Name: In tempo reale, a due colori stimolato Raman Scattering Imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Scopri la microscopia SRS a fuoco spettrale per l'istologia Raman stimolata in tempo reale su tessuto cerebrale di topo. Questo metodo senza etichette consente diagnosi rapide senza colorazione.

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<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse.

Lo schema di imaging SRS a due colori presentato in questo protocollo dipende dalla corretta implementazione dell'imaging SRS monocolore. Nell'imaging SRS a un colore, i passaggi critici sono l'allineamento spaziale, l'allineamento temporale, la profondità di modulazione e lo sfasamento. La combinazione spaziale dei due fasci è realizzata da uno specchio dicroico. Diversi specchi dello sterzo vengono utilizzati per la regolazione fine quando si inviano i raggi allo specchio dicroico. Una volta che i fasci sono combinati ...

La diagnostica tissutale tradizionale si basa su protocolli di colorazione seguiti da un esame al microscopio ottico. Un metodo di colorazione comune utilizzato dai patologi è la colorazione H & E: l'ematossilina colora i nuclei cellulari di un blu violaceo e l'eosina colora la matrice extracellulare e il citoplasma rosa. Questa semplice colorazione rimane il gold standard in patologia per molti compiti di diagnosi tissutale, in particolare la diagnosi del cancro. Tuttavia, l'istopatologia H& E, in particolare la tecnica di sezionamento congelato utilizzata in un ambiente intraoperatorio, ha ancora dei limiti. La procedura di colorazione è un processo laborioso che coinvolge l'incorporamento del tessuto, il sezionamento, la fissazione e la colorazione1. Il tempo di consegna tipico è di 20 minuti o più. L'esecuzione di H & E durante il sezionamento congelato a volte può diventare più impegnativa quando più sezioni vengono elaborate contemporaneamente a causa della necessità di valutare le caratteristiche cellulari o i modelli di crescita in 3D per la valutazione del margine. Inoltre, le tecniche istologiche intraoperatorie richiedono tecnici e clinici specializzati. La limitazione del numero di patologi certificati in molti ospedali è un vincolo per la consultazione intraoperatoria in molti casi. Tali limitazioni possono essere alleviate con gli interessi di rapido sviluppo nella patologia digitale e nella diagnosi basata sull'intelligenza artificiale2. Tuttavia, i risultati della colorazione H & E sono variabili, a seconda dell'esperienza del tecnico, il che presenta ulteriori sfide per la diagnosi basata su computer2.
Queste sfide possono potenzialmente essere affrontate con tecniche di imaging ottico senza etichetta. Una di queste tecniche è la microscopia SRS. SRS utilizza laser pulsati sincronizzati ( pompa e Stokes - per eccitare le vibrazioni molecolari con alta efficienza3. Recenti rapporti hanno dimostrato che l'imaging SRS di proteine e lipidi può generare immagini equivalenti A&E (note anche come istologia Raman stimolata o SRH) con tessuto fresco intatto, che bypassa la necessità di qualsiasi elaborazione tissutale, riduce significativamente il tempo necessario per la diagnosi ed è stato adattato intraoperatoriamente4. Inoltre, l'imaging SRS può fornire immagini 3D, che offrono informazioni aggiuntive per la diagnosi quando le immagini 2D sono insufficienti5. SRH è imparziale e genera immagini digitali che sono prontamente disponibili per la diagnosi basata su computer. Emerge rapidamente come una possibile soluzione per la diagnosi intraoperatoria del cancro e l'analisi del margine tumorale, specialmente nel cancro al cervello 6,7,8. Più recentemente, l'imaging SRS dei cambiamenti chimici del tessuto è stato anche suggerito per fornire utili informazioni diagnostiche che possono ulteriormente aiutare i medici a stratificare diversi tipi di cancro o stadi9.
Nonostante il suo enorme potenziale nelle applicazioni di diagnosi tissutale, l'imaging SRS è per lo più limitato ai laboratori accademici specializzati in ottica a causa della complessità associata alla piattaforma di imaging, che include laser ultraveloci, il microscopio a scansione laser e sofisticata elettronica di rilevamento. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro dettagliato per dimostrare l'uso di una comune sorgente laser a femtosecondi per l'imaging SRS a due colori in tempo reale e la generazione di immagini pseudo-H & E dal tessuto cerebrale del topo. Il protocollo riguarderà le seguenti procedure:
Allineamento e ottimizzazione del cinguettio La maggior parte degli schemi di imaging SRS utilizza laser a picosecondi o femtosecondi come fonte di eccitazione. Con i laser a femtosecondi, la larghezza di banda del laser è molto più grande della larghezza di linea Raman. Per superare questa limitazione, viene utilizzato un approccio di messa a fuoco spettrale per cinguettare i laser a femtosecondi su una scala temporale di picosecondi per ottenere una risoluzione spettrale ristretta10. La risoluzione spettrale ottimale si ottiene solo quando il cinguettio temporale (noto anche come dispersione del ritardo di gruppo o semplicemente dispersione) è correttamente abbinato per la pompa e i laser Stokes. La procedura di allineamento e i passaggi necessari per ottimizzare la dispersione dei raggi laser utilizzando barre di vetro altamente dispersive sono dimostrati qui.
Calibrazione della frequenza Un vantaggio della messa a fuoco spettrale SRS è che l'eccitazione Raman può essere rapidamente regolata modificando il ritardo temporale tra la pompa e i laser Stokes. Tale sintonizzazione offre immagini veloci e un'acquisizione spettrale affidabile rispetto alla sintonizzazione delle lunghezze d'onda laser. Tuttavia, la relazione lineare tra frequenza di eccitazione e ritardo temporale richiede una calibrazione esterna. I solventi organici con picchi Raman noti vengono utilizzati per calibrare la frequenza Raman per la messa a fuoco spettrale SRS.
Imaging a due colori in tempo reale È importante aumentare la velocità di imaging nelle applicazioni di diagnosi tissutale per ridurre il tempo necessario per l'analisi di campioni di tessuto di grandi dimensioni. L'imaging SRS simultaneo a due colori di lipidi e proteine evita la necessità di sintonizzare il laser o il ritardo temporale, il che aumenta la velocità di imaging di oltre due volte. Ciò si ottiene utilizzando una nuova tecnica di modulazione ortogonale e demodulazione a doppio canale con un amplificatore lock-in11. Questo articolo descrive il protocollo per la modulazione ortogonale e l'acquisizione di immagini a doppio canale.
Imaging SRS in modalità Epi La maggior parte delle immagini SRS mostrate fino ad oggi viene eseguita in modalità di trasmissione. L'imaging in modalità epi rileva i fotoni retrodiffusi dal tessuto12. Per le applicazioni di patologia, i campioni chirurgici possono essere piuttosto grandi. Per l'imaging in modalità di trasmissione, è spesso necessario il sezionamento dei tessuti, che richiede indesiderabilmente tempo extra. Al contrario, l'imaging in modalità epi può funzionare con campioni chirurgici intatti. Poiché lo stesso obiettivo viene utilizzato per raccogliere la luce retrodiffusa, non è inoltre necessario allineare un condensatore ad alta apertura numerica necessario per l'imaging della trasmissione. La modalità Epi è anche l'unica opzione quando il sezionamento dei tessuti è difficile, come con l'osso. In precedenza abbiamo dimostrato che per il tessuto cerebrale, l'imaging in modalità epi offre una qualità di imaging superiore per lo spessore del tessuto > 2 mm13. Questo protocollo utilizza uno splitter a fascio polarizzatore (PBS) per raccogliere fotoni sparsi depolarizzati dal tessuto. È possibile raccogliere più fotoni con un rivelatore anulare a scapito della complessità del gruppo rivelatore personalizzato12. L'approccio PBS è più semplice da implementare (simile alla fluorescenza), con il fotodiodo standard già utilizzato per il rilevamento della modalità di trasmissione.
Generazione di immagini Pseudo-H&E Una volta raccolte le immagini SRS a due colori, possono essere ricolorate per simulare la colorazione H & E. Questo documento dimostra la procedura per convertire le immagini SRS lipidiche e proteiche in immagini SRS pseudo-H & E per applicazioni patologiche. Il protocollo sperimentale descrive in dettaglio i passaggi critici necessari per generare immagini SRS di alta qualità. La procedura mostrata qui non è solo applicabile alla diagnosi tissutale, ma può anche essere adattata per molte altre applicazioni di imaging SRS iperspettrale come l'imaging farmacologico e l'imaging metabolico14,15.
Requisiti generali di sistema Il sistema laser per questo protocollo deve essere in grado di emettere 2 raggi laser sincronizzati a femtosecondi. I sistemi sono idealmente dotati di un oscillatore parametrico ottico (OPO) per la sintonizzazione ad ampia lunghezza d'onda di uno dei raggi laser. La configurazione di questo protocollo utilizza un sistema laser commerciale Insight DS + che emette due laser (un raggio fisso a 1.040 nm e un raggio sintonizzabile basato su OPO, che va da 680 a 1.300 nm) con una frequenza di ripetizione di 80 MHz. I microscopi a scansione laser, sia dei principali produttori di microscopi che costruiti in casa, possono essere utilizzati per l'imaging SRS. Il microscopio utilizzato è un microscopio a scansione laser verticale costruito sopra un telaio per microscopio verticale commerciale. Una coppia di specchi galvo da 5 mm viene utilizzata per scansionare il raggio laser. Per gli utenti che scelgono di adottare un microscopio a scansione laser costruito in casa, fare riferimento a un protocollo precedentemente pubblicato per la costruzione di un microscopio a scansione laser16.

<table><tbody><tr><td>Obiettivo acromatico da 100 mm</td><td>THORLABS</td><td>AC254-100-B</td><td>Banda larga, 650 - 1.050 nm, lunghezza focale dell'obiettivo acromatico, 100 mm</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda 20 MHz</td><td>Minicircuiti</td><td>BBP-21.4+</td><td>Filtro passa banda LC concentrato, 19,2 - 23,6 MHz, 50 e Omega;</td></tr><tr><td>Lente acromatica da 200 mm</td><td>THORLABS</td><td>AC254-200-B</td><td>Banda larga, 650 - 1.050 nm, lunghezza focale lente acromatica, 200 mm</td></tr><tr><td>Mezza piastra d'onda acromatica</td><td>Union Optic</td><td>WPA2210-650-1100-M25.4</td><td>Mezza piastra d'onda a banda larga Quarto d'onda</td></tr><tr><td>acromatico</td><td>Union Optic</td><td>WPA4210-650-1100-M25.4</td> Campionatore di fasci a <td>banda larga a quarto di piastra d'onda</td></tr><tr><td></td><td>THORLABS</td><td>BSN11</td><td>10:90 Beamsplitter a piastre</td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>THORLABS</td><td>DMSP1000</td><td>È possibile utilizzare altri dicroici con una lunghezza d'onda centrale di circa 1.000 nm.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimetilsolfossido)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>Solvente per la calibrazione dello spostamento Raman. Possono essere utilizzati altri solventi con picchi Raman noti.</td></tr><tr><td>Modulatore di ampiezza elettroottico</td><td>THORLABS</td><td>EO-AM-NR-C1</td><td>Per la modulazione ortogonale e l'imaging a doppio canale sono necessarie due EOM. Si consiglia la versione risonante in modo da poter utilizzare una tensione di pilotaggio inferiore.</td></tr><tr><td>Falso H& Script di colorazione</td><td>Matlab</td><td></td><td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td></tr><tr><td>Fanout Buffer</td><td>PRL-414B</td><td>Pulse Research Lab</td><td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer e driver di linea, per generare la frequenza di pilotaggio EOM e il riferimento al</td></tr><tr><td>fotodiodo veloce</td> lock-in <td>THORLABS</td><td>DET10A2</td><td>Si Detector, 1 ns Rise Time</td></tr><tr><td>Frequency Divider</td><td>PRL-220A</td><td>Pulse Research Lab</td><td>Divisore (f/2, f/4, f/8, f/16), per generare 20 MHz dall'uscita laser.</td></tr><tr><td>Barre di vetro ad alta dispersione</td><td>Union Optic</td><td>CYLROD01</td><td>Lente ad asta H-ZF52A ad alta dispersione 120 mm, lente ad asta SF11 100 mm</td></tr><tr><td>Sistema laser Insight DS+</td><td>Newport</td><td></td><td>in grado di emettere due laser pulsati sincronizzati (un raggio fisso a 1.040 nm e un raggio sintonizzabile, che varia da 680-1.300 nm) con una frequenza di ripetizione di 80 MHz.</td></tr><tr><td>Amplificatore Lock-in</td><td>Strumenti liquidi</td><td>Moku Lab</td><td>Amplificatore lock-in per estrarre il segnale SRS dal fotodiodo. È possibile utilizzare anche uno Zurich Instrument HF2LI o uno strumento simile.</td></tr><tr><td>Specchi</td><td>THORLABS</td><td>BB05-E03-10</td><td>Specchio dielettrico a banda larga, 750 - 1.100 nm. Possono essere utilizzati anche specchi d'argento.</td></tr><tr><td>Stadio di ritardo motorizzato</td><td>Zaber</td><td>X-DMQ12P-DE52</td><td>Stadio di ritardo per il controllo preciso della sovrapposizione temporale della pompa e dei laser Stokes. Qualsiasi altro stadio motorizzato dovrebbe funzionare.</td></tr><tr><td>Condensatore ad immersione in olio</td><td>Nikon</td><td>CSC1003</td><td>1.4 NA. È possibile utilizzare altri condensatori con NA>1.2.</td></tr><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Tektronix TDS7054</td><td></td><td>Qualsiasi altro oscilloscopio con banda di 400 MHz o superiore dovrebbe funzionare.</td></tr><tr><td>Sfasatore</td><td>SigaTek</td><td>SF50A2</td><td>Per lo spostamento della fase della frequenza di modulazione</td></tr><tr><td>Fotodiodo</td><td>Hamamatsu Corp</td><td>S3994-01</td><td>Diodo PIN al silicio con ampia area (10 x 10 cm2). È possibile utilizzare altri diodi con ampia area e bassa capacità.</td></tr><tr><td>Beam Splitter</td><td>polarizzatore Union Optic</td><td>PBS9025-620-1000</td><td>Beamsplitter polarizzatore a banda larga</td></tr><tr><td>Refactive Index Database</td><td></td><td></td><td>refractiveindex.info</td></tr><tr><td>Retro-riflettore</td><td>Edmund Optics</td><td>34-408</td><td>BBAR Prisma ad angolo retto. È possibile utilizzare altri prismi o retroriflettori.</td></tr><tr><td>Amplificatore di potenza RF</td><td>Minicircuiti</td><td>ZHL-1-2W+</td><td>Blocco di guadagno, 5 - 500 MHz, 50 &Omega;</td></tr><tr><td>Specchi di scansione</td><td>Cambridge Technologies</td><td>6215H</td><td>Abbiamo utilizzato un set di specchi da 5 mm con rivestimento in argento</td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio</td><td>ScanImage Software di controllo del</td><td>microscopio a scansione laser</td>di base</tr><tr><td>Filtro passa-corto</td><td>THORLABS</td><td>FESH1000</td><td>Filtro passa-corto Premium da 25,0 mm, lunghezza d'onda: 1.000 nm. Per un'efficiente soppressione degli Stokes, potrebbero essere necessari due filtri.</td></tr><tr><td>Microscopio verticale</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi altro telaio per microscopio. Se è disponibile un microscopio a scansione laser, può essere utilizzato direttamente. In caso contrario, era necessario aggiungere al microscopio uno scanner galvo e una lente di scansione.</td></tr><tr><td>Obiettivo ad immersione in acqua</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2 L'obiettivo</td><td>multifotone 25X ha un NA di 1,05. Altri obiettivi simili possono essere utilizzati.</td></tr></tbody></table>

in tempo reale, a due colori stimolato raman scattering imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) è emersa come una potente tecnica di imaging ottico per la diagnosi dei tessuti. Negli ultimi anni, la SRS a due colori ha dimostrato di essere in grado di fornire immagini equivalenti a ematossilina ed eosina (H & E) che consentono una diagnosi rapida e affidabile del cancro al cervello. Tale capacità ha permesso interessanti applicazioni di diagnosi intraoperatoria del cancro. L'imaging SRS a due colori del tessuto può essere eseguito con una sorgente laser a picosecondi o femtosecondi. I laser a femtosecondi hanno il vantaggio di abilitare modalità di imaging flessibili, tra cui l'imaging iperspettrale veloce e l'imaging SRS a due colori in tempo reale. Un approccio di messa a fuoco spettrale con impulsi laser cinguettati viene in genere utilizzato con laser a femtosecondi per ottenere un'elevata risoluzione spettrale. 
L'acquisizione SRS a due colori può essere realizzata con modulazione ortogonale e rilevamento lock-in. La complessità del cinguettio, della modulazione e della caratterizzazione degli impulsi è un collo di bottiglia per l'adozione diffusa di questo metodo. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per dimostrare l'implementazione e l'ottimizzazione della messa a fuoco spettrale SRS e l'imaging a due colori in tempo reale del tessuto cerebrale del topo in modalità epi. Questo protocollo può essere utilizzato per un'ampia gamma di applicazioni di imaging SRS che sfruttano l'alta velocità e la capacità di imaging spettroscopico di SRS.

Ottimizzazione della risoluzione spettrale: La dispersione attraverso un materiale è influenzata dal mezzo dispersivo (lunghezza e materiale) e dalla lunghezza d'onda. La modifica della lunghezza dell'asta di dispersione influisce sulla risoluzione spettrale e sulla dimensione del segnale. È una relazione di dare e avere che può essere pesata in modo diverso a seconda dell'applicazione. Le aste allungano l'impulso del fascio dall'essere largo in frequenza e stretto nel tempo ad essere stretto in frequ...

La microscopia A dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnica di imaging potente, non distruttiva e priva di etichette. Un'applicazione emergente è l'istologia Raman stimolata, in cui l'imaging SRS a due colori nelle transizioni Raman proteiche e lipidiche viene utilizzato per generare immagini di pseudo-ematossilina ed eosina. Qui, dimostriamo un protocollo per l'imaging SRS a due colori in tempo reale per la diagnosi dei tessuti.

In tempo reale, a due colori stimolato Raman Scattering Imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Questo protocollo dimostrerà l'implementazione e l'ottimizzazione della microscopia SRS a focalizzazione spettrale e come può essere utilizzata per applicazioni di istologia Raman stimolate in tempo reale. Il vantaggio principale di questa tecnica è la velocità con cui i campioni possono essere elaborati una volta che la strumentazione è correttamente allineata, poiché SRS non richiede la lavorazione e la colorazione dei tessuti. Questo protocollo è applicabile ad altre applicazioni SRS, non solo limitate all'istologia.Tali applicazioni includono piccole molecole, farmaci, cellule e tessuti. Inizia installando una coppia di lenti acromatiche per il raggio della pompa per ingrandire le dimensioni del raggio laser di due volte come punto di partenza. Posizionare un obiettivo da 100 e 200 millimetri a circa 300 millimetri l'uno dall'altro.Quindi allineare il fascio della pompa attraverso il centro di entrambe le lenti. Quindi posizionare uno specchio dopo la seconda lente per inviare il raggio verso una parete a più di un metro di distanza. Traccia il raggio dallo specchio alla parete con una scheda IR e controlla se il raggio cambia di dimensioni.Collimare il raggio se il raggio cambia di dimensioni in funzione della distanza. Combina i due raggi laser installando uno specchio dicroico con diversi specchietti dello sterzo per la regolazione. Ottimizza la sovrapposizione spaziale della pompa e di Stokes monitorando i fasci dopo lo specchio dicroico in due diverse posizioni a circa un metro di distanza.Regolare iterativamente lo specchietto retrovisore dello sterzo seguito dallo specchio dicroico per allineare il fascio stokes con il fascio della pompa. Assicurarsi che i raggi combinati vengano inviati al centro degli specchi di scansione del microscopio a scansione laser regolando una coppia di specchi sterzanti quando gli specchietti retrovisori sono parcheggiati. Dopo il condensatore, utilizzare un'altra coppia di lenti con lunghezze focali di 100 millimetri e 30 millimetri, rispettivamente, per trasmettere il fascio trasmesso sul fotodiodo, assicurando che entrambi i fasci siano contenuti all'interno del fotodiodo.Quindi installare due filtri passa-basso per bloccare il fascio di Stokes modulato. Posiziona un campionatore di fascio nel percorso del fascio di Stokes per raccogliere il 10% del raggio e inviarlo a un fotodiodo veloce per rilevare il treno di impulsi da 80 megahertz. Prendi una delle uscite del buffer fanout e filtrala con un filtro passa banda per ottenere un'onda sinusoidale di 20 megahertz.Quindi utilizzare un attenuatore RF per regolare il picco di uscita alla tensione di picco a circa 500 millivolt. Inviare l'uscita risultante a uno sfasatore, che consente la regolazione fine della fase RF con una sorgente di tensione. Inviare questa uscita a un amplificatore di potenza RF e collegare l'uscita dell'amplificatore all'EOM.Dopo aver sbloccato il fascio di Stokes, ottimizzare la profondità di modulazione del primo EOM posizionando un fotodiodo nel percorso del fascio. Regolare la tensione EOM e la piastra a quarto d'onda fino a quando la profondità di modulazione appare soddisfacente. Posizionare un fotodiodo dopo lo specchio dicroico per rilevare il raggio laser.Blocca prima il raggio di Stokes, quindi ingrandisci uno dei picchi di impulso della pompa sull'oscilloscopio. Posizionare un cursore verticale per contrassegnare la posizione temporale di questo picco con l'oscilloscopio. Ora blocca il raggio della pompa e sblocca il raggio di Stokes.Tradurre la fase di ritardo in modo che corrisponda temporaneamente alle posizioni di picco sull'oscilloscopio alla posizione contrassegnata nel passaggio precedente. Calcolando la distanza di ritardo necessaria per abbinare i due raggi seguita dall'allungamento del percorso del raggio del raggio più veloce o accorciando il percorso del raggio più lento. Quindi preparare un campione di vetrino per microscopio con DMSO e nastro biadesivo come distanziatore per tenere il campione tra il vetrino e un coperchio.Posizionare il campione sul microscopio con il lato coverslip rivolto verso l'obiettivo del microscopio e osservare il campione dal pezzo I sotto illuminazione a campo luminoso. Trova il fuoco del campione sia nello strato superiore che in quello inferiore delle bolle d'aria all'interfaccia del nastro di vetro, quindi sposta lo stato attivo in modo che si trovi tra i due strati del nastro. Quindi impostare l'uscita del fascio sintonizzabile a 798 nanometri.In base alla portata ottica del condensatore, regolare la potenza ottica in modo che sia di circa 40 milliwatt ciascuno per la pompa e i fasci di Stokes al fuoco dell'obiettivo. Quindi apri l'immagine di scansione in MATLAB e fai clic sul pulsante con l'etichetta focus per avviare la scansione. Regolare lo specchietto retrovisore prima dello scanner galvo per centrare il segnale DC sul display del canale uno.Spostare lo stadio di ritardo motorizzato e osservare da vicino l'uscita di blocco mostrata sul display a due canali. Infine regola il ritardo temporale per massimizzare l'intensità del segnale CA. Regolare lo specchio dicroico per centrare il segnale SRS sul canale CA.Quindi regolare la fase dell'amplificatore lock-in per massimizzare il segnale. Dopo aver montato il vetrino del campione sul microscopio e regolato la potenza di entrambi i fasci a circa 40 milliwatt ciascuno a fuoco del campione, come dimostrato in precedenza. Apri l'immagine di scansione da MATLAB.Quindi trova il segnale SRS massimo scansionando attraverso lo stadio di ritardo corrispondente al picco Raman di 2.913 centimetri inversi di DMSO. Acquisire un'immagine SRS corrispondente al picco Raman di 2.913 centimetri inversi di DMSO. Aprite l'immagine in ImageJ e selezionate una piccola area al centro della cornice.Utilizzare la funzione di misura per calcolare la deviazione media e standard dei valori nell'area selezionata. Per la calibrazione dell'accesso alla frequenza, salvare una scansione iperspettrale con l'intervallo dello stadio di ritardo che copre i picchi Raman di 2, 913 e 2. 994 centimetri inversi di DMSO. Quindi salvare le posizioni dello stage corrispondenti al set di dati iperspettrali.Eseguire la regressione lineare per le posizioni dello stadio e gli spostamenti Raman a 2, 913 e 2. 994 centimetri inversi. Utilizzando l'equazione di regressione lineare, convertire le posizioni di ritardo nelle frequenze Raman corrispondenti. Per la calibrazione della risoluzione spettrale, stimare la posizione dello stadio in base alla posizione precedente con la maggiore lunghezza del percorso ottico dovuta all'inserimento di aste.Riallineare la sovrapposizione spaziale delle travi a causa della leggera deviazione della trave quando vengono aggiunte aste di vetro. Installare uno splitter del fascio polarizzante, una piastra a quarto d'onda e un secondo EOM nel percorso del fascio di soaks dopo il primo EOM. Scollegare l'ingresso del segnale al secondo EOM, quindi collegare l'ingresso del segnale al primo EOM e accenderlo.Modula il fascio di Stokes a 20 megahertz inviando il raggio attraverso il primo EOM. Regola l'inclinazione e la posizione del primo EOM per assicurarti che il raggio sia centrato attraverso il cristallo EOM. Preparare un campione di vetrino con nastro biadesivo, vetrino per microscopio e vetro di copertura.Posizionare il campione sul microscopio con il lato coverslip rivolto verso l'obiettivo del microscopio. Per l'imaging SRS in modalità epi, installare una piastra a mezza onda prima che il fascio entri nel microscopio per modificare la polarizzazione del fascio che entra nel microscopio. Posizionare uno splitter del fascio polarizzante sopra l'obiettivo per consentire al fascio riflesso posteriore depolarizzato di raggiungere il rilevatore.Successivamente, utilizzare una lente acromata da 75 millimetri e una lente asferica da 30 millimetri per trasmettere i fotoni sparsi sul retro dall'apertura posteriore dell'obiettivo al fotorilevatore. Montare il rilevatore per raccogliere la luce diffusa posteriore diretta dallo splitter del fascio polarizzante. Quindi installare un filtro per impedire al fascio modulato di entrare nel rilevatore.La variazione delle lunghezze dell'asta influisce sulla risoluzione spettrale. Quando non vengono utilizzate aste di cinguettio del vetro, i due picchi Raman di DMSO non vengono risolti affatto. Un aumento del numero di aste di cinguettio del vetro inizia a risolvere i due picchi in un punto soddisfacente.Il cinguettio abbinato risolve entrambi i picchi e può essere utilizzato per calibrare le posizioni dello stadio in base alla frequenza. Due treni di impulsi ritardati di polarizzazione ortogonale utilizzati per visualizzare spettri DMSO mostrano il ritardo temporale tra le eccitazioni SRS con profondità di modulazione accettabile e separazione temporale. Al contrario, uno scarso sfasamento SRS a due colori, dà origine a picchi invertiti o negativi.Qui vengono mostrate immagini SRS a due colori in tempo reale a 2, 850 e 2.930 centimetri inversi di tessuto cerebrale di topo ex vivo. Le immagini lipidiche e proteiche grezze sono state codificate a colori per produrre una singola immagine raffigurante i contributi lipidici e proteici. False ematossilina e ricolorazione dell'eosina, sono state eseguite anche per imitare la colorazione di ematossilina ed eosina per applicazioni patologiche.La sovrapposizione temporale spaziale e l'ottimizzazione della risoluzione spaziale sono i passi più importanti per l'approccio di messa a fuoco spaziale di SRS. Questo metodo è generalmente applicabile per altri esperimenti di microscopia a sonda a pompa come la microscopia ad assorbimento transitorio. Il metodo consente anche l'imaging di molecole non fluorescenti nelle cellule e nei tessuti.Il metodo qui presentato accelera il tempo di acquisizione delle immagini per la futura traduzione dell'istologia Raman stimolata nella clinica.

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