Analisi ad alto rendimento della tempra non fotochimica nelle colture utilizzando la fluorometria clorofilla modulata con ampiezza di impulso

Questo metodo può fornire una visione della variazione genetica nella tempra non fotochimica disponibile all'interno di pannelli di diversità genetica o popolazioni riproduttive. Il vantaggio principale di questa tecnica è il potenziale per lo screening di un gran numero di genotipi per la variazione della tempra non fotochimica entro un solo giorno. Il protocollo è presentato per la glicina max o la soia, ma può essere adattato per analizzare altri spazi vegetali da cui possono essere raccolti i dischi di sollevamento.

Per qualcuno che esegue il protocollo per la prima volta, la chiave è maneggiare il disco di sollevamento per evitare danni o spugne troppo saturanti con acqua. Per iniziare, campionare le piante nel sito del campo 30 giorni dopo la germinazione. Riempire 1/3 di livello di acqua distillata in tutti i pozzi di un piatto a 24 pozzetti.

Etichettare il coperchio e il lato della piastra con le repliche da campionare. Tenere la foglia più giovane completamente espansa presente nella parte superiore della pianta contro un tappo di gomma. Premere una piralide di sughero Humboldt numero due attraverso la foglia e ruotare per tagliare un disco, evitando la costola centrale.

Raccogli consecutivamente cinque dischi dalla stessa foglia per le repliche tecniche. Spingere i dischi fogliari fuori dalla piralide del sughero in un unico pozzetto di un piatto a 24 pozzetti usando un batuffolo di cotone e ripetere questo per una pianta diversa dello stesso genotipo. Controllare che tutti i dischi fogliari galleggino nell'acqua.

In caso contrario, spostare delicatamente i dischi fogliari che si attaccano al lato di un pozzo in posizione fluttuante con un batuffolo di cotone. Passare al campionamento dei dischi dal seguente grafico. Posizionare il coperchio e sigillare con un film flessibile semitrasparente.

dopo aver completato il campionamento nell'intera piastra a 24 pozzetti. Conservare la piastra lontano dalla luce solare diretta in un sacchetto, una scatola o un dispositivo di raffreddamento vuoto. In uno spazio di laboratorio pulito, toccare il coperchio della piastra sigillata per rimuovere i dischi fogliari attaccati al coperchio durante il trasporto.

Scartare il film e rimuovere il coperchio. Trasferire un disco fogliare dalla prima posizione della piastra a 24 pozzetti in una piastra fresca a 96 pozzetti con il disco fogliare rivolto verso il basso nella parte inferiore del pozzetto. Tagliare a metà un filtro aspiratore nasale.

Immergere il filtro risultante a metà dell'acqua e tamponare su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Inserire il filtro nel pozzetto con il disco fogliare per mantenere l'umidità. Prendere un secondo disco fogliare dalla prima posizione della piastra a 24 pozzetti e posizionarlo a faccia in giù nella successiva posizione disponibile della piastra a 96 pozzetti.

Immergere la restante metà del filtro nasale prodotto in acqua e tamponarlo su un tovagliolo di carta prima di inserirlo nel pozzo con il secondo disco fogliare. Nastro nell'angolo in alto a destra per orientare la lastra al buio per l'imaging. Sigillare le piastre con un film flessibile semitrasparente e avvolgere la piastra in un foglio di alluminio.

Scrivi gli ID del plottaggio e l'ID della piastra sul foglio di alluminio. Posizionare le piastre in una scatola o in un armadio scuro per un minimo di 30 minuti per il rilassamento delle prime due fasi di tempra non fotochimica. Utilizzare un periodo di incubazione scuro prolungato di un'ora prima dell'imaging se sono interessanti fasi a lungo termine di tempra non fotochimica.

Preparare una piastra fittizia aggiuntiva per la messa a fuoco durante l'analisi posizionando un disco fogliare in ogni angolo di una piastra fresca a 96 pozzetti e uno al centro. Fissare i dischi fogliari con filtri nasali come fatto con le piastre precedenti, sigillare la piastra e incubare al buio a temperatura ambiente e al 50% di umidità relativa. Accendere l'imager e aprire il software di imaging.

Fare clic su Impostazioni seguite da Protocollo per aprire una finestra per l'inserimento dei passaggi nel protocollo sperimentale PAM. Impostare le specifiche tecniche della macchina fornite nel manoscritto. Impostare il programma per iniziare con un impulso di saturazione per misurare la massima efficienza quantistica della fotosintesi adattata al buio inserendo 20 secondi nella casella denominata After a delay of.

Fare clic sulla casella Applica impulso e immettere 1 nella casella intitolata Questo numero di volte. Impostare l'impulso PPFD su 6.152, la lunghezza dell'impulso su 800 millisecondi e selezionare la casella Prendi immagini prime F e FM prime con tutti gli impulsi. Selezionare Inserisci dopo per aggiungere un secondo passaggio al protocollo.

Immettere 30 secondi nella casella intitolata Dopo un ritardo di. Quindi, selezionare l'opzione Cambia attinico e immettere 50 nella casella denominata PPFD attinico per impostare l'intensità della luce nella camera su 50 PPFD. Fare clic su Inserisci dopo per aggiungere un nuovo passaggio al protocollo e immettere 150 secondi nella casella intitolata Dopo un ritardo di.

Selezionare Applica impulso e immettere 4 nella casella intitolata Questo numero di volte per applicare impulsi di misurazione ogni 150 secondi quattro volte di seguito mentre la luce attinica è mantenuta a 50 PPFD. Regolare il ritardo e l'intensità della luce per ogni passaggio in base ai valori forniti nel manoscritto prima di salvare il protocollo come file pcl nella posizione desiderata. Spegnere la luce e posizionare la piastra fittizia a faccia in giù sullo stadio del campione in modo che la superficie assiale della foglia punti verso l'alto verso il rilevatore e che la spugna sia rivolta verso il basso verso la piattaforma.

Impostare l'altezza dello stadio del campione in modo che i dischi fogliari siano 140 millimetri sopra la base dello strumento. Fare clic sull'icona Connetti/disconnetti alla fotocamera imager e alla fotocamera hardware per avviare la fotocamera. Fare clic sul simbolo di fluorescenza di messa a fuoco, rappresentato da un'icona a forma di freccia a due lati di colore rosso con due linee verdi alla base, e regolare l'obiettivo e l'esposizione per mettere a fuoco la piastra.

Fare di nuovo clic sull'icona di messa a fuoco della fluorescenza per spegnere la luce lampeggiante. Lavorando al buio, sostituire la piastra fittizia con la piastra da analizzare. Posizionalo a faccia in giù con il nastro all'esterno utilizzato per orientare l'angolo in alto a destra e fai clic sull'icona della fotocamera dell'immagine della mappa.

Regola l'esposizione dell'immagine aprendo o chiudendo l'apertura fino a quando la barra nella finestra popup non è posizionata nella zona verde. Fare clic sul pulsante Riprova dopo ogni regolazione dell'apertura fino a quando l'esposizione non viene regolata correttamente e lo strumento acquisisce un'immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Applica isolamento immagine per bloccare i segnali di sfondo.

L'area foglia focalizzata verrà visualizzata in grigio e lo sfondo in blu. Selezionare l'area o i pixel di interesse per includere solo i dischi foglia regolando l'istogramma e il livello di gamma dal menu a discesa Modifica immagine facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Elimina tagli alti e bassi per eliminare le aree evidenziate in azzurro.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Elimina randagi per rimuovere eventuali pixel che non toccano gli ultimi tre pixel. Tutte le aree dell'immagine che appaiono come isole isolate verranno analizzate separatamente e incluse nell'output finale dei dati. Fare clic sull'icona Esegui protocollo per avviare il programma.

Un timer apparirà nella parte inferiore dello schermo che ti informerà quanto tempo è rimasto il protocollo da eseguire. Attendere il completamento del protocollo. Fare clic su File e Salva con nome per salvare i dati come file igr.

Chiudi la finestra facendo clic sulla croce rossa in alto a destra della finestra prima di avviare un'altra piastra campione. Per esportare i dati di fluorescenza della clorofilla, apri il file igr nel software di imaging e fai clic su File seguito da Esporta nella cartella per creare una nuova cartella con tutti i file necessari. Una tipica misurazione della tempra non fotochimica nei semi di soia coltivati in campo ha mostrato che dopo un flash di saturazione iniziale per determinare Fv / Fm quando i dischi fogliari erano esposti a scarsa illuminazione di 50 micromoli al metro al secondo, la tempra non fotochimica era inferiore a uno.

Inoltre, al momento del trasferimento in condizioni di luce elevata di 2.000 micromoli al metro al secondo, la tempra non fotochimica è aumentata fino al valore massimo di quattro dopo 15 minuti. Una misurazione fallita ha mostrato un aumento minimo della tempra non fotochimica al momento del trasferimento in condizioni di luce elevata. L'orientamento delle piastre all'interno dell'imager e un piano chiaramente definito per il campionamento e la placcatura dei dischi fogliari sono essenziali per garantire che i dati siano collegati al genotipo corretto.

Questo protocollo può quantificare l'impatto di variabili ambientali come la siccità e lo spargimento sulla tempra non fotochimica o valutare la tempra non fotochimica a diversi livelli di chioma per perfezionare i modelli di coltura.