Name: Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Impara a produrre sferoidi tumorali multicellulari su larga scala in piastre multi-well per screening ad alto contenuto. Questo metodo consente analisi morfologiche dettagliate e studi di tossicità cellulare.

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Gli autori riconoscono il sostegno di una sovvenzione per la ricerca sulle infrastrutture da parte della Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) a JCS. Il lavoro nel laboratorio di screening delle cellule UCD è supportato dall'UCD College of Science. ASC è finanziato da una borsa di studio post-laurea del governo irlandese del Consiglio della ricerca (IRC) (GOIPG / 2019/68). Gli autori ringraziano anche tutti i membri del laboratorio per il loro contributo e le discussioni utili. La grafica nella Figura 1 è stata generata in BioRender.

1. Coltura cellulare
<ol><li>Preparare i supporti<ol>
<li>Preparare specifici terreni di coltura cellulare a seconda del tipo di linea cellulare. Assicurarsi che tutti i mezzi per il mantenimento cellulare contengano il 10% di siero bovino fetale (FBS). NOTA: linee cellulari diverse utilizzano supporti diversi. Le cellule di carcinoma del colon HT-29 (ATCC HTB-38) sono coltivate in McCoys 5A + 10% FBS. Le cellule di carcinoma epatocellulare HepG2 (ATCC HB-8065) sono coltivate in Minimum Essential Medium + 1% L-glutammina + 10% FBS. Le cellule di carcinoma broncoalveolare H358 (ATCC CRL-5807) sono coltivate in rpmI 1640 medio + 1% L-glutammina + 10% FBS. Tutti i supporti contenenti L-glutammina e FBS sono indicati come supporti completi. Quando si placcano le cellule per crescere come sferoidi, è necessario un mezzo privo di fenolo rosso con il 10% di FBS per evitare la colorazione del materiale basale ECM, che a sua volta può causare artefatti durante il processo di imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Celle di sottocoltura<ol>
<li>Quando le cellule sono confluenti all'80% circa, lavare brevemente con 2 ml di tripsina-EDTA (0,25% (p / v) di tripsina / 0,53 mM EDTA). Aspirare la tripsina-EDTA, aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA fresca e incubare per 3-5 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Quando le cellule vengono staccate dal piatto di coltura cellulare, aggiungere 7 ml di terreno fresco completo.</li>
		<li>Pipettare 1 mL di sospensione cellulare in una nuova capsula di coltura cellulare da 10 cm e aggiungere 9 mL di mezzo fresco completo per dare una diluizione 1:10 delle cellule.</li>
		<li>Colturare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2.</li>
		<li>Sottocultura le cellule ogni 3-5 giorni, a seconda della linea cellulare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Generazione di sferoidi
<ol><li>Rivestire piastre a 96 pozzetti con materiale seminterrato ECM<ol>
<li>Scongelare il materiale del seminterrato ECM sul ghiaccio durante la notte.</li>
		<li>Diluire il materiale basale ECM in mezzo privo di siero privo di fenolo rosso freddo utilizzando punte pre-refrigerate mantenute a -20 °C. NOTA: La concentrazione finale di materiale basale ECM dipende dalla linea cellulare utilizzata. Per le celle HT-29 e H358, utilizzare 4 mg·mL-1 di materiale basale ECM. Per le cellule HepG2, utilizzare 4 mg·mL-1 di materiale basale ECM a fattore di crescita ridotto.</li>
		<li>Pipettare 15 μL del materiale basale ECM/soluzione media in una piastra di imaging a 96 pozzetti. NOTA: per la produzione di sferoidi su larga scala, questa fase può essere eseguita sia con una pipetta a 8 canali che con una testa di pipettaggio a 96 canali, purché le punte e il serbatoio contenenti il materiale seminterrato ECM siano refrigerati.</li>
		<li>Centrifugare la piastra per 20 min a 91 x g a 4 °C.</li>
		<li>Incubare la piastra per non più di 30 minuti a 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sottocultura e celle di conteggio<ol>
<li>Durante il periodo di incubazione della piastra, incubare le cellule con tripsina-EDTA e risospenderle in un mezzo completo contenente il 10% di FBS.</li>
		<li>Pipettare 10 μL della sospensione cellulare in una camera di conteggio emocitometrica. Contare il numero di celle in 4 quadranti della camera.</li>
		<li>Calcolare il numero di celle all'interno della sospensione cellulare determinando il numero medio di cellule all'interno dei 4 quadranti. NOTA: le celle possono anche essere contate utilizzando dispositivi automatici di conteggio delle celle.</li>
		<li>Centrifugare le celle a 135 x g per 4 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Una volta che le cellule sono state pellettate, aspirare il surnatante e risospese le cellule in un mezzo completo privo di fenolo rosso per ottenere una concentrazione di 1 x 106 cellule per mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellule di semi in piastre rivestite di materiale seminterrato ECM<ol>
<li>Diluire le cellule in un mezzo completo privo di fenoli rossi. NOTA: la densità delle celle seminate dipende dalla linea cellulare utilizzata. Per le cellule HT-29 e HepG2, 3 x 104 cellule sono seminate per pozzetto; per le cellule H358, 4 x 104 cellule sono seminate per pozzetto.</li>
		<li>Seminare le cellule in un volume totale di 35 μL per pozzetto. Assicurati di aggiungerli a goccia con un movimento circolare. NOTA: per la produzione di sferoidi su larga scala, questo passaggio può essere eseguito con una pipetta a 8 canali, purché sia possibile ottenere il movimento circolare del pipettaggio.</li>
		<li>Incubare le cellule per 1 ora a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2.</li>
		<li>Preparare una soluzione di materiale basale ECM in mezzo completo privo di fenolo rosso, che si traduce in una concentrazione finale del 2% di materiale basale ECM nel pozzo. Per raggiungere questo obiettivo, aggiungere 1,2 μL di materiale basale ECM a 23,8 μL di mezzo completo privo di fenolo rosso per pozzetto, ottenendo un volume finale di 60 μL per pozzetto.</li>
		<li>Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2.</li>
		<li>Il giorno seguente, sostituire il mezzo con 100 μL di mezzo completo fresco senza fenolo rosso.</li>
		<li>Sostituire il mezzo ogni due giorni con 100 μL di mezzo completo fresco privo di fenolo rosso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Colorazione immunofluorescenza degli sferoidi
NOTA: Questo protocollo è adattato da Nürnberg et al., 202015. Questi adattamenti si basano principalmente sul fatto che gli sferoidi descritti in questo protocollo sono più piccoli di quelli utilizzati nel lavoro di Norimberga et al.15 e, come tali, facilitano tempi di incubazione più brevi. Ad esempio, i tempi di blocco sono ridotti da 2 h a 1 h. Inoltre, poiché il protocollo è progettato per la produzione ad alto rendimento di sferoidi, tutte le fasi di lavorazione vengono eseguite nel pozzo in cui vengono coltivati gli sferoidi, il che significa che non è richiesto il trasferimento di singoli sferoidi in tubi.
<ol><li>Preparare tutte le soluzioni e i tamponi necessari per il fissaggio e la colorazione<ol>
<li>Preparare Phosphate Buffered Saline (PBS) aggiungendo 1 compressa PBS per 200 ml di acqua. Autoclave il PBS.</li>
		<li>Preparare la paraformaldeide (PFA) seguendo i passaggi 3.1.3-3.1.4.</li>
		<li>Utilizzare un agitatore riscaldato per riscaldare 400 mL di PBS a 60-70 °C in una cappa aspirante. Aggiungere 15 g di PFA mescolando. Una volta che il PFA si è sciolto, aggiungere 50 μL di 1 M CaCl2 e 50 μL di 1 M MgCl2.</li>
		<li>Aggiungere 100 mL di PBS per creare un volume finale di 500 ml. Utilizzare NaOH per equilibrare il PFA a pH 7,4. Filtrare il PFA attraverso filtri sottovuoto sterili (dimensione dei pori 0,22 μm), aliquota e conservare a -20 °C.</li>
		<li>Preparare una soluzione madre di glicina 1 M aggiungendo 3,75 g di glicina a 50 ml di PBS. Conservare a 4 °C.</li>
		<li>Preparare 5 mL di tampone di permeabilizzazione aggiungendo 100 μL di Triton X-100, 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) e 1,5 mL di glicina 1 M a 2,4 mL di PBS. Conservare a 4 °C per non più di 2 settimane.</li>
		<li>Preparare 5 mL di tampone bloccante aggiungendo 100 μL di Triton X-100, 0,5 mL di DMSO e 0,05 g di albumina sierica bovina (BSA) a 4,9 mL di PBS. Aliquotare il tampone di bloccaggio in tubi da 1,5 ml e conservare a -20 °C.</li>
		<li>Preparare 5 mL di tampone di incubazione anticorpale aggiungendo 10 μL di polisorbato 20, 0,05 g di BSA e 250 μL di DMSO a 4,74 mL di PBS. Aliquotare il tampone di incubazione degli anticorpi in tubi da 1,5 ml e conservarlo a -20 °C. NOTA: Nel protocollo qui descritto, gli sferoidi sono assemblati solo nei 60 pozzetti interni di una piastra a 96 pozzetti, sebbene possano essere preparati in tutti i 96 pozzetti della piastra. La ragione per preparare solo gli sferoidi nei 60 pozzetti interni è che alcuni obiettivi ad alta apertura numerica non sono in grado di essere fisicamente in grado di visualizzare l'intero pozzo dei pozzetti esterni a causa della "gonna" su alcuni tipi di piastre. I volumi di cui sopra sono sufficienti per la preparazione di 60 pozzi contenenti sferoidi.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissare e permeabilizzare gli sferoidi<ol>
<li>Rimuovere con attenzione il mezzo dagli sferoidi, assicurando che lo strato di materiale basale ECM non venga disturbato.</li>
		<li>Lavare gli sferoidi due volte con 70 μL di PBS per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Fissare gli sferoidi con 70 μL di PFA al 3% per 1 ora a 37 °C.</li>
		<li>Lavare gli sferoidi due volte con 70 μL di PBS per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Spegnere con 70 μL di soluzione di glicina da 0,5 M per 30 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Permeabilizzare gli sferoidi utilizzando 70 μL del tampone di permeabilizzazione per 30 min a RT.</li>
		<li>Lavare gli sferoidi due volte con 70 μL di PBS per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Incubare gli sferoidi in 70 μL di tampone bloccante per 1 ora a 37 °C. NOTA: una volta fissati gli sferoidi, tutte le successive fasi di lavorazione possono essere eseguite utilizzando una pipetta a 8 canali o una testa di pipettaggio a 96 pozzetti, se disponibile. Ciò aumenta la velocità di preparazione degli sferoidi prima dell'imaging.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunostain sferoidi utilizzando anticorpi primari e secondari<ol>
<li>Diluire l'anticorpo primario ad una diluizione appropriata nel tampone di incubazione degli anticorpi e aggiungere 70 μL a ciascun pozzetto. Incubare gli sferoidi con l'anticorpo primario durante la notte. NOTA: La diluizione dipende dall'anticorpo specifico utilizzato. Nell'esempio mostrato qui, i lisosomi sono immunocolorati con anticorpi anti-LAMP1 di topo usando una diluizione di 1:500.</li>
		<li>Il giorno seguente, lavare gli sferoidi 5 volte con 70 μL di PBS per 3 minuti ogni volta.</li>
		<li>Diluire l'anticorpo secondario a una diluizione di 1:500, falloidina coniugata fluorescentemente a 1:500 e Hoechst 33342 (da uno stock di 1 mg mL-1 ) a 1:5000 nel tampone di incubazione degli anticorpi e aggiungere 70 μL a ciascun pozzetto. Incubare durante la notte. NOTA: La diluizione anticorpale dipende dall'anticorpo specifico utilizzato. Si raccomandano anticorpi secondari altamente adsorbiti incrociati che mostrano un'elevata fotostabilità e un'elevata luminosità.</li>
		<li>Il giorno seguente, lavare gli sferoidi 5 volte con 70 μL di PBS per 3 minuti ogni volta. NOTA: le piastre possono essere conservate per un massimo di due settimane a RT prima dell'imaging, purché gli sferoidi rimangano coperti con PBS.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Acquisizione di immagini e analisi di sferoidi
<ol><li>Acquisizione di immagini<ol>
<li>Inserire la piastra a 96 pozzetti contenente sferoidi in un microscopio di screening confocale ad alto contenuto.</li>
		<li>Selezionare i laser appropriati per eccitare i fluorofori utilizzati.</li>
		<li>Acquisire i canali in sequenza per evitare il cross-talk.</li>
		<li>Immagina gli sferoidi usando obiettivi appropriati. NOTA: L'uso di obiettivi di immersione in acqua è raccomandato se disponibile. Ad esempio, un obiettivo 20x/1.0 NA può visualizzare un intero pozzo in ~ 77 campi visivi. Un obiettivo 63x/1,15 NA può visualizzare un intero pozzo in circa 826 campi visivi.</li>
		<li>Immagine ~ 30-40 fette, a seconda della profondità dello sferoide, con ogni fetta presa ad un intervallo di 1,5 μm da quella precedente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi delle immagini<ol>
<li>Per l'analisi morfologica degli sferoidi, seguire i passaggi 4.2.2-4.2.6.</li>
		<li>Segmentare gli sferoidi in base alla colorazione di falloidina coniugata fluorescentemente.</li>
		<li>Segmentare i nuclei in base alla colorazione Hoechst 33342.</li>
		<li>Segmentare il citoplasma di ciascuna cellula dalla colorazione residua di Hoechst 33342 presente nel citoplasma cellulare.</li>
		<li>Calcola diverse proprietà morfologiche degli sferoidi, tra cui volume, superficie, sfericità e numero di nuclei per sferoide. NOTA: queste informazioni vengono estratte utilizzando vari algoritmi integrati nel software di analisi delle immagini preferito.</li>
		<li>Elaborare ulteriormente le immagini per rimuovere sferoidi più piccoli di 75.000 μm3 e più grandi di 900.000 μm3. Nota : questi valori sono suggerimenti per consentire la rimozione di assiemi di celle molto piccole e assiemi di grandi dimensioni che potrebbero essere sorti a seguito della fusione di più sferoidi. Gli sferoidi possono anche essere classificati in diverse classi di dimensioni in questa fase.</li>
		<li>Per analizzare singole cellule all'interno degli sferoidi, seguire i passaggi 4.2.8-4.2.12.</li>
		<li>Segmentare gli sferoidi in base alla colorazione di falloidina coniugata fluorescentemente.</li>
		<li>Segmentare i nuclei in base alla colorazione Hoechst 33342.</li>
		<li>Segmentare il citoplasma di ciascuna cellula dalla colorazione residua di Hoechst 33342 presente nel citoplasma cellulare.</li>
		<li>Segmentare i lisosomi in base alla colorazione secondaria degli anticorpi.</li>
		<li>Calcola diverse proprietà morfologiche delle cellule all'interno di ciascun sferoide, incluso il numero di lisosomi per cellula, il volume cellulare e l'area della superficie cellulare. NOTA: queste informazioni vengono estratte utilizzando vari algoritmi integrati nel software di analisi delle immagini preferito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Powley, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants+%28PDEs%29+as+a+powerful+preclinical+platform+for+anti-cancer+drug+and+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery.</a> British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).</li>
<li>Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants%2C+xenografts+and+organoids%3A+3-dimensional+patient-relevant+preclinical+models+in+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer.</a> Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).</li>
<li>Miles, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+and+comparing+immunostaining+and+computational+methods+for+spatial+profiling+of+drug+response+in+patient-derived+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants.</a> Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi concorrenti associati a questo lavoro.

L'approccio qui descritto descrive una piattaforma per generare diverse centinaia di sferoidi per pozzo in un modo adatto per HCS e HCA. Rispetto ad altri metodi popolari, come l'uso di piastre ULA a fondo piatto e a fondo tondo, che consentono la formazione di un solo sferoide per pozzo18,19, questo metodo offre l'opportunità di estrarre informazioni ad alta risoluzione da un gran numero di sferoidi in un formato di screening. In particolare, questo metodo è sta...

Tradizionalmente, i saggi basati su cellule sono stati eseguiti in monostrati che crescono su un substrato solido, che può effettivamente essere considerato come un ambiente bidimensionale (2D). Tuttavia, sta diventando sempre più riconosciuto che i modelli di coltura cellulare 2D mancano di rilevanza fisiologica in alcuni contesti e non possono replicare molte delle complesse interazioni che si verificano tra le cellule1. I metodi di coltura cellulare tridimensionale (3D) stanno rapidamente diventando popolari tra i ricercatori e i modelli cellulari 3D mostrano un alto potenziale per imitare meglio le condizioni fisiologiche incontrate dalle cellule nell'ambiente tissutale2. Esistono diversi tipi di assemblaggi di celle 3D che sono stati impiegati, ma i due tipi più comuni sono sferoidi e organoidi. Gli sferoidi possono essere coltivati da molte linee cellulari diverse e possono adottare varie forme e dimensioni a seconda del tipo di cellula utilizzata e del loro metodo di assemblaggio3. Inoltre, gli sferoidi possono anche essere indicati come sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) quando sono cresciuti da linee cellulari tumorali, e questi modelli hanno trovato particolare uso per la somministrazione preclinica in vitro di farmaci e studi di tossicità4,5. Gli organoidi, d'altra parte, mirano a imitare meglio i tessuti e gli organi del nostro corpo e possono adottare disposizioni morfologiche più complesse. La produzione di organoidi comporta l'uso di cellule staminali adulte o cellule staminali pluripotenti, che possono essere riprogrammate nelle cellule appropriate per assomigliare al tessuto o all'organo di interesse. Sono utilizzati principalmente per studiare lo sviluppo di organi e per modellare malattie e interazioni ospite-patogeno6.
Esiste una gamma di metodi diversi utilizzati per generare assiemi di celle 3D. I metodi basati su scaffold forniscono un substrato o un supporto a cui le cellule possono attaccarsi o crescere all'interno. Queste impalcature possono avere varie forme e possono essere realizzate con una varietà di materiali diversi. I più comuni sono i componenti della matrice extracellulare (ECM) e gli idrogel, e sono progettati per assomigliare all'ambiente extracellulare naturale delle cellule e quindi facilitare le interazioni fisiologiche4,7. Il materiale basale ECM è stato estratto dal tumore del sarcoma del topo Engelbreth-Holm-Swarm e ha dimostrato di contenere una ricca miscela di componenti ECM, tra cui laminina, collagene di tipo IV e perlecan8. Tuttavia, nonostante la sua composizione vantaggiosa, ci sono due sfide principali con il suo uso, vale a dire la sua variabilità da lotto a lotto e che ha due diversi stati aggregati al di sotto e al di sopra di 10 °C8,9. Al contrario, gli idrogel hanno il vantaggio di essere flessibili rispetto ai loro componenti e alla rigidità e possono essere personalizzati per adattarsi allo specifico assemblaggio di celle 3D desiderato7,10. I metodi basati su scaffold sono essenziali per la crescita degli organoidi, ma sono anche ampiamente utilizzati per gli sferoidi. I metodi senza impalcature, che funzionano impedendo alle cellule di attaccarsi alla superficie su cui stanno crescendo, sono solitamente compatibili solo con l'assemblaggio sferoide. Gli esempi includono piastre di attacco ultra-basso (ULA), con fondo piatto o fondo a U, che consentono l'aggregazione delle cellule in sferoidi o l'uso di agitazione continua delle cellule in palloni spinner/rotazione10.
L'uso di assemblaggi cellulari 3D per studiare un'ampia varietà di eventi biologici sta rapidamente guadagnando popolarità; tuttavia, è essenziale che il metodo scelto per la loro cultura sia appropriato e compatibile con i piani per la loro analisi a valle. Ad esempio, l'uso di piastre ULA genera sferoidi di elevata consistenza; tuttavia, questo metodo è limitato alla produzione di un singolo sferoide per pozzetto, limitando così la produttività. Particolare considerazione è necessaria quando si pianifica l'imaging a fluorescenza della struttura 3D. Il substrato o la piastra su cui viene coltivato l'assemblaggio deve essere otticamente compatibile e occorre prestare attenzione per ridurre al minimo gli effetti della dispersione della luce causati da eventuali impalcature che potrebbero essere state utilizzate11. Questo particolare problema diventa più acuto all'aumentare dell'apertura numerica delle lenti degli obiettivi del microscopio.
Probabilmente uno dei motivi principali per scegliere di lavorare con un modello di cella 3D è quello di estrarre dati di imaging volumetrico non solo sull'intero assemblaggio ma anche sulle singole celle al suo interno. I modelli MCTS, in particolare, stanno iniziando a dimostrarsi molto potenti per approfondire la nostra comprensione di come le terapie transitano dall'esterno alle cellule centrali (come avrebbero bisogno in un tumore)12, e quindi acquisire conoscenze da singole cellule a diversi strati è essenziale. La tecnologia di imaging che estrae informazioni quantitative dalle singole cellule è definita analisi ad alto contenuto (HCA) ed è un approccio potente nel contesto dello screening13. Ad oggi, l'HCA è stato applicato quasi esclusivamente alle colture monostrato, ma c'è una crescente consapevolezza che questo approccio ha il potere di essere applicato alle colture 3D consentendo di studiare una vasta gamma di funzioni e processi cellulari14. Avrebbe il chiaro vantaggio che un gran numero di assiemi 3D potrebbe essere analizzato, fornendo potenzialmente dati a livello di cella da ogni struttura. Tuttavia, le sfide associate all'imaging di assemblaggi di celle potenzialmente spesse, nonché i grandi set di dati generati, devono essere superati.
In questo articolo viene presentato un robusto metodo basato su scaffold per la produzione su larga scala di MCTS in un formato a 96 pozzetti. Il metodo facilita la produzione di diverse centinaia di assemblaggi di celle 3D in ogni pozzo. Esempi sono mostrati per tre diversi tipi di cellule, che rappresentano modelli di tumore solido del fegato, del polmone e del colon. Gli sferoidi che si formano possono essere di una varietà di dimensioni, e quindi HCA viene utilizzato per selezionare strutture di una particolare dimensione e / o morfologia. Questa caratteristica fornisce l'ulteriore vantaggio che qualsiasi fenotipo osservato può essere confrontato tra sferoidi di diverse dimensioni, ma tutti trattati allo stesso modo nello stesso pozzo. Questo approccio è compatibile con l'imaging ad alta risoluzione, fornendo dati quantitativi sia a livello cellulare che subcellulare dagli stessi assemblaggi cellulari. Questo metodo di produzione di sferoidi ha l'ulteriore vantaggio rispetto ai metodi che generano un singolo sferoide per pozzo, che il gran numero di sferoidi prodotti in ciascun pozzo fornisce potenzialmente biomassa sufficiente per altre analisi a valle, come il trascrittoma e la profilazione del proteoma.

<table><tbody><tr><td>0,05% tripsina-EDTA (1x), rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10050070</td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, trattamento con coltura tissutale, nero, 96 pozzetti con coperchio</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>Queste piastre sono state rinominate Phenoplates</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS), qualificato, approvato dall'UE, origine sudamericana, inattivato a caldo</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-glutammina, 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647032</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrice di membrana basale, senza rosso fenolo, senza LDEV, 10 mL</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>Questa formulazione Matrigel può essere trovata anche con lo stesso numero di catalogo su BD Biosciences</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Questa formulazione Matrigel può essere trovata anche con lo stesso numero di catalogo presso il</td></tr><tr><td>terreno 5A di</td> Corning<td>McCoy</td><td>26600023</td><td></td></tr> il <tr><td>terreno 5A di McCoy con L-glutammina e bicarbonato di sodio, senza rosso fenolo</td><td>Hyclone</td><td>10358633</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>21090022</td><td></td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale (MEM), senza glutammina, senza rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>51200046</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-LAMP1 di topo (concentrato)</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi</td><td>H4A3-a</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Neubauer</td><td>Hirschmann</td><td>8100203</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale Nunclon con coperchio, polistirene, 92 mm x 17 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix HCS System e software Harmony HCA</td><td>Perkin Elmer</td><td>HCSHH14000000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponato soluzione salina (PBS) compresse</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, senza glutammina, senza rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>11835063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Stericup unità filtranti sterili sottovuoto</td><td>Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

Lo screening ad alto contenuto (HCS) e l'analisi ad alto contenuto (HCA) sono tecnologie che forniscono ai ricercatori la capacità di estrarre misurazioni fenotipiche quantitative su larga scala dalle cellule. Questo approccio si è dimostrato potente per approfondire la nostra comprensione di una vasta gamma di eventi sia fondamentali che applicati nella biologia cellulare. Ad oggi, la maggior parte delle applicazioni per questa tecnologia si è basata sull'uso di cellule cresciute in monostrati, anche se è sempre più consapevole che tali modelli non ricapitolano molte delle interazioni e dei processi che si verificano nei tessuti. Come tale, c'è stato un emergere nello sviluppo e nell'uso di assemblaggi cellulari tridimensionali (3D), come sferoidi e organoidi. Sebbene questi modelli 3D siano particolarmente potenti nel contesto della biologia del cancro e degli studi sulla somministrazione di farmaci, la loro produzione e analisi in modo riproducibile adatto a HCS e HCA presenta una serie di sfide. Il protocollo qui dettagliato descrive un metodo per la generazione di sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) e dimostra che può essere applicato a tre diverse linee cellulari in modo compatibile con HCS e HCA. Il metodo facilita la produzione di diverse centinaia di sferoidi per pozzo, fornendo il vantaggio specifico che, se utilizzato in un regime di screening, i dati possono essere ottenuti da diverse centinaia di strutture per pozzo, tutte trattate in modo identico. Vengono inoltre forniti esempi, che descrivono in dettaglio come elaborare gli sferoidi per l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione e come l'HCA può estrarre caratteristiche quantitative sia a livello sferoide che da singole cellule all'interno di ciascun sferoide. Questo protocollo potrebbe essere facilmente applicato per rispondere a una vasta gamma di domande importanti nella biologia cellulare.

In questo protocollo, viene dettagliato un metodo robusto per produrre assemblaggi di colture cellulari 3D sotto forma di sferoidi, utilizzando diversi tipi di cellule per rappresentare vari tessuti tumorali. Questo metodo consente la generazione di centinaia di sferoidi per pozzo, il che consente di eseguire saggi basati su cellule in modo ad alto contenuto (Figura 1). Questo approccio è stato precedentemente utilizzato per studiare l'assorbimento di nanoparticelle negli sferoidi <sup class...

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l'analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.

Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

Questo protocollo fornisce un metodo per produrre diverse centinaia di sferoidi tumorali multicellulari in ogni pozzetto di una piastra multiplo adatta alla microscopia automatizzata. Gli sferoidi prodotti possono essere classificati in diverse classi di dimensioni e le informazioni subcellulari possono essere estratte da ogni cellula. La tecnica produce sieri sufficienti che possono essere utilizzati nello screening diretto e negli studi di interferenza dell'RNA.Diluire il materiale seminterrato ECM in mezzo libero da siero rosso fenolo freddo utilizzando punte pre-refrigerate mantenute a meno 20 gradi Celsius. Scommetto 15 microlitri del materiale seminterrato ECM e soluzione media in una piastra di imaging a 96 pozzetti. Centrifugare la piastra per 20 minuti a 91 volte G a quattro gradi Celsius.Incubare la piastra per non più di 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere viaggi ed EDTA alle celle. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius alla fine dell'incubazione, sospendiamo le cellule in un mezzo completo contenente il 10% di FBS.Pipettare 10 microlitri della sospensione cellulare, in una camera di conteggio emocitometrica. Contare il numero di celle in quattro quadranti della camera. Centra visualizza le celle a 135 volte G per quattro minuti a temperatura ambiente.Una di queste cellule vengono pellettate, aspirano il surnatante e risospesgono le cellule in un mezzo completo privo di fenolo rosso per ottenere una concentrazione di 10 alle sei cellule per millilitro. Diluire le cellule in un mezzo completo privo di fenolo rosso. Vedere le celle a goccia in un movimento circolare in un volume totale di 35 microlitri per pozzetto.Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica. A 1,2 microlitri di materiale seminterrato ECM a 23,8 microlitri di mezzo completo privo di fenolo rosso per pozzetto, con un volume finale di 60 microlitri per pozzetto. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica.Il giorno seguente, sostituire il mezzo con 100 microlitri di mezzo completo fresco senza fenolo rosso. Inserire la piastra da 96 pozzetti contenente sferoidi, in un microscopio di screening confocale ad alto contenuto. Selezionare i laser appropriati per eccitare i pavimenti utilizzati.Acquisire i canali in sequenza per evitare la diafonia, visualizzare gli sferoidi utilizzando obiettivi appropriati. Per analizzare la morfologia degli sferoidi, segmentare gli sferoidi in base al FLoide coniugato fluorescente e alla colorazione. Segmentare i nuclei in base alla colorazione esadecimale tre, tre, tre, quattro, due.Segmentare il citoplasma di ciascuna cellula con l'esagono residuo tre, tre, quattro, due, macchia che è presente nel citoplasma cellulare. Calcola diverse proprietà morfologiche degli sferoidi tra cui volume, superficie, sfericità e numero di nuclei per i suoi sferoidi. Ross ha ulteriori immagini per rimuovere sferoidi più piccoli di 75 micrometri cubi e più grandi di 900.000 micrometri cubici.Per analizzare una singola cellula all'interno degli sferoidi, segmentare gli sferoidi in base alla colorazione sferoide coniugata fluorescentemente. Segmentare i nuclei in base alla colorazione esadecimale tre, tre, tre, quattro, due. Segmentare il citoplasma di ciascuna cellula con la colorazione esagonale residua tre, tre, tre, quattro, due che è presente nel citoplasma cellulare.Segmentare i lisosomi in base alla colorazione secondaria degli anticorpi. Calcola diverse proprietà morfologiche delle cellule all'interno di ciascun sferoide, incluso il numero di lisosomi per cellula, il volume cellulare e l'area della superficie cellulare. La figura mostra una panoramica di tre diversi tipi di sferoidi, comprese le immagini a diversi piani confocali.Viene anche mostrata una vista volumetrica dell'intero sferoide. La figura mostra il processo di segmentazione del pH, il pannello A mostra l'intero sferoide in una vista volumetrica. Il pannello B mostra la segmentazione impostata del citoplasma, dei nuclei e dei lisosomi all'interno di tutte le cellule di un singolo sferoide.Il citoplasma e i nuclei sono segmentati in base alla colorazione esadecimale tre, tre, tre, quattro, due. E i lisosomi sono segmentati in base alla colorazione anticorpale anti laboratorio. I pannelli C mostrano lo stesso segmentato del pannello B, ma in una vista a tre piani.È possibile effettuare varie misurazioni morfologiche a livello di sferoidi. Queste misurazioni includono il calcolo del numero di nuclei per sferoidi, così come questi Felicity, volume e superficie del pH. Il volume tipico di ogni cella nei tre tipi di sferoidi.Così come il numero di lisosomi per cellula sono mostrati in questa figura. L'ottimizzazione della densità iniziale dei posti a sedere delle celle all'inizio della generazione sp è un passo fondamentale. La figura mostra che l'aggiunta di troppe cellule consente ancora la formazione di sferoidi.Tuttavia, questo può provocare la fusione se sferoidi. Gli sferoidi prodotti in questo modo possono essere sottoposti ad analisi trascrittomico e proteomica. Questa tecnica viene utilizzata per analizzare quantitativamente l'assorbimento della somministrazione di farmaci tali nano particelle e valutare la loro tossicità per le singole cellule negli sferoidi.

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