Name: Coltivazione e screening del nematode parassita vegetale Ditylenchus dipsaci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Impara a coltivare e selezionare nematicidi contro Ditylenchus dipsaci con screening chimico a medio rendimento. Questo metodo identifica composti bioattivi per proteggere le colture e migliorare la sicurezza alimentare globale.

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Gli autori riconoscono il Dr. Qing Yu (Agriculture and Agri-Food Canada) per aver fornito la cultura Ditylenchus dipsaci e per i consigli sui metodi di coltura; Dr. Benjamin Mimee (Agriculture and Agri-Food Canada) e Nathalie Dauphinais (Agriculture and Agri-Food Canada) per consigli sulla coltura in vitro di nematodi parassiti vegetali; Dr. Andrew Burns e Sean Harrington per suggerimenti utili sul progetto e sul manoscritto. JK è un NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholar. PJR è supportato da una sovvenzione per progetti CIHR (313296). PJR è una cattedra di ricerca canadese (Tier 1) in genetica chimica.

Il ceppo D. dipsaci G-137 utilizzato per il presente lavoro è stato raccolto dall'aglio Fish Lake 4 Variety nella contea di Prince Edward ed è stato fornito da Agriculture and Agri-food Canada. Se si inizia una nuova coltura, consultare Poirier et al. per la metodologia di inoculazione15.
1. Coltivazione di D. dipsaci
<ol><li>Preparare i supporti e le piastre seguendo il lavoro precedentemente riportato15.<ol>
<li>Preparare 500 ml di nutrienti agar (NA) con 23 g/L di NA (vedi Tabella dei materiali) e acqua ultrapura. Utilizzando una tecnica sterile, versare 25 ml di na autoclave in 20 piastre di Petri monouso (diametro 100 mm x 15 mm di profondità). Lasciare solidificare l'agar a temperatura ambiente (22 °C) con il coperchio acceso per ~2 h e mettere da parte per un uso successivo.</li>
		<li>Preparare 500 mL di mezzi Gamborg B-5 (GA) contenenti 3,2 g/L di mezzo basale GA con sostanze organiche minime, 20 g/L di saccarosio, 15 g/L di agar e acqua distillata (vedere Tabella dei materiali). Utilizzando la tecnica sterile, versare 50 ml di mezzi GA autoclavati in 10 piastre di Petri monouso (diametro 100 mm x 25 mm di profondità). Lasciare che l'agar si solidifichi a temperatura ambiente (22 °C) con il coperchio acceso per ~5 h e conservare in posizione verticale a temperatura ambiente in un sacchetto sterile fino al trasferimento del germoglio. NOTA: le piastre dei supporti in eccesso vengono prodotte in caso di contaminazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la sterilizzazione dei semi seguendo un metodo modificato da un precedente lavoro15.<ol>
<li>Autoclave un becher da 2 L con una barra di agitazione, 2 pinze, una capsula di Petri di vetro e 1 L di acqua distillata. Preparare 200 mL di soluzione etOH al 95% e 200 mL di soluzione di candeggina commerciale al 15%.</li>
		<li>Usa i semi di pisello (vedi Tabella dei materiali). Versare 150 semi in un becher sterile da 2 L con una barra di agitazione vicino a una fiamma del bruciatore Bunsen su un banco da laboratorio.</li>
		<li>Aggiungere 200 ml di EtOH al 95% ai semi all'interno del becher, mescolare vigorosamente sulla piastra per 5 minuti, quindi versare EtOH in un contenitore per i rifiuti.</li>
		<li>Versare la soluzione di candeggina nel becher per immergere completamente i semi. Mescolare energicamente su un piatto per 20 minuti, quindi versare la candeggina in un contenitore per i rifiuti.</li>
		<li>Versare acqua distillata nel becher per immergere i semi e mescolare vigorosamente su un piatto per 20 minuti. Ripetere i lavaggi d'acqua tre volte, versando acqua distillata dopo ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio con acqua, versare i semi sterilizzati nella capsula di Vetro di Petri.</li>
		<li>Per verificare la presenza di contaminazione, trasferire 6 semi su ogni piastra NA da 10 cm (preparata al punto 1.1.1) nella cappa di inondazione laminare utilizzando una pinza sterilizzata. Disporre i semi attorno alla circonferenza del piatto (i semi più grassocci funzionano meglio). Avvolgere le piastre singolarmente in pellicola da imballaggio da laboratorio e incubare al buio per 3 giorni a 26 °C. NOTA: la placcatura di più semi del necessario consentirà l'uso selettivo di semi non contaminati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esegui il trasferimento dei germogli seguendo il passaggio seguente.<ol>
<li>In una cappa a flusso laminare, utilizzare pinze sterilizzate per placcare 2 semi non contaminati su ciascuna piastra GA (preparata al punto 1.1.2). Avvolgere le piastre singolarmente in un film di avvolgimento di laboratorio e incubare a temperatura ambiente per 7-10 giorni per consentire ai semi di germogliare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'allevamento in vitro seguendo un metodo modificato da un precedente lavoro15.<ol>
<li>Preparare 50 ml di soluzione di saccarosio da 20 g/L. Filtrare sterilizzare la soluzione di saccarosio e mettere da parte.</li>
		<li>In una cappa a flusso laminare, tagliare un pezzo di agar contenente tessuto radicale (~ 2 cm3) da una piastra di coltura esistente. Pipettare 500 μL di soluzione di saccarosio su una nuova piastra GA con piantine di piselli e posizionare il cubo di agar sopra il saccarosio. Avvolgere le piastre singolarmente in un film di avvolgimento da laboratorio e mantenere la coltura in una scatola rivestita con un foglio di alluminio a temperatura ambiente (~ 22 ° C).</li>
		<li>Nematodi di sottocoltura su piastre GA fresche ogni 8-9 settimane per mantenere la cultura. I nematodi sono pronti per essere estratti dopo ~ 8 settimane.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Estrazione e raccolta di D. dipsaci
<ol><li>Eseguire l'estrazione di D. dipsaci seguendo i passaggi seguenti.<ol>
<li>Autoclave un becher da 50 ml, un imbuto da 80 mm, 150 ml di acqua distillata e filtri per caffè. Posizionare l'imbuto nel becher e foderare l'imbuto con un filtro per caffè sterile.</li>
		<li>In un cappuccio a flusso laminare, tagliare l'agar e il tessuto radicale in 1 cm3 usando un bisturi sterile. Trasferire i cubetti di agar nell'imbuto rivestito di filtro del caffè e versare lentamente acqua distillata sull'agar per inumidire il filtro del caffè.</li>
		<li>Rimuovere l'imbuto rivestito con filtro per caffè dal becher e riempire il becher con acqua distillata fino a quando il livello dell'acqua non tocca il fondo del filtro una volta sostituito l'imbuto rivestito con filtro per caffè.</li>
		<li>Coprire l'imbuto e il becher rivestiti con filtro per caffè con un foglio di alluminio. Lasciare durante la notte (16 ore) sul banco per consentire ai vermi di muoversi attraverso il filtro del caffè nel becher di raccolta. NOTA: Una piastra di coltura di nematodi è pronta per l'estrazione quando i vermi hanno strisciato nell'agar quando esaminati con un microscopio di dissezione. In genere, una piastra è pronta per l'estrazione 6-8 settimane dopo la sua inoculazione iniziale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la raccolta di D. dipsaci. NOTA: Il giorno dopo, i vermi D. dipsaci si saranno depositati sul fondo del becher.<ol>
<li>Rimuovere l'imbuto rivestito con filtro per caffè e aspirare i primi 40 ml di acqua dal becher di raccolta; assicurarsi di non interrompere i vermi stabilizzati. Utilizzando una pipetta sierologica in plastica da 10 mL, raccogliere il liquido rimanente in un tubo centrifugo conico da 15 mL. NOTA: Questa raccolta può essere utilizzata direttamente nei test. Posizionare a 4 °C se non verranno utilizzati entro 24 ore. I vermi possono essere lasciati per 3 giorni a 4 °C senza alcun impatto visibile sulla mobilità. La rimozione dell'imbuto può disturbare i vermi nel becher di raccolta. Lasciali sistemare sul fondo prima di raccogliere.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Schermo in vitro di piccole molecole
<ol><li>Preparare le piastre di dosaggio seguendo i passaggi seguenti.<ol>
<li>Versare acqua distillata autoclavata in un trogolo sterile e, utilizzando una pipetta multicanale, erogare 40 μL di acqua distillata dal trogolo in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare lo strumento di bloccaggio e aggiungere le sostanze chimiche<ol>
<li>Installare i vassoi pinner (vedere Tabella dei materiali) vicino alla fiamma di un bruciatore Bunsen su un banco da laboratorio. Aggiungere quanto segue ai successivi vassoi pinner: 25 mL di soluzione detergente per pin, 35 mL di DMSO al 50% (in acqua), 45 mL di acqua distillata, 55 mL di EtOH al 70% e 65 mL di EtOH al 95%. Posizionare un pezzo di carta assorbente davanti a ciascun vassoio</li>
		<li>Pulire l'utensile di bloccaggio emergendo i perni nella soluzione detergente e spostando i perni su e giù tre volte (3x) nella soluzione. In questo protocollo, '3x' e '10x' sono definiti come lo spostamento del pinner su e giù in una soluzione tre o dieci volte, rispettivamente. Tampona i perni sulla carta assorbente. Ripetere questa procedura ancora una volta.<ol>
<li>Quindi, risciacquare i perni 3 volte in acqua distillata, quindi tamponare i perni. Ripetere la procedura ancora una volta.</li>
			<li>Infine, risciacquare i perni 3 volte nel 95% di EtOH, quindi tamponare i perni. Ripeti ancora una volta. Fiammare il pinner e lasciare evaporare l'etanolo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere sostanze chimiche dalle piastre di riserva chimica a 96 pozzetti alle piastre di analisi appuntando 3 volte nella piastra chimica, quindi trasferendo i perni 10 volte nella piastra di analisi. Tamponare sulla carta davanti alla soluzione detergente.</li>
		<li>Pulire lo strumento di bloccaggio tra le piastre lavando nel seguente ordine, tamponando in mezzo su carta assorbente: 3x in 50% DMSO (una volta), 3x in acqua distillata (una volta), 3x in 75% EtOH (una volta), 3x in 95% EtOH (due volte). Fiammare il pinner e lasciare evaporare l'etanolo.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 3.2.2 al termine di tutto il blocco. NOTA: Lo screening è stato eseguito ad una concentrazione finale di 60 μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiunta di vermi<ol>
<li>Contare il numero di nematodi della raccolta prima risospendendo e poi pipettando 5 μL usando punte a bassa ritenzione su un vetrino per l'osservazione. Contare il numero di nematodi in 5 μL usando un microscopio a dissezione.<ol>
<li>Regolare la concentrazione a 2 vermi/μL utilizzando acqua distillata sterile. Utilizzando una pipetta multicanale e un trogolo, aggiungere 10 μL (~ 20 vermi) a ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti. NOTA: Circa 15.000 nematodi D. dipsaci saranno raccolti per piastra di coltura utilizzando il metodo di coltura e raccolta descritto. Venti worm sono usati per pozzo perché il piccolo numero facilita la chiara visualizzazione e contabilità di quelli mobili e immobili.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sigillare le piastre in pellicola da imballaggio da laboratorio e avvolgere con un tovagliolo di carta umido. Mettere in scatola e apporre su un cuscinetto appiccicoso in un'incubatrice a 20 °C a 200 giri/min. Assicurarsi che le piastre siano stabilizzate nella scatola aggiungendo un tovagliolo di carta extra umido per garantire un movimento minimo delle piastre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Raccolta e analisi dei dati
<ol><li>Osservare le piastre il giorno 5 al microscopio di dissezione. Contare il numero di dispositivi mobili e il numero totale di D. dipsaci nei controlli dei solventi DMSO e nei pozzi trattati con farmaci.<ol>
<li>Se i vermi sono relativamente immobili, aggiungere 2 μL di 1 M NaOH ad una concentrazione finale di 40 mM al pozzo per stimolare il movimento19,20. NOTA: Dopo aver aggiunto NaOH, i worm si muoveranno istantaneamente e dovranno essere visualizzati entro 5 minuti. Il numero di worm mobili e il numero totale di worm verranno utilizzati per calcolare la proporzione di worm mobili. La lunghezza del test può variare a seconda dello scopo dello schermo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcola la proporzione di worm mobili. Negli schermi D. dipsaci , i pozzi che hanno prodotto in modo riproducibile lo 0% di worm mobili sono classificati come colpi forti. NOTA: L'esposizione prolungata delle piastre sullo stadio dei microscopi di dissezione è evitata perché la sorgente luminosa può riscaldare le piastre e indurre effetti variabili sul biodosaggio.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Passaggi critici Nonostante la semplicità del protocollo, ci sono passaggi critici nel protocollo che meritano ulteriore attenzione per massimizzare la probabilità di successo. In primo luogo, l'esagerazione dei semi può interrompere la loro crescita. Pertanto, limitare il tempo dei semi nella soluzione sbiancante a 20 minuti o meno è essenziale. In secondo luogo, come precedentemente notato da Storelli et al., la salute apparente dei nematodi diminuisce nel tempo quando viene conservata a 4 °C16. L'uso dei nematodi subito dopo la loro raccolta fornisce ulteriore sicurezza che è possibile ottenere condizioni di screening ottimali. Se è necessaria una conservazione a lungo termine, assicurarsi che il coperchio del tubo non sia stretto per consentire lo scambio di ossigeno. In terzo luogo, garantire che i piselli crescano sulle piastre NA per il tempo suggerito consente allo sperimentatore di giudicare quali semi sono contaminati. In quarto luogo, la crescita eccessiva dei piselli sulle piastre GA prima di aggiungere i nematodi indebolirà l'infezione e ridurrà la resa dei nematodi. Infine, molti fattori difficili da controllare possono influire sui risultati dello screening. Pertanto, è essenziale eseguire più schermate di replica indipendenti in giorni diversi e idealmente con PPN raccolti da diverse piastre di coltura per garantire la riproducibilità dei risultati.
Limitazioni del metodo Una limitazione al protocollo è che non riesce a sincronizzare lo stadio di sviluppo dei vermi raccolti, che vanno dai giovani agli adulti. Quindi, i forti colpi rivelati da qualsiasi schermo sono probabilmente efficaci in più fasi. Tuttavia, il protocollo aumenta il rischio di trascurare efficaci colpi specifici dello stadio. Una seconda considerazione è che lo screening in vitro dovrebbe essere considerato il primo passo in una pipeline di scoperta di nematicidi; i saggi basati sul suolo sono un'eccellente aggiunta a una pipeline per testare la traducibilità dei colpi.
Significato e applicazione del protocollo I protocolli qui descritti sono semplici e facilmente replicabili. Inoltre, questo protocollo è stato applicato con successo ad altri PPN in laboratorio, tra cui Pratylenchus penetrans, apportando solo lievi modifiche. Lo sviluppo di nuove e sicure misure di controllo PPN è essenziale per garantire la sicurezza alimentare globale. Ciò è particolarmente vero per specie come D. dipsaci che sono generalmente tolleranti a un'ampia varietà di nematicidi chimici attualmente accettabili13,14. Pertanto, i protocolli qui delineati hanno il potenziale per dare un contributo importante alla salute umana su scala globale.

Si stima che i nematodi parassiti delle piante (PPN) siano responsabili della perdita del 12,3% della produzione alimentare globale e causino circa 157 miliardi di dollari di danni all'anno 1,2,3. Sfortunatamente, la capacità di controllare i PPN sta diminuendo perché sono stati vietati nematicidi chimici efficaci o stanno affrontando crescenti restrizioni a causa della sicurezza umana e delle preoccupazioni ambientali. Ciò è dovuto principalmente alla scarsa selettività dei nematodi delle precedenti generazioni di pesticidi4. Negli ultimi 25 anni, sei nuovi nematicidi chimici sono stati pilotati o introdotti sul mercato5. Uno di questi è già stato vietato in Europa, e un altro è stato interrotto mentre era indagato per il suo impatto sul calore umano 6,7. Quindi, c'è un urgente bisogno di nuovi nematicidi che siano altamente selettivi per i PPN.
Il nematode del gambo e del bulbo, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) è un PPN di impatto economico4. D. dipsaci infetta quasi 500 specie di piante in 30 razze biologiche e si rivolge ad alcune delle colture più importanti dal punto di vista agricolo come segale, avena, aglio, cipolla e porro 8,9. Ad esempio, D. dipsaci ha recentemente flagellato i campi di aglio in Ontario e Quebec, con conseguenti perdite fino al 90%10,11. La sua distribuzione geografica è quasi onnipresente e comprende le Americhe (tra cui California e Florida), l'Europa, gran parte dell'Asia (compresa la Cina) e l'Oceania9. D. dipsaci è un endoparassita migratore che entra negli stomi su foglie o ferite e lenticelle dove rilasciano enzimi per abbattere la parete cellulare12. Aggravando l'impatto di D. dipsaci sulle colture, il danno causato dal PPN rende la pianta suscettibile all'infezione secondaria11. Sfortunatamente, D. dipsaci mostra alti livelli di tolleranza agli attuali nematicidi rispetto ad altri ceppi di nematodi13,14.
Questo protocollo descrive la coltivazione di D. dipsaci e il suo uso in schermi su larga scala per nematicidi candidati a piccole molecole. In breve, le popolazioni di D. dipsaci vengono mantenute ed espanse su piante di pisello coltivate in mezzi sterili Gamborg B-5 (GA)15. Prima di coltivare germogli di semi su terreno GA, i semi devono essere sterilizzati attraverso una serie di lavaggi e placcati su agar nutriente (NA) per verificare la contaminazione. La sterilizzazione delle sementi è essenziale per rilevare i contaminanti batterici e fungini che possono essere presenti. I semi non contaminati vengono quindi trasferiti in piastre GA, dove i germogli di semi cresceranno in preparazione all'infezione. Le piastre GA contenenti germogli di semi sono infettate da nematodi da una piastra di coltura precedente trasferendo un pezzo di agar contenente tessuto radicale alle piastre fresche. Dopo 6-8 settimane, i nematodi vengono estratti dal mezzo GA e filtrati attraverso un imbuto rivestito di filtro del caffè in un becher di raccolta. I nematodi possono essere utilizzati in vari saggi biologici una volta raccolto un numero adeguato. La tecnica descritta in questo protocollo genera circa 15.000 D. dipsaci per piastra di coltura. Protocolli alternativi per coltivare D. dipsaci sono stati pubblicati16,17.
Qui viene anche descritto un test di screening in vitro di piccole molecole basato sul lavoro precedente18. Come proxy della salute dei vermi, la mobilità di 20 nematodi per pozzo viene esaminata dopo 5 giorni di esposizione a piccole molecole. Per visualizzare meglio la mobilità dei vermi, viene aggiunto NaOH per aumentare il movimento dei vermi vivi19,20. Questo protocollo consente lo screening a medio rendimento e fornisce dati preziosi per valutare il potenziale nematicidale di piccole molecole. Se si utilizza una diversa tecnica di raccolta dei nematodi16,17, la metodologia di screening delle piccole molecole qui descritta può comunque essere implementata.

<table><tbody><tr><td>Provetta da 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>2 pinze</td><td>Almedic</td><td>7747-A10-108</td><td></td></tr><tr><td>Becher da 2 litri</td><td>Pyrex</td><td>CLS10002L</td><td></td></tr><tr><td>becher da 50 mL</td><td>Pyrex</td><td>CLS100050</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>foglio di alluminio</td><td>Alcan Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agar batteriologico</td><td>BioShop</td><td>AGR001.5</td><td></td></tr><tr><td>filtro per caffè</td> Candeggina commerciale <td>716 di marca</td><td>716</td><td></td></tr><tr><td>6%</td><td>Lavo Pro 6</td><td>DIN102358107</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri usa e getta (10 cm x 1,5 cm)</td>Piastre <td></td> di Petri usa e getta FB0875712 <td></td><td>Fisherbrand</td></tr><tr><td>(10 cm x 2,5 cm)</td>Cannocchiale <td>da Z358762</td><td></td>per dissecazione <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>Leica MZ75</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imbuto</td><td>VWR</td><td>414004-270</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5893-10L</td><td></td></tr><tr><td>piastra di Petri in vetro</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>vetrino</td><td>MAGNA</td><td>60-1200</td><td></td></tr><tr><td>Carta assorbente senza lanugine</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 522-100</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette a bassa ritenzione (200uL)</td><td>Pipetta multicanale LABFORCE</td><td>1159M44</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf research plus</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>agar nutriente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70148-100G</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>semi di pisello</td><td>Ontario Seed Company</td><td>D-1995-250G</td><td></td></tr><tr><td>soluzioni per la pulizia dei perni</td><td>V & P Scientific</td><td>VP110A</td><td></td></tr><tr><td>pinner</td><td>V& P Scientific</td><td>VP381N</td><td></td></tr><tr><td>vaschette di risciacquo per pinner</td><td>V& Serbatoio reagenti P Scientific</td><td>VP 421</td><td></td></tr><tr><td>con coperchio per pipette multicanale Incubatore</td> con agitazione <td>BR703459</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick Scientific</td><td>I26</td><td></td></tr> lama <tr><td>chirurgica sterile</td><td>MAGNA</td><td>sb21-100-a</td><td></td></tr><tr><td>barra di agitazione</td><td>Fisherbrand</td><td>2109 - 1451359</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr></tbody></table>

coltivazione e screening del nematode parassita vegetale ditylenchus dipsaci

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

I nematodi parassiti delle piante (PPN) distruggono oltre il 12% delle colture alimentari globali ogni anno, il che equivale a circa 157 miliardi di dollari (USD) persi ogni anno. Con una popolazione globale in crescita e terreni coltivabili limitati, il controllo dell'infestazione da PPN è fondamentale per la produzione alimentare. Ad aggravare la sfida di massimizzare i raccolti ci sono le crescenti restrizioni sui pesticidi efficaci a causa della mancanza di selettività dei nematodi. Pertanto, lo sviluppo di nuovi e sicuri nematicidi chimici è vitale per la sicurezza alimentare. In questo protocollo, vengono dimostrate la coltura e la raccolta della specie PPN Ditylenchus dipsaci . D. dipsaci è sia economicamente dannoso che relativamente resistente alla maggior parte dei nematicidi moderni. Il lavoro attuale spiega anche come utilizzare questi nematodi negli schermi per nuovi nematicidi a piccole molecole e riferisce sulle metodologie di raccolta e analisi dei dati. La pipeline dimostrata offre una produttività di migliaia di composti a settimana e può essere facilmente adattata per l'uso con altre specie di PPN come Pratylenchus penetrans. Le tecniche qui descritte possono essere utilizzate per scoprire nuovi nematicidi, che possono, a loro volta, essere ulteriormente sviluppati in prodotti commerciali altamente selettivi che combattono in sicurezza i PPN per aiutare a nutrire un mondo sempre più affamato.

Le repliche indipendenti rivelano hit riproducibili Per illustrare la variazione prevista tra gli schermi di replica, le medie e la variazione della mobilità del campione sono tracciate da tre piastre rappresentative di una schermata recente (Figura 1). Tre repliche dello schermo sono state eseguite in tre giorni diversi. Tutte e tre le piastre hanno controlli negativi (solo solvente) (barre più scure) e i campioni all'interno del set contenevano nematicidi stabiliti. I composti rimanenti provengono da una libreria personalizzata attualmente in fase di caratterizzazione nel laboratorio Roy. Rispetto a schermi simili effettuati con C. elegans con le stesse molecole (SC, JK, PJR, risultati non pubblicati), il tasso di successo con D. dipsaci è significativamente inferiore e molte piastre di farmaci non mostrano alcuna attività (Figura 1A). Alcune piastre hanno colpi completamente riproducibili (Figura 1B, C), mentre altre variano in attività (Figura 1C). Rispetto ad altre specie sottoposte a screening (non mostrate), D. dipsaci mostra una minore variabilità nella sua risposta ai composti. Indipendentemente da ciò, le repliche sono considerate necessarie nell'identificazione di hit riproducibili.
I nematicidi variano nella loro capacità di immobilizzare Ditylenchus dipsaci Dei sette nematicidi caratterizzati testati contro D. dipsaci, solo Fluopyram mostra una robusta attività nel test qui descritto (Figura 1C). Ciò è coerente con il lavoro precedente che mostra che D. dipsaci è tollerante ai nematicidi13,14. Fluopyram inibisce il complesso II della catena di trasporto degli elettroni in modo nematode-selettivo ed è un nematicide commerciale utilizzato per controllare una varietà di PPN, tra cui Rotylenchulus reniformis e Meloidogyne incognita 4,21,22. Fluopyram e uno dei nematicidi privi di attività alla concentrazione testata (Oxamyl)23 sono stati studiati in modo più dettagliato attraverso un'analisi dose-risposta con D. dipsaci. Fluopyram induce un apparente effetto dose-dipendente sulla mobilità di D. dipsaci con un EC50 di 9,3 μM (con un intervallo di confidenza del 95% compreso tra 8,2 e 10,5 μM) (Figura 2A,B). Questo risultato è atteso sulla base dei risultati pubblicati in vitro da Storelli et al., 202013. L'oxamil non ha effetti significativi sulla mobilità fino a una concentrazione di 120 μM (p = 0,3632, t-test spaiato) (Figura 2C,D).
L'idrossido di sodio migliora la sensibilità al saggio In contrasto con l'attività di nuoto quasi continua di C. elegans nella coltura liquida18, gli animali D. dipsaci sono drammaticamente meno mobili. Questo non è raro tra i nematodi parassiti nella coltura16. Per aiutare a distinguere i vermi "a riposo" dai vermi malati, 40 mM di NaOH vengono utilizzati all'endpoint del test per stimolare il movimento in quegli individui che sono capaci (Figura 3) 19,20. Questa tecnica consente la chiara identificazione di piccole molecole che immobilizzano i vermi, dato che tutti i vermi nei pozzi di controllo negativo si muovono e producono uno sfondo eccezionalmente basso di falsi positivi nello schermo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig01v2.jpg"> Figura 1: Esempi di output dello schermo. Tre repliche biologiche (cerchi aperti) con D. dipsaci sono state eseguite contro le piccole molecole (60 μM) in ciascuna delle tre piastre mostrate. Tutte e tre le piastre hanno lo 0,6% dei controlli solo solvente DMSO (barre più scure). Salvo dove diversamente indicato con controlli di solventi o nematicidi noti, i pozzetti delle tre piastre contengono composti simili a farmaci relativamente insoliti acquistati da venditori (vedi Burns et al., 2015)18. (A) Una piastra a 96 pozzetti dalla libreria di piccole molecole manca di qualsiasi molecola con bioattività osservabile contro D. dipsaci. (B) Una piastra a 96 pozzetti dalla libreria di piccole molecole ha una singola molecola che interrompe in modo riproducibile la mobilità di D. dipsaci . (C) Una piastra di droga da 96 pozzi contenente i nematicidi caratterizzati fluopyram (fluo), iprodione (ipro), abamectina (abam), fluensulfone (canna fumaria), tioxazafen (tiox), oxamil (oxam) e wact-11. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig02.jpg"> Figura 2: Esempio di risultati positivi e negativi utilizzando il test di mobilità. (A) Esempi di fenotipi terminali dopo l'esposizione di D. dipsaci ad concentrazioni crescenti di fluopiram dopo 5 giorni prima dell'aggiunta di NaOH. (B) Un'analisi dose-risposta del movimento di D. dipsaci dopo 5 giorni di esposizione alle concentrazioni indicate di fluopiram. (C,D) Lo stesso di A, B, ad eccezione dell'oxamil. Ogni grafico mostra le prove eseguite in due giorni separati con tre repliche ogni giorno. L'asse y di ciascun grafico indica la frazione mobile dei vermi in ciascun pozzo calcolata come il numero di animali in movimento rispetto al numero totale di animali nel pozzo. Le barre di errore su entrambi i grafici rappresentano l'errore standard della media. La barra della scala rappresenta 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig03.jpg"> Figura 3: Mobilità di D. dipsaci dopo l'aggiunta di 40 mM di NaOH. L'effetto dell'aggiunta di NaOH ai campioni di D. dipsaci in presenza di controllo solo solvente (A), tioxazafen (B) o fluopyram (C) dopo 5 giorni di co-incubazione. La barra della scala rappresenta 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Il presente protocollo descrive un metodo affidabile e diretto per la coltivazione, la raccolta e lo screening di Ditylenchus dipsaci.

Coltivazione e screening del nematode parassita vegetale Ditylenchus dipsaci

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With ...

Questo protocollo consente la scoperta di nuovi nematicidi per combattere diTylenchus dipsaci mediante la tecnica di coltivazione e schermi chimici di medio rendimento. La semplicità di questa tecnica consente lo screening di migliaia di composti a settimana per identificare composti con potenziale nematicidale. Questa tecnica può identificare nuovi composti per uccidere i nematodi parassiti delle piante delle colture e, quindi, aumentare l'offerta alimentare globale.Per iniziare, preparare 500 millilitri di agar nutriente, o NA media, con 23 grammi per litro di NA e acqua ultrapura. Usando la tecnica sterile, versare 25 millilitri di media NA autoclavati in 20 piastre di Petri monouso da 100 millimetri di diametro e 15 millimetri di profondità. Preparare 500 millilitri di Gamborg B5, o mezzi GA, contenenti 3,2 grammi per litro di mezzo basale GA con sostanze organiche minime, 20 grammi per litro di saccarosio, 15 grammi per litro di agar e acqua distillata.Usando la tecnica sterile, versare 50 millilitri di mezzi GA autoclavati in 10 piastre di Petri usa e getta. Per eseguire la sterilizzazione dei semi, versare 150 semi di pisello in un becher sterile da due litri con una barra di agitazione vicino a una fiamma del bruciatore Bunsen su un banco da laboratorio. Aggiungere 200 millilitri di etanolo al 95% ai semi e mescolare vigorosamente sulla piastra per cinque minuti.Quindi, versare l'etanolo in un contenitore per i rifiuti. Versare la soluzione di candeggina nel becher per immergere completamente i semi. Mescolare energicamente su un piatto per 20 minuti.Quindi, versare la candeggina in un contenitore per i rifiuti. Versare acqua distillata nel becher per immergere i semi e mescolare vigorosamente su un piatto per 20 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio con acqua, versare i semi sterilizzati nella capsula di Vetro di Petri.Per verificare la contaminazione, trasferire sei semi in ogni piastra NA da 10 centimetri nella cappa a flusso laminare utilizzando una pinza sterilizzata. Disporre i semi attorno alla circonferenza della piastra. Avvolgere le piastre singolarmente in pellicola da imballaggio da laboratorio e incubarle al buio per tre giorni a 26 gradi Celsius.In una cappa a flusso laminare, placcare due semi non contaminati su ciascuna piastra GA con pinza sterilizzata. Incubare a temperatura ambiente per 7-10 giorni per consentire ai semi di germogliare. Preparare 50 millilitri di soluzione di saccarosio da 20 grammi per litro.Filtrare sterilizzare la soluzione di saccarosio e mettere da parte. In una cappa a flusso laminare, tagliare un pezzo di agar contenente tessuto radicale da una piastra di coltura esistente. Pipettare 500 microlitri di soluzione di saccarosio su una nuova piastra GA con piantine di piselli e posizionare un cubo di agar sopra il saccarosio.Mantenere la coltura in una scatola rivestita con un foglio di alluminio a temperatura ambiente. Per mantenere la cultura, sottoculturare i nematodi su piastre GA fresche ogni otto-nove settimane. I nematodi sono pronti per essere estratti dopo circa otto settimane.In un cappuccio a flusso laminare, tagliare l'agar e il tessuto radicale in cubetti di un centimetro con un bisturi sterile. Trasferire i cubetti di agar nell'imbuto rivestito di filtro del caffè e versare lentamente acqua distillata sull'agar per inumidire il filtro del caffè. Rimuovere l'imbuto rivestito con filtro per caffè dal becher e riempire il becher con acqua distillata fino a quando il livello dell'acqua non tocca il fondo del filtro una volta sostituito l'imbuto rivestito con filtro per caffè.Coprire l'imbuto e il becher rivestiti con filtro per caffè con un foglio di alluminio. Per raccogliere i vermi, rimuovere l'imbuto rivestito di filtro del caffè e aspirare i primi 40 millilitri di acqua dal becher di raccolta, senza interrompere i vermi depositati. Raccogliere il liquido rimanente in un tubo centrifugo conico da 15 millilitri con una pipetta sierologica in plastica da 10 millilitri.Per preparare le piastre di analisi, versare acqua distillata in autoclave in un trogolo sterile ed erogare 40 microlitri di acqua distillata dal trogolo in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti con una pipetta multicanale. Aggiungere sostanze chimiche dalle piastre di riserva chimica a 96 pozzetti alle piastre di analisi appuntando tre volte nella piastra chimica. Quindi, trasferire i perni 10 volte nella piastra di analisi.Tamponare sulla carta davanti alla soluzione detergente. Per contare il numero di nematodi della raccolta, in primo luogo, sospendere nuovamente la raccolta e quindi pipettare cinque microlitri della soluzione utilizzando punte a bassa ritenzione su un vetrino. Contare il numero di nematodi in cinque microlitri usando un microscopio a dissezione.Quindi, regolare la concentrazione a due vermi per microlitro utilizzando acqua distillata sterile. Quindi, aggiungere 10 microlitri del campione a ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti con una pipetta multicanale e un trogolo. Avvolgere i piatti con un tovagliolo di carta umido e metterli in una scatola.Quindi, aggiungere un tovagliolo di carta extra umido per stabilizzare e garantire il minimo movimento delle piastre e apporre su un cuscinetto appiccicoso in un incubatore di scuotimento a 20 gradi Celsius impostato su 200 RPM. Osserva le piastre il quinto giorno al microscopio sezionante. Contare il numero di D.dipsaci mobili e totali nei controlli dei solventi DMSO e nei pozzi trattati con farmaci.Se i vermi sono immobili, aggiungere due microlitri di idrossido di sodio monofusolare ad una concentrazione finale di 40 millimolari al pozzo per stimolare il movimento. Calcola la proporzione di worm mobili. Negli schermi D.dipsaci, i pozzi che hanno prodotto in modo riproducibile lo 0% di worm mobili sono classificati come colpi forti.Tre diverse piastre di droga sono state sottoposte a screening a una concentrazione di 60 micromolari, dove ogni piastra di farmaco ha tre repliche biologiche. Tutte e tre le piastre includevano il 6% dei controlli solo solvente DMSO. Molte piastre contenenti farmaci della libreria di piccole molecole mancavano di qualsiasi molecola con bioattività osservabile contro D.dipsaci.Alcune placche avevano colpi completamente riproducibili, mentre altre contenenti nematicidi caratterizzati variavano nella loro attività. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Qui, fluopyram ha mostrato una robusta attività nel test.Fluopyram ha indotto un apparente effetto dose-dipendente sulla mobilità D.dipsaci con un EC50 di 9,3 micromolari. L'oxamil non ha avuto effetti significativi sulla mobilità fino a una concentrazione di 120 micromolari. L'oxamil non ha avuto alcun effetto significativo sulla mobilità fino a una concentrazione di 120 micromolari.L'aggiunta di idrossido di sodio ha migliorato la sensibilità del saggio nel rilevare vermi immobili. 40 millimolari di idrossido di sodio sono stati utilizzati come endpoint del test per stimolare il movimento in individui capaci e, quindi, distinguere i vermi a riposo dai vermi malati. Questo protocollo ha permesso l'identificazione di composti con nuovi meccanismi d'azione contro D.dipsaci e altre specie.

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Coltivazione e screening del nematode parassita vegetale Ditylenchus dipsaci

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