Coltivazione e screening del nematode parassita vegetale Ditylenchus dipsaci

Questo protocollo consente la scoperta di nuovi nematicidi per combattere diTylenchus dipsaci mediante la tecnica di coltivazione e schermi chimici di medio rendimento. La semplicità di questa tecnica consente lo screening di migliaia di composti a settimana per identificare composti con potenziale nematicidale. Questa tecnica può identificare nuovi composti per uccidere i nematodi parassiti delle piante delle colture e, quindi, aumentare l'offerta alimentare globale.

Per iniziare, preparare 500 millilitri di agar nutriente, o NA media, con 23 grammi per litro di NA e acqua ultrapura. Usando la tecnica sterile, versare 25 millilitri di media NA autoclavati in 20 piastre di Petri monouso da 100 millimetri di diametro e 15 millimetri di profondità. Preparare 500 millilitri di Gamborg B5, o mezzi GA, contenenti 3,2 grammi per litro di mezzo basale GA con sostanze organiche minime, 20 grammi per litro di saccarosio, 15 grammi per litro di agar e acqua distillata.

Usando la tecnica sterile, versare 50 millilitri di mezzi GA autoclavati in 10 piastre di Petri usa e getta. Per eseguire la sterilizzazione dei semi, versare 150 semi di pisello in un becher sterile da due litri con una barra di agitazione vicino a una fiamma del bruciatore Bunsen su un banco da laboratorio. Aggiungere 200 millilitri di etanolo al 95% ai semi e mescolare vigorosamente sulla piastra per cinque minuti.

Quindi, versare l'etanolo in un contenitore per i rifiuti. Versare la soluzione di candeggina nel becher per immergere completamente i semi. Mescolare energicamente su un piatto per 20 minuti.

Quindi, versare la candeggina in un contenitore per i rifiuti. Versare acqua distillata nel becher per immergere i semi e mescolare vigorosamente su un piatto per 20 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio con acqua, versare i semi sterilizzati nella capsula di Vetro di Petri.

Per verificare la contaminazione, trasferire sei semi in ogni piastra NA da 10 centimetri nella cappa a flusso laminare utilizzando una pinza sterilizzata. Disporre i semi attorno alla circonferenza della piastra. Avvolgere le piastre singolarmente in pellicola da imballaggio da laboratorio e incubarle al buio per tre giorni a 26 gradi Celsius.

In una cappa a flusso laminare, placcare due semi non contaminati su ciascuna piastra GA con pinza sterilizzata. Incubare a temperatura ambiente per 7-10 giorni per consentire ai semi di germogliare. Preparare 50 millilitri di soluzione di saccarosio da 20 grammi per litro.

Filtrare sterilizzare la soluzione di saccarosio e mettere da parte. In una cappa a flusso laminare, tagliare un pezzo di agar contenente tessuto radicale da una piastra di coltura esistente. Pipettare 500 microlitri di soluzione di saccarosio su una nuova piastra GA con piantine di piselli e posizionare un cubo di agar sopra il saccarosio.

Mantenere la coltura in una scatola rivestita con un foglio di alluminio a temperatura ambiente. Per mantenere la cultura, sottoculturare i nematodi su piastre GA fresche ogni otto-nove settimane. I nematodi sono pronti per essere estratti dopo circa otto settimane.

In un cappuccio a flusso laminare, tagliare l'agar e il tessuto radicale in cubetti di un centimetro con un bisturi sterile. Trasferire i cubetti di agar nell'imbuto rivestito di filtro del caffè e versare lentamente acqua distillata sull'agar per inumidire il filtro del caffè. Rimuovere l'imbuto rivestito con filtro per caffè dal becher e riempire il becher con acqua distillata fino a quando il livello dell'acqua non tocca il fondo del filtro una volta sostituito l'imbuto rivestito con filtro per caffè.

Coprire l'imbuto e il becher rivestiti con filtro per caffè con un foglio di alluminio. Per raccogliere i vermi, rimuovere l'imbuto rivestito di filtro del caffè e aspirare i primi 40 millilitri di acqua dal becher di raccolta, senza interrompere i vermi depositati. Raccogliere il liquido rimanente in un tubo centrifugo conico da 15 millilitri con una pipetta sierologica in plastica da 10 millilitri.

Per preparare le piastre di analisi, versare acqua distillata in autoclave in un trogolo sterile ed erogare 40 microlitri di acqua distillata dal trogolo in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti con una pipetta multicanale. Aggiungere sostanze chimiche dalle piastre di riserva chimica a 96 pozzetti alle piastre di analisi appuntando tre volte nella piastra chimica. Quindi, trasferire i perni 10 volte nella piastra di analisi.

Tamponare sulla carta davanti alla soluzione detergente. Per contare il numero di nematodi della raccolta, in primo luogo, sospendere nuovamente la raccolta e quindi pipettare cinque microlitri della soluzione utilizzando punte a bassa ritenzione su un vetrino. Contare il numero di nematodi in cinque microlitri usando un microscopio a dissezione.

Quindi, regolare la concentrazione a due vermi per microlitro utilizzando acqua distillata sterile. Quindi, aggiungere 10 microlitri del campione a ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti con una pipetta multicanale e un trogolo. Avvolgere i piatti con un tovagliolo di carta umido e metterli in una scatola.

Quindi, aggiungere un tovagliolo di carta extra umido per stabilizzare e garantire il minimo movimento delle piastre e apporre su un cuscinetto appiccicoso in un incubatore di scuotimento a 20 gradi Celsius impostato su 200 RPM. Osserva le piastre il quinto giorno al microscopio sezionante. Contare il numero di D.dipsaci mobili e totali nei controlli dei solventi DMSO e nei pozzi trattati con farmaci.

Se i vermi sono immobili, aggiungere due microlitri di idrossido di sodio monofusolare ad una concentrazione finale di 40 millimolari al pozzo per stimolare il movimento. Calcola la proporzione di worm mobili. Negli schermi D.dipsaci, i pozzi che hanno prodotto in modo riproducibile lo 0% di worm mobili sono classificati come colpi forti.

Tre diverse piastre di droga sono state sottoposte a screening a una concentrazione di 60 micromolari, dove ogni piastra di farmaco ha tre repliche biologiche. Tutte e tre le piastre includevano il 6% dei controlli solo solvente DMSO. Molte piastre contenenti farmaci della libreria di piccole molecole mancavano di qualsiasi molecola con bioattività osservabile contro D.dipsaci.

Alcune placche avevano colpi completamente riproducibili, mentre altre contenenti nematicidi caratterizzati variavano nella loro attività. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Qui, fluopyram ha mostrato una robusta attività nel test.

Fluopyram ha indotto un apparente effetto dose-dipendente sulla mobilità D.dipsaci con un EC50 di 9,3 micromolari. L'oxamil non ha avuto effetti significativi sulla mobilità fino a una concentrazione di 120 micromolari. L'oxamil non ha avuto alcun effetto significativo sulla mobilità fino a una concentrazione di 120 micromolari.

L'aggiunta di idrossido di sodio ha migliorato la sensibilità del saggio nel rilevare vermi immobili. 40 millimolari di idrossido di sodio sono stati utilizzati come endpoint del test per stimolare il movimento in individui capaci e, quindi, distinguere i vermi a riposo dai vermi malati. Questo protocollo ha permesso l'identificazione di composti con nuovi meccanismi d'azione contro D.dipsaci e altre specie.