro diverse posizioni sul peptide del segnale.Esperimenti FRET tra diverse regioni della pre-proteina e tre posizioni distinte sulle proteine SecA e SecYEG mappano il sito e l'orientamento del legame pre-proteico. Il sito di legame punitivo del peptide di segnale era precedentemente identificato come il dito a due eliche e la coda C-terminale SecA suggeriva un orientamento parallelo al dito a due eliche. Sono stati ottenuti spettri FRET allo stato stazionario tra SecA37 e PhoA2 e PhoA22.La riduzione dell'intensità del donatore ha indicato che una maggiore energia trasferita da PhoA22. Relativo al sito PhoA2, che si trova più lontano da SecA37. Gli spettri di decadimento della fluorescenza risolti nel tempo hanno dimostrato che il complesso donatore-accettore ha un decadimento omogeneo più breve coerente con il trasferimento di energia associato a una distanza.I gusci di distanza FRET costruiti tra il residuo SecA PhoA2 e i siti triangolati, hanno dimostrato che ogni guscio si interseca con il dito a due eliche, il sito di legame assunto, che è mostrato in verde. L'area intersecata è più piccola di ogni guscio FRET e include un grande contributo dall'impalcatura elicoidale. I gusci di distanza FRET determinati tra il residuo di PhoA2 e i siti etichettati, descrivono un'area più piccola situata più vicino alla punta del dito a due eliche e alla bocca del canale SecYEG.Questa area intersecata si trova all'estremità opposta del dito a due eliche di PhoA2. Le cose importanti da considerare includono una corretta selezione dei siti di etichettatura per triangolare l'area di interesse, per misurare i rendimenti quantistici per ciascun sito e rimuovere tutto il colorante libero. Questo metodo si allinea con le informazioni strutturali ottenute con metodi come la NMR o la cristallografia a raggi X.Quando i risultati FRET vengono inseriti in un contesto strutturale, possono migliorare le informazioni esistenti.

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