Optrode Array per la modulazione optogenetica simultanea e la registrazione neurale elettrica
1 settembre 2022
Qui, presentiamo il metodo di fabbricazione di un sistema optrode con fibre ottiche per l'erogazione della luce e un array di elettrodi per la registrazione neurale. Esperimenti in vivo con topi transgenici che esprimono channelrhodopsin-2 mostrano la fattibilità del sistema per la stimolazione optogenetica simultanea e la registrazione elettrofisiologica.
Questo protocollo include la fabbricazione su sistema optrode per la stimolazione optogenetica simultanea e la registrazione elettrofisiologica. Il sistema basato su LED proposto migliora l'efficienza di accoppiamento della luce attraverso un array di microlenti. Una sorgente luminosa a LED ha una semplice configurazione dell'illuminazione rispetto a una sorgente di luce laser in modo che il sistema sia facilmente applicabile al sistema wireless.
L'optogenetica è una tecnica di percorso per comprendere la patologia delle malattie neurologiche e i meccanismi di trattamento. L'optogenetica può essere applicata per trattare lesioni del midollo spinale, epilessia, morbo di Parkinson e morbo di Alzheimer. Il nostro dispositivo basato su LED può essere ulteriormente implementato come sistema wireless con diversi vantaggi, come bassa complessità del sistema, economicità e basso consumo energetico.
Innanzitutto, collegare il connettore femmina con passo di 1,27 millimetri al preamplificatore dello stadio principale. Posizionare il LED nell'alloggiamento stampato in 3D. Misurare l'intensità della luce all'estremità della punta della fibra ottica utilizzando un fotodiodo.
Immergere gli elettrodi di tungsteno e le fibre ottiche in alcool per 15 minuti e asciugarli all'aria. Rasare la pelle della testa e posizionare il mouse anestetizzato nella cornice stereotassica. Posizionare la testa all'interno della cornice stereotassica e inserire le barre auricolari nel meato.
Accendere la piastra riscaldante termica incorporata nel telaio stereotassico e mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius durante le procedure chirurgiche. Regolare la barra di incisione per impostare l'altezza della barra di incisione e stringere il morsetto del naso contro il muso. Coprire gli occhi con vaselina per prevenire la secchezza.
Sollevare la pelle della testa con una pinza, fissare uno spazio di iniezione e iniettare l'1% di lidocaina sotto il cuoio capelluto. Eseguire un'incisione sagittale utilizzando un bisturi e forbici fini. Tenere la pelle incisa con un microclamp per ampliare la visibilità dell'area chirurgica.
Rimuovere il periostio con tamponi di cotone. Se c'è sanguinamento, cauterizzato il cranio usando un bovie per sigillare i vasi sanguigni. Pulire il cranio con soluzione salina e contrassegnare i siti di craniotomia utilizzando un braccio manipolatore.
Praticare un foro sopra il cervelletto e inserire una vite per il terreno. Usando una vite di precisione, metti la vite di terra profonda 0,5 millimetri fino a raggiungere la parte superiore del cervelletto. Forare l'area contrassegnata e rimuovere un pezzo del cranio con una pinza.
Piegare la punta di un ago calibro 26 in senso orario con un angolo di 120 gradi ed esporre l'area del cervello inserendo il lato smussato dell'ago rivolto verso l'alto. Fissare l'array optrode nel braccio del manipolatore e avvicinarsi all'area esposta. Inserire lentamente l'array optrode e collegare la vite di terra al filo d'argento collegato al sistema.
Inserire schiuma di gel tra il cervello esposto e il dispositivo per proteggere le sostanze chimiche dal contatto diretto con il cervello. Applicare con attenzione il cemento dentale sul cranio per fissare il dispositivo e coprire la schiuma gel. Prima che il cemento dentale sia completamente indurito, separare il cuoio capelluto se attaccato al cemento dentale.
Tirare la pelle incisa con una pinza per coprire il cemento dentale indurito e suturare il cuoio capelluto. Posizionare il mouse anestetizzato nella cornice stereotassica. Impostare la ricetta dell'impulso luminoso su 4% duty cycle in frequenza 10 Hertz.
Impostare la stimolazione luminosa per due secondi durante la registrazione neurale. Togliere il coperchio in plastica e fissare la parte superiore dei sistemi di erogazione della luce con il LED riutilizzabile nei circuiti. Collegare il preamplificatore dello stadio di testa al connettore a cinque pin impiantato.
Aprire il software e impostare i filtri software. Quindi, fare clic e impostare la frequenza di campionamento dell'amplificatore. Quindi fare clic su Cambia larghezza di banda.
Impostare la larghezza di banda inferiore dell'amplificatore e la larghezza di banda superiore dell'amplificatore. Controllare il software DAC High-Pass Filter. Apri Spike Scope e controlla i segnali neurali utilizzando la soglia di tensione.
Fare clic su Interrompi e registra. Carica i dati acquisiti utilizzando MATLAB e controlla i dati grezzi. Quindi eseguire il codice di ordinamento spike che contiene l'algoritmo wave clust.
Controlla i picchi ordinati nella trama raster. Ora traccia i picchi di conteggio e controlla i picchi evocati durante la stimolazione della luce. La figura mostra intere forme d'onda registrate con condizioni esatte, tra cui due secondi di luce sul periodo nel mezzo.
Il numero di singoli picchi neurali evocati dopo ogni impulso di stimolazione luminosa è aumentato significativamente rispetto alla linea di base con diversi contenitori temporali di due secondi e 0,2 secondi. La figura mostra un istogramma spike per ogni canale prima, durante e dopo la stimolazione luminosa. La figura dell'inserto indica la posizione dell'array di optrode impiantato.
Inoltre, la versione ingrandita mostra un istogramma spike con un cestino temporale di 100 millisecondi. La barra blu rappresenta il periodo di tempo in cui la spia LED era accesa per registrare la risposta. Per ridurre al minimo il rumore dell'artefatto dal processo di corrente di guida del LED, il sistema deve essere progettato per garantire una distanza sufficiente tra il percorso del segnale elettrico e il circuito LED.
Il sistema optrode basato su LED proposto può studiare i vari segnali neuro relativi ai comportamenti degli animali perché può fornire stimolazione optogenetica e registrare le risposte neuro evocate. Un array di optrode LED è compatibile con l'interfaccia optogenetica wireless, che può essere utilizzata nella ricerca sugli animali in libera circolazione.
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Panoramica
Questo studio presenta un nuovo sistema di optrodi che integra fibre ottiche per la somministrazione della luce e un array di elettrodi per la registrazione neurale. La fattibilità di questo sistema è dimostrata mediante esperimenti in vivo condotti su topi transgenici che esprimono la channelrodopsina-2, consentendo una stimolazione optogenetica e una registrazione elettrofisiologica simultanee.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Optogenetica
Sfondo
- La optogenetica è una tecnica per comprendere le malattie neurologiche.
- Lo studio mira a potenziare le capacità di registrazione neurale.
- I sistemi senza fili sono fondamentali per applicazioni più ampie nell'optogenetica.
- I LED offrono vantaggi rispetto ai laser in termini di semplicità e costo.
Scopo dello studio
- Realizzare un sistema di optrodi efficiente per la stimolazione luminosa e la registrazione.
- Indagare le risposte neurali correlate alla stimolazione ottica.
- Dimostrare l'applicabilità del sistema in animali liberi di muoversi.
Metodi Utilizzati
- È stato sviluppato un sistema di optrodi basato su LED per un funzionamento simultaneo.
- Topi transgenici esprimenti la channelrodopsina-2 sono stati utilizzati come modello biologico.
- Gli esperimenti in vivo hanno comportato procedure chirurgiche per posizionare il dispositivo.
- Sono state effettuate misurazioni dell'intensità luminosa e diverse manipolazioni chirurgiche.
- L'acquisizione dei dati, inclusa la classificazione e l'analisi dei potenziali d'azione neurali, è stata eseguita utilizzando MATLAB.
Risultati principali
- Lo studio rivela un aumento dei potenziali d'azione neurali evocati durante la stimolazione luminosa rispetto al valore basale.
- Sono stati registrati incrementi significativi nei potenziali d'azione neurali singoli in seguito agli impulsi luminosi.
- Mostra il potenziale di questo sistema nello studio della segnalazione neurologica associata alle risposte comportamentali.
- Il sistema riduce al minimo il rumore di artefatto grazie al suo design e alla sua configurazione.
Conclusioni
- Questo studio dimostra che il sistema di optrodi basato su LED combina efficacemente stimolazione optogenetica e registrazione neurale.
- I risultati mostrano un potenziale per l'applicazione nella ricerca di vari fenomeni neurobiologici.
- Le implicazioni includono l'indagine dei meccanismi di patologia e trattamento delle condizioni neurologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La modulazione optogenetica simultanea e la registrazione elettrica neurale soddisfano un'esigenza fondamentale di interrogazione in tempo reale e specifica per tipo cellulare dei circuiti neurali nella ricerca neuroscientifica preclinica e nella neurofarmacologia&D. Questa piattaforma integrata con array di optrodi consente una mappatura precisa della risposta neuronale a stimolazioni mirate, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici e aumentando la fiducia predittiva nella validazione precoce di bersagli del sistema nervoso centrale. L'approccio migliora la continuità traslazionale fornendo dati quantitativi sull'attività neuronale temporizzati in modelli animali pertinenti alla malattia.
Applicazioni Strategiche nella Biotecnologia Farmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la verifica diretta di ipotesi terapeutiche collegando la modulazione optogenetica a risultati elettrofisiologici.
- Supporta la validazione funzionale delle target mediante attivazione o inibizione selettiva di popolazioni neuronali definite geneticamente.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica correlando l'attività del circuito neurale con l'intervento candidato.
- Fornisce dati quantitativi risolti nel tempo per informare le decisioni di triage del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture neurali validate e riproducibili per flussi di lavoro di screening di composti successivi.
- Standardizza le condizioni del saggio integrando modalità ottiche ed elettriche in un singolo dispositivo impiantabile.
- Consente misurazioni quantitative ad alta fedeltà di potenziali d'azione neurali evocati per una valutazione affidabile dei composti.
- Supporta la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma su diversi bersagli e modelli del sistema nervoso centrale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le misurazioni dell'attività neurale preclinica a endpoint pertinenti alla malattia in modelli animali.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo letture funzionali in vivo.
- Riduce il rischio traslazionale supportando l'allineamento dei biomarcatori e la comprensione meccanicistica.
- Facilita decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, basate su dati quantitativi di risposta neurale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma di array optrodici si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, collegando studi meccanicistici precoci e validazione traslazionale nella ricerca sul sistema nervoso centrale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la modulazione e la registrazione selettiva delle attività neurali.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili dell'attività neurale per lo sviluppo di saggi e lo screening di composti.
- Analisi: Fornisce dati di picchi sincronizzati temporalmente e output statistici per il confronto tra condizioni e il supporto decisionale.
- Ricerca traslazionale: Collega l'attività neurale in vivo ai modelli di malattia, supportando l'allineamento di biomarcatori e endpoint.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare e riutilizzabile, adattabile a diversi bersagli del sistema nervoso centrale e modelli animali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro per la registrazione neurale.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati funzionali solidi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di programmi per il sistema nervoso centrale basate su endpoint neurali quantitativi, adeguati al rischio.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze specifiche in optogenetica, elettrofisiologia e chirurgia animale per l'implantazione del dispositivo e l'acquisizione dei dati.
- Necessita di strumentazione per la somministrazione precisa della luce, l'amplificazione dei segnali neurali e l'analisi del sorting dei picchi.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai protocolli di stimolazione e alle procedure di analisi dei dati.
- È adattabile a diversi modelli di roditori che esprimono opsine, ma può richiedere un'ottimizzazione dei protocolli per diverse aree cerebrali o tipi cellulari.
- Sono necessarie strategie di riduzione degli artefatti per distinguere gli artefatti di stimolazione ottica dai veri segnali neurali.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:13
Preparation of an Optrode Array
1:39
Presurgical Preparation of Animal and Implantation Surgery
3:45
Setting Parameters and Conducting Optogenetic Stimulation, Electrophysiological Recording, and Data Analysis
4:55
Results: Electrophysiological Recording
5:40
Conclusion
