Name: Esplorare linterazione biomolecolare tra lo chaperone molecolare Hsp90 e la sua proteina chinasi cliente Cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri il rilevamento di interazioni biomolecolari senza etichette tra Hsp90 e Cdc37 utilizzando la tecnologia FEB. Questo metodo automatizzato consente misurazioni rapide e accurate per la validazione di interazioni proteiche.

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Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Binational Science Foundation (BSF) a S.K.S. e N.Q.

NOTA: Le proteine ricombinanti utilizzate in questo studio, Hsp90 e Cdc37, sono state ottenute commercialmente (vedere Tabella dei materiali).
1. Attivazione del chip
NOTA: Tutti i materiali da utilizzare nell'esperimento sono elencati nella Tabella dei materiali. Filtrare tutte le soluzioni preparate attraverso un filtro sterile da 0,2 μm.
<ol><li>Preparare la soluzione di 1-etil-3-(3-dimetilammino propil) carbodiimide (EDC) aggiungendo 2 mg di EDC a 2,5 mL di tampone di acido etano solfonico (MES) da 1 M 2-(N-morfolino) (MES) in un tubo da 15 ml. Preparare le soluzioni di N-idrossisulfosuccinimide (sulfo-NHS) aggiungendo 6 mg di sulfo-NHS a 2,5 mL di tampone MES da 1 M (pH = 6,0) in un tubo separato da 15 mL. Aliquota 50 μL di ciascuna soluzione in tubi indipendenti e conservare a -20 °C per un uso futuro.</li>
	<li>Mescolare volumi uguali di soluzione di solfo-NHS di sabbia EDC (50 μL di EDC + 50 μL di sulfo-NHS) pipettando su e giù (non vortice). NOTA: La soluzione mista di EDC/sulfo-NHS deve essere utilizzata entro 30 minuti per mantenere un'efficace reticolazione per una corretta funzionalizzazione del chip.</li>
	<li>Posizionare il chip del biosensore (5,7 cm x 2,4 cm; vedi Tabella dei materiali) fornito dall'azienda in una capsula di Petri di vetro con coperchio montato. Tutte le fasi di funzionalizzazione coinvolte nell'attivazione del chip sono suggerite per essere eseguite all'interno della capsula di Petri. Applicare 50 μL di tampone MES da 1 M (pH = 6,0) sul chip del biosensore, incubare per 1 minuto a temperatura ambiente e quindi aspirare il tampone.</li>
	<li>Applicare immediatamente 50 μL di soluzione EDC/sulfo-NHS al chip del sensore. Coprire la capsula di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione EDC/sulfo-NHS dal chip.</li>
	<li>Risciacquare il chip una volta con 50 μL di tampone MES da 1 M (pH = 6,0); aspirare il tampone MES.</li>
</ol>2. Immobilizzazione delle proteine bersaglio
<ol><li>Risciacquare il chip 2x con 50 μL di 1x PBS (pH = 7,4). Aspirare il PBS dal chip e aggiungere la molecola bersaglio, Hsp90 (50 μL; 500 nM). NOTA: la mancata corrispondenza del buffer potrebbe rovinare l'intero esperimento; quindi, prima dell'esperimento, è importante assicurarsi che la molecola bersaglio si trovi nello stesso tampone utilizzato per la calibrazione (ad esempio, 1x PBS (pH = 7,4)). Se necessario, eseguire uno scambio di buffer mediante dialisi notturna prima dell'esperimento. In questo esperimento, è stata eseguita la dialisi notturna per entrambe le proteine ricombinanti, Hsp90 e Cdc37, contro 1x PBS (pH = 7,4; vedi Tabella dei materiali) con un adeguato scambio tampone a 4 °C. La concentrazione del materiale bersaglio (Hsp90 in questo caso) può variare a seconda dei diversi protocolli sperimentali e della natura dei materiali bersaglio (proteine/peptidi/ligandi).</li>
	<li>Coprire la capsula di Vetro di Petri e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione contenente la molecola bersaglio e risciacquare 3x con 50 μL di 1x PBS (pH = 7,4). Aspirare la soluzione 1x PBS (pH = 7,4) dal chip.</li>
	<li>Aggiungere al chip 50 μL di Quench 1 (3,9 mM di amino-PEG5-alcool in 1x PBS (pH = 7,4)). Coprire la capsula di Petri di vetro e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione Quench 1 dal chip.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di soluzione di Quench 2 (1 M etanolammina (pH = 8,5)) al chip. Coprire la capsula di Vetro di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione Quench 2 dal chip e risciacquare il chip 5x utilizzando 50 μL di 1x PBS, lasciando l'ultima goccia PBS sul sensore.</li>
</ol>3. Preparazione di campioni di analiti
<ol><li>Preparare la serie di diluizione dell'analita per Cdc37 nell'intervallo di concentrazione desiderato. Per il primo esperimento sono state utilizzate le seguenti concentrazioni: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM e 5.000 nM. Per il secondo esperimento, è stato utilizzato un diverso insieme di concentrazioni che vanno da 0,4 nM a 200 nM.</li>
	<li>Progettare l'esperimento in modo da includere almeno otto diverse concentrazioni di analiti per ottenere un valore KD affidabile. Preparare le diverse diluizioni della proteina analitica nello stesso tampone utilizzato per la calibrazione e la proteina bersaglio; qui è 1x PBS (pH = 7,4).</li>
</ol>4. Caricamento del chip biosensore attivato nel dispositivo FEB
NOTA: Il dispositivo FEB è costituito da un lettore dotato di indicazioni luminose a LED e da una cartuccia per inserire il chip del biosensore.
<ol><li>Dopo l'immobilizzazione della proteina bersaglio, inserire il chip attivato nella cartuccia del dispositivo, che è collegata tramite USB a un computer. Dopo l'inserimento del chip, sul lettore verrà visualizzata una luce LED verde che indica che il dispositivo FEB è pronto per l'esperimento. Installare il software automatizzato (vedi Tabella dei Materiali) fornito dall'azienda sul computer, a cui è collegato il dispositivo FEB, per monitorare l'esperimento passo dopo passo come descritto di seguito.</li>
</ol>5. Esegui l'esperimento
<ol><li>Premere il modulo Esegui esperimento sul software automatizzato e scegliere 10 punti con rigenerazione o qualsiasi altro protocollo desiderato. Inserisci i seguenti dettagli: nome dell'operatore, nome dell'esperimento, data (ad esempio, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); buffer di rigenerazione (ad esempio, buffer PBS); bersaglio immobilizzato (ad esempio, Hsp90); analita in soluzione (ad esempio, Cdc37). Vedere la Figura supplementare S1 per i dettagli.</li>
	<li>Premere il pulsante Inizia l'esperimento visualizzato sul software e seguire le istruzioni visualizzate dal software automatizzato come descritto di seguito. NOTA: il software è completamente automatizzato, facile da usare e guida l'utente durante l'esperimento passo dopo passo. Sullo schermo apparirà una finestra pop-up con le istruzioni per procedere ulteriormente in ogni fase dell'esperimento. Il software fornirà istruzioni per ogni passaggio ripetitivo consecutivamente dalla calibrazione, associazione analitica, dissociazione, rigenerazione e lavaggio (5x) per ogni concentrazione di analita durante l'esperimento.</li>
	<li>Eseguire la calibrazione dello strumento. Per fare ciò, aspirare la soluzione PBS rimanente dal chip e applicare 50 μL di tampone di calibrazione (1x PBS; pH = 7,4). Premere il pulsante Continua e attendere 5 minuti fino al termine della fase di calibrazione. Il software visualizza l'endpoint determinato per la fase di calibrazione (5 min) con un allarme di avvertimento da seguire.</li>
	<li>Quindi, eseguire un'associazione di analiti. Per fare ciò, aspirare il buffer di calibrazione dal chip e applicare 50 μL della più bassa concentrazione di analita (25 nM di Cdc37). Premere il pulsante Continua e attendere 5 minuti fino al termine della fase di associazione. Il software visualizza l'endpoint per la fase di associazione (5 min) con un allarme di avviso per procedere.</li>
	<li>Eseguire una dissociazione dell'analita. Per fare ciò, aspirare la soluzione di analita dal chip e applicare 50 μL del tampone di dissociazione (1x PBS; pH = 7,4). Premere il pulsante Continua e attendere 5 minuti fino al termine della durata della fase di dissociazione (5 minuti). Il software visualizza l'endpoint per la fase di dissociazione (5 min) con un allarme di avvertimento da seguire.</li>
	<li>Quindi, eseguire la rigenerazione del chip. Aspirare la soluzione di dissociazione dal chip e applicare 50 μL di tampone di rigenerazione (1x PBS; pH = 7,4). Premere il pulsante Continua e attendere 30 s fino al termine della durata della fase di rigenerazione (30 s). Il software visualizza l'endpoint per la fase di rigenerazione (30 s) con un allarme di avviso da seguire.</li>
	<li>Infine, lavare il chip. Aspirare la soluzione di rigenerazione dal chip e applicare 50 μL di tampone di lavaggio (1x PBS; pH = 7,4) al chip. Aspirare la soluzione dal chip e ripetere questo 5x. Lasciare l'ultima goccia di tampone di lavaggio sul chip e premere il pulsante Continua e attendere 30 s fino al termine della durata della fase di lavaggio nel display del software. NOTA: il software visualizza l'endpoint per la fase di lavaggio (30 s) con un allarme di avviso per procedere con il ciclo successivo dell'esperimento.</li>
	<li>Ripetere i passaggi per ogni concentrazione di analita utilizzata; le cinque fasi di calibrazione, associazione dell'analita, dissociazione, rigenerazione e lavaggio (5x) costituiscono un ciclo. Per l'esperimento qui mostrato, abbiamo eseguito 10 cicli per 10 concentrazioni di analiti (che vanno da 25 nM a 5.000 nM o da 0,4 nM a 200 nM; Figura 2).</li>
</ol>6. Analisi
<ol><li>Premere il pulsante Analisi visualizzato nella parte superiore del software di analisi automatizzato alla fine dell'esperimento. Apparirà una finestra di visualizzazione contenente tutti i punti sperimentali. Nella finestra, assicurarsi che le concentrazioni di analita utilizzate per il protocollo prescritto siano corrette.</li>
	<li>Premere il pulsante Esegui analisi per generare automaticamente il valore KD . Il software genera un diagramma di Hill fit tracciando le concentrazioni di analiti rispetto alle corrispondenti I-Responses da cui viene calcolata la costante di dissociazione all'equilibrio, il valore KD .</li>
	<li>Esportare i dati grezzi per l'analisi in altri software di analisi statistica utilizzando il software di revisione/esportazione dei dati come descritto di seguito.<ol>
<li>Copia il file R1R creato automaticamente alla fine dell'esperimento (ad esempio, Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) in una nuova cartella sul desktop. Aprire il software di revisione/esportazione dei dati fornito dall'azienda (vedere la figura supplementare S2A).</li>
		<li>Fare clic su Elaborazione dati > Elaborare i file R1R > OK nella schermata iniziale del software di revisione / esportazione dei dati.</li>
		<li>Selezionare la cartella contenente i file R1R creati sul desktop nel passaggio 6.3.1. e premere il pulsante OK . Questo crea una copia dei dati R1R originali, per rivedere e modificare i dati senza sovrascrivere il file originale.</li>
		<li>Premere l'icona di elaborazione dei dati visualizzata nella schermata iniziale del software di revisione/esportazione dei dati. Premere Carica file R1R elaborati > OK. Selezionare la stessa cartella creata nel passaggio 6.3.1 contenente i file R1R elaborati. Premere OK. In questo passaggio, la cartella contenente i file dell'esperimento è pronta per essere esaminata.</li>
		<li>Nella schermata iniziale del software di revisione/esportazione dei dati, premere Analisi dati. Selezionare Calibrazione > Calibrare i file R1R modificati > OK (vedere la Figura supplementare S2B). Questo passaggio calibra tutti i punti dati in base al primo passaggio di calibrazione, per creare una linea di base.</li>
		<li>Nella schermata iniziale del software di revisione/esportazione dei dati, premere Analisi dati. Selezionare Rivedi e modifica file R1R > OK. Esaminare i punti dati, eliminare punti o aggiungere passaggi utilizzando il pulsante Elimina/Aggiungi passaggio . Assicurarsi che tutti i passaggi siano nella posizione corretta, ad esempio, la fase di calibrazione è sulla linea di base, la fase di associazione è al picco (vedere figura supplementare S3), quindi premere il pulsante Salva per salvare tutte le modifiche apportate.</li>
		<li>Nella schermata iniziale del software di revisione/esportazione dei dati, premere Analisi dati. Selezionare Analizza/Traccia dati, scegliere i passaggi da esportare (vedere la Figura supplementare S4). Aggiungere ogni passaggio di associazione (ad esempio, passaggio 2, passaggio 7 e così via) dopo aver sottratto il passaggio di calibrazione (ad esempio, passaggio 1, passaggio 6 e così via) all'elenco di esportazione prima di esportare i dati.</li>
		<li>Premere Esporta questi dati. Il software genera un file di foglio di calcolo contenente l'I-Response per ogni punto di dati di concentrazione dell'analita da ciascun transistor (se tutti i transistor funzionano, avremo tre diversi valori di risposta I per ciascun punto di concentrazione). Utilizzare questo file di foglio di calcolo per analizzare ulteriormente i dati nel software statistico.</li>
	</ol></li>
	<li>Aprire il software di analisi statistica. Creare una tabella XY con tre valori Y; premere Crea. I dati per questa tabella (valori X, Y) vengono copiati dal file del foglio di calcolo creato nel passaggio 6.3.8. L'asse x corrisponde alla concentrazione dell'analita (a seconda della concentrazione utilizzata), e i tre valori Y corrispondono alle I-Responses, ottenute dal software Data Review/Export fornito dall'azienda.</li>
	<li>Premere Analizza questi dati. Scegliete Analisi XY > Regressione non lineare (Curve Fit) > Saturazione vincolante > un sito > totale. Il software analizzerà automaticamente i dati, genererà il valore KD e creerà un grafico dei punti dati.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo.

In questo studio, è stata valutata la fattibilità dell'utilizzo della tecnologia FEB (un approccio di caratterizzazione cinetica in tempo reale) per determinare l'interazione biomolecolare tra Hsp90 e Cdc37. L'esperimento esplorativo iniziale (primo esperimento) ha suggerito che la scelta delle concentrazioni di analiti corrette è una parte critica dell'esperimento e che l'esperimento dovrebbe essere progettato includendo punti di concentrazione sopra e sotto il valore KD , che sono stati previsti sulla base d...

Interazioni biomolecolari: Le proteine sono parti essenziali degli organismi e partecipano a numerosi percorsi molecolari come il metabolismo cellulare, la struttura cellulare, la segnalazione cellulare, le risposte immunitarie, l'adesione cellulare e altro ancora. Mentre alcune proteine svolgono le loro funzioni in modo indipendente, la maggior parte delle proteine interagisce con altre proteine utilizzando un'interfaccia di legame per coordinare la corretta attività biologica1.
Le interazioni biomolecolari possono essere classificate principalmente in base alle distinte caratteristiche strutturali e funzionali delle proteine coinvolte2, ad esempio in base alle superfici proteiche, alla stabilità complessa o alla persistenza delle interazioni3. Identificare le proteine essenziali e il loro ruolo nelle interazioni biomolecolari è vitale per comprendere i meccanismi biochimici a livello molecolare4. Attualmente, ci sono vari approcci per rilevare queste interazioni5: in vitro6, in silico7, in cellule vive8, ex vivo9 e in vivo10 con ciascuno con i propri punti di forza e di debolezza.
I saggi in vivo vengono eseguiti utilizzando l'intero animale come strumento sperimentale11 e i saggiex vivo vengono eseguiti su estratti di tessuto o organi interi (ad esempio, cuore, cervello, fegato) in un ambiente esterno controllato fornendo alterazioni minime in condizioni naturali. L'applicazione più comune degli studi in vivo ed ex vivo è quella di valutare gli effetti di farmacocinetica, farmacodinamica e tossicità dei potenziali agenti farmacologici prima degli studi sull'uomo, garantendone la sicurezza e l'efficacia complessive12.
Le interazioni biomolecolari possono anche essere rilevate all'interno delle cellule viventi. L'imaging di cellule vive ci consente di osservare le interazioni dinamiche mentre eseguono le reazioni di un particolare percorso biochimico13. Inoltre, le tecniche di rilevamento, come la bioluminescenza o il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza, possono fornire informazioni su dove e quando queste interazioni si verificano all'interno della cellula14. Sebbene il rilevamento in cellule vive offra dettagli cruciali, queste metodologie di rilevamento si basano su ottiche ed etichette, che potrebbero non riflettere la biologia nativa; sono anche meno controllati rispetto ai metodi in vitro e richiedono competenze specializzate per eseguire15.
I metodi computazionali in silico sono utilizzati principalmente per lo screening su larga scala delle molecole bersaglio prima degli esperimenti in vitro . Metodi di previsione computazionale, database basati su computer, docking molecolare, relazioni quantitative struttura-attività e altri approcci di simulazione della dinamica molecolare sono tra gli strumenti consolidati in silico 16. Rispetto alle laboriose tecniche sperimentali, gli strumenti in silico possono facilmente fare previsioni con alta sensibilità, ma con precisione ridotta nelle prestazioni predittive17.
I saggi in vitro vengono eseguiti con microrganismi o molecole biologiche al di fuori del loro contesto biologico standard. Ritrarre le interazioni biomolecolari attraverso metodi in vitro è fondamentale per comprendere le funzioni proteiche e la biologia alla base della complessa rete di funzionamento cellulare. La metodologia di analisi preferita viene scelta in base alle proprietà intrinseche della proteina, ai valori cinetici e alla modalità e intensità delle interazioni18,19.
L'interazione Hsp90/Cdc37: La via chaperone-chinasi, che collega Hsp90 e Cdc37, è un obiettivo terapeutico promettente nella biologia tumorale20. Hsp90 svolge un ruolo centrale nel controllo del ciclo cellulare, nell'assemblaggio delle proteine, nella sopravvivenza cellulare e nelle vie di segnalazione. Le proteine che si basano su Hsp90 per le loro funzioni vengono consegnate a Hsp90 per la complessazione attraverso un co-chaperone, come Cdc37. Il complesso Hsp90/Cdc37 controlla il ripiegamento della maggior parte delle protein chinasi e funge da hub per una moltitudine di reti di segnalazione intracellulare21. È un promettente bersaglio antitumorale grazie alla sua elevata espressione in varie neoplasie maligne, tra cui la leucemia mieloblastica acuta, il mieloma multiplo e il carcinoma epatocellulare22,23.
Tecniche di rilevamento dell'interazione biomolecolare in vitro comunemente usate La co-immunoprecipitazione (co-IP) è una tecnica che si basa sulla specificità antigene-anticorpo per identificare interazioni biologicamente rilevanti24. Lo svantaggio principale di questo metodo è la sua incapacità di rilevare interazioni a bassa affinità e valori cinetici24. I metodi biofisici come la calorimetria a titolazione isotermica (ITC), la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria a biostrato (BLI) e la tecnologia FEB sono preferiti per determinare i valori cinetici.
ITC è un metodo di rilevazione biofisica basato sulla determinazione dell'energia di legame insieme a un'analisi termodinamica completa per caratterizzare le interazioni biomolecolari25. Il vantaggio principale dell'ITC è che non richiede alcuna etichettatura o fissazione della proteina bersaglio. Le principali difficoltà incontrate dall'ITC sono l'alta concentrazione di proteine bersaglio richieste per un esperimento e la difficoltà di analizzare complessi non covalenti a causa di piccole entalpie di legame26. Sia SPR che BLI sono tecniche biofisiche label-free che si basano sull'immobilizzazione della molecola bersaglio sulla superficie del sensore, seguita da successive iniezioni dell'analita sul bersaglio immobilizzato27,28. In SPR, le alterazioni dell'indice di rifrazione durante le interazioni biomolecolari sono misurate27; in BLI, l'interferenza nella luce riflessa viene registrata in tempo reale come variazione della lunghezza d'onda in funzione del tempo28. Sia SPR che BLI condividono i vantaggi comuni di offrire elevate funzionalità di specificità, sensibilità e rilevamento29. In entrambi i metodi, la proteina bersaglio è immobilizzata sulle superfici del biosensore e, quindi, potrebbe esserci una certa perdita della conformazione nativa del bersaglio, il che rende difficile discriminare tra interazioni specifiche e non specifiche30. BLI utilizza costosi biosensori monouso in fibra ottica per immobilizzare il bersaglio ed è, quindi, una tecnica costosa31. Rispetto a questi strumenti di rilevamento biomolecolari consolidati, la tecnologia FEB offre una piattaforma affidabile e priva di etichette utilizzando basse concentrazioni nanomolari per il rilevamento biomolecolare in tempo reale con caratterizzazione cinetica. La tecnologia FEB supera anche le sfide spumeggianti affrontate in ITC ed è più conveniente rispetto a SPR o BLI.
I biosensori basati su transistor ad effetto di campo (FET) sono un campo emergente per rilevare interazioni biomolecolari offrendo varie applicazioni biomediche. Nel sistema FET, i bersagli sono immobilizzati ai chip del biosensore e le interazioni vengono rilevate dai cambiamenti nella conduttanza32. La caratteristica unica da considerare nello sviluppo di un biosensore elettronico efficiente sono le proprietà fisico-chimiche come la natura semi-conduttiva e la stabilità chimica del materiale di rivestimento utilizzato per fabbricare la superficie del sensore33. I materiali convenzionali come il silicio utilizzato per il FET hanno limitato la sensibilità dei sensori perché richiede strati di ossido inseriti tra il canale del transistor e un ambiente specifico per il corretto funzionamento34. Inoltre, i transistor al silicio sono sensibili agli ambienti ad alto contenuto di sale, rendendo così difficile misurare le interazioni biologiche nel loro ambiente naturale. Il biosensore a base di grafene si presenta come un'alternativa in quanto offre un'eccellente stabilità chimica e campo elettrico. Poiché il grafene è un singolo strato atomico di carbonio, è sia estremamente sensibile come semiconduttore che chimicamente compatibile con soluzioni biologiche; entrambe queste qualità sono desiderabili per generare biosensori elettronici compatibili35. Il notevole potenziale di carico ultra elevato delle biomolecole offerto dai biosensori rivestiti di grafene ha portato allo sviluppo della tecnologia FEB dei biosensori a base di grafene.
Principio della tecnologia FEB: FEB è una tecnica di rilevamento biomolecolare senza etichetta che misura la corrente elettrica attraverso il biosensore di grafene a cui sono immobilizzati i bersagli di legame. Le interazioni tra la proteina immobilizzata e l'analita provocano alterazioni della corrente che vengono monitorate in tempo reale, consentendo misurazioni cinetiche accurate36.
Strumentazione: Il sistema FEB comprende un chip sensore a transistor a effetto di campo del grafene (gFET) e un lettore elettronico che applica una tensione costante durante l'esperimento (Figura 1). L'analita viene applicato in soluzione alla proteina bersaglio immobilizzata sulla superficie del biosensore. Quando si verifica un'interazione, un'alterazione della corrente viene misurata e registrata in tempo reale. All'aumentare della concentrazione dell'analita, aumenterà anche la frazione di analita legato, causando maggiori alternanze nella corrente. Utilizzando il software di analisi automatizzato fornito con lo strumento (Table of Materials), I-Response viene misurato e registrato in termini di unità di biorilevamento (BU)37. I-Response è definita come l'alterazione della corrente (I) attraverso il chip del biosensore misurata in tempo reale sull'interazione del bersaglio immobilizzato con l'analita. Il software di analisi automatizzata FEB può analizzare sia l'I-Response che il C-Response a eventi di interazione dinamica, dove il C-Response registra le alterazioni della capacità (C). Le variazioni sia in I-Response che in C-Response corrispondono direttamente alla frazione di analita legato e possono essere ulteriormente analizzate per generare valori KD . La preferenza predefinita del software di analisi automatizzata è I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica della configurazione sperimentale. (A) Chip a base di grafene e lettore elettronico. (B) Una panoramica dei componenti del chip. Il chip è collegato a due elettrodi che forniscono corrente al sistema. La superficie del chip è ricoperta di grafene, che una volta attivato può legare il bersaglio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Metodologia: Inizialmente, il chip del biosensore attivato viene inserito nel dispositivo FEB (Figura 1) seguito dall'esecuzione dei passaggi descritti di seguito: (1) Calibrazione: l'esperimento inizia con la calibrazione del sistema utilizzando 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH = 7,4) per creare la risposta di equilibrio basale. (2) Associazione: l'analita viene introdotto nel chip e l'I-Response viene monitorato fino al raggiungimento della saturazione del legame. (3) Dissociazione: l'analita viene dissociato utilizzando 1x PBS. (4) Rigenerazione: i resti dell'analita vengono rimossi utilizzando 1x PBS. (5) Lavaggio: un totale di cinque lavaggi vengono eseguiti utilizzando 1x PBS per la rimozione completa degli analiti legati e non legati dal chip.
Analisi: L'analisi dei dati viene eseguita utilizzando il software completamente automatizzato fornito con lo strumento. Il software di analisi automatizzato genera un grafico Hill fit con un valore KD . Il diagramma di Hill fit descrive l'associazione di un analita alla proteina bersaglio in funzione delle concentrazioni di analiti. La concentrazione alla quale si ottiene una risposta semi-massimale è proporzionale al valore KD . Un valore KD basso rappresenta un'elevata affinità di legame e viceversa.
Per convalidare i dati ottenuti dall'esperimento FEB, le I-Response vengono estratte da ciascun punto di lettura per ogni concentrazione di analita utilizzando il software di revisione/esportazione dei dati e possono essere esportate in altri software di analisi statistica (vedere Tabella dei materiali) come spiegato di seguito.

<table><tbody><tr><td>Software di analisi automatizzata</td><td>Software Agile plus, Cardea (Nanomed)</td><td>NA Numero CAS: NA</td><td>Indicato nel testo come il software di analisi automatizzata fornito con lo strumento. Genera analisi automatizzate.</td></tr><tr><td>Software COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td><td>Agile plus, Cardea (Nanomed)</td><td>NA Numero CAS: NA</td><td>chip biosensore</td></tr><tr><td>Software di revisione dati</td><td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td><td>NA Numero CAS: NA</td><td>Indicato come il software di revisione dei dati fornito nel testo. Fornito con lo strumento e consente di rivedere ed esportare i punti dati informativi.</td></tr><tr><td>Sacca per dialisi</td><td>CelluSep,&nbsp; Prodotti per la filtrazione a membrana</td><td>T2-10-15 Numero CAS: Tubi NA</td><td>T2 (6.000-8.000 MWCO), (10 mm fw, 6,4 mm &Oslash;, 0,32ml/cm, 15m)</td></tr><tr><td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimmide)</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>EDC160322-02 Numero CAS: 25952-53-8</td><td>Sistema</td></tr><tr><td>ITC (calorimetria di titolazione isotermica)</td> in polvere bianca <td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, Regno Unito)</td><td>NA Numero CAS: </td><td></td>NA</tr><tr><td>MES (acido 2-(N-morfolino) etano solfonico) tampone</td><td>Merck</td><td>M3671-50G Numero CAS: 4432-31-9</td><td>Polvere bianca</td></tr><tr><td>NHS (N-idrossisulfosuccinimide) chip</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>NA Numero CAS: NA</td><td>Chip a base di grafene</td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) X 10</td><td>Bio-Lab</td><td>001623237500&nbsp; Numero CAS: 7758-11-4</td><td>Soluzione liquida trasparente</td></tr><tr><td>Pipete</td><td>Thermo Scientific</td><td>11855231 Numero CAS: NA</td><td>Finnpipette F3 5-50 &; L, giallo</td></tr><tr><td>Quench 1 (3,9 mM di amino-PEG5-alcol in 1 X PBS)</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-002-001 Numero CAS: NA</td><td>Soluzione liquida e trasparente</td></tr><tr><td>Quench 2 (1 M etanolammina (pH=8,5))</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-003-001 Numero CAS: NA</td><td>Soluzione liquida e trasparente</td></tr><tr><td>Proteina ricombinante Cdc37</td><td>Abcam</td><td>ab256157 Numero CAS: NA</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante Hsp90 beta</td><td>Abcam</td><td>ab80033 Numero CAS: NA</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di calcolo</td><td>Excel, Microsoft office</td><td>NA Numero CAS: NA</td><td></td></tr><tr><td>Software statistico</td><td>GraphPad, Prism</td><td>NA Numero CAS: NA</td><td>Indicato come l'altro software statistico. Possono essere utilizzati anche tracciati Sigma, phyton o altri programmi statistici</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>NHS160321-07 Numero CAS: 106627-54-7</td><td>Polvere bianca</td></tr><tr><td>Punte</td><td>Alex rosso</td><td>LC 1093-800-000 Numero CAS: NA</td><td>Tip 1-200 &micro; l, alla rinfusa, 1.000 pz</td></tr></tbody></table>

esplorare l'interazione biomolecolare tra lo chaperone molecolare hsp90 e la sua proteina chinasi cliente cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Le interazioni biomolecolari svolgono ruoli versatili in numerosi processi cellulari regolando e coordinando eventi biologici funzionalmente rilevanti. Biomolecole come proteine, carboidrati, vitamine, acidi grassi, acidi nucleici ed enzimi sono elementi fondamentali degli esseri viventi; si assemblano in reti complesse nei biosistemi per sincronizzare una miriade di eventi della vita. Le proteine utilizzano tipicamente reti interatomiche complesse per svolgere le loro funzioni; quindi è obbligatorio valutare tali interazioni per svelare la loro importanza nelle cellule sia a livello cellulare che a livello di organismo. Verso questo obiettivo, introduciamo una tecnologia in rapida ascesa, il biosensing ad effetto di campo (FEB), per determinare specifiche interazioni biomolecolari. FEB è una tecnica di rilevamento biomolecolare da banco, senza etichette e affidabile per determinare interazioni specifiche e utilizza biosensori elettronici di alta qualità. La tecnologia FEB può monitorare le interazioni nell'intervallo nanomolare a causa dei nanomateriali biocompatibili utilizzati sulla superficie del biosensore. Come prova di concetto, è stata chiarita l'interazione proteina-proteina (PPI) tra la proteina da shock termico 90 (Hsp90) e il ciclo di divisione cellulare 37 (Cdc37). Hsp90 è un chaperone molecolare dipendente dall'ATP che svolge un ruolo essenziale nel ripiegamento, nella stabilità, nella maturazione e nel controllo di qualità di molte proteine, regolando così molteplici funzioni cellulari vitali. Cdc37 è considerato un chaperone molecolare specifico della proteina chinasi, in quanto riconosce e recluta specificamente le chinasi proteiche a Hsp90 per regolare le loro vie di trasduzione del segnale a valle. Come tale, Cdc37 è considerato un co-chaperone di Hsp90. La via chaperone-chinasi (complesso Hsp90/Cdc37) è iper-attivata in tumori maligni multipli che promuovono la crescita cellulare; pertanto, è un potenziale bersaglio per la terapia del cancro. Il presente studio dimostra l'efficienza della tecnologia FEB utilizzando il sistema modello Hsp90/Cdc37. FEB ha rilevato un forte PPI tra le due proteine (valori KD di 0,014 μM, 0,053 μM e 0,072 μM in tre esperimenti indipendenti). In sintesi, FEB è una piattaforma di rilevamento PPI senza etichette ed economica, che offre misurazioni rapide e accurate.

Risultati dell'esperimento 1: La proteina bersaglio Hsp90 (500 nM) è stata immobilizzata al chip seguendo il protocollo di immobilizzazione target come descritto sopra. Per il primo esperimento, sono state preparate 10 concentrazioni della proteina analita Cdc37, comprese tra 25 nM e 5.000 nM, sulla base dei dati disponibili in letteratura (vedi Tabella 1).
Le fasi dell'esperimento possono essere monitorate in tempo reale seguendo le alterazioni che si veri...

Il biosensing ad effetto di campo (FEB) è una tecnica senza etichetta per rilevare le interazioni biomolecolari. Misura la corrente elettrica attraverso il biosensore di grafene a cui sono immobilizzati i bersagli leganti. La tecnologia FEB è stata utilizzata per valutare le interazioni biomolecolari tra Hsp90 e Cdc37 ed è stata rilevata una forte interazione tra le due proteine.

Esplorare l'interazione biomolecolare tra lo chaperone molecolare Hsp90 e la sua proteina chinasi cliente Cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

FEB è una piattaforma di rilevamento dell'interazione ______ _______ senza etichette ed economica che offre misurazioni rapide e accurate. Questo metodo offre la convalida di interazioni note o sconosciute e un modo semplice per testare potenziali inibitori delle interazioni biomolecolari. Il vantaggio principale di FEB è il suo software automatizzato e intuitivo che blocca l'utente durante l'esperimento con una piattaforma di pipettaggio manuale aperta, consentendo agli utenti di lavorare con poca o addirittura nessuna formazione.La tecnologia FEB offre anche applicazioni in diversi campi del settore farmaceutico, analisi biomolecolare di piccole molecole, peptidi e proteine, convalida di farmaci traducendo prontamente l'attività biologica in vitro in efficacia in vivo. Essendo un principiante, potresti dover affrontare sfide nella scelta delle giuste concentrazioni di analiti per ottimizzare l'esperimento per ottenere un valore KD affidabile. Consigliamo di prestare attenzione al processo di funzionalizzazione del chip e al corretto scambio di buffer.Iniziare mescolando volumi uguali di soluzione EDC e sulfo-NHS tubando su e giù. Posizionare il chip del biosensore fornito dall'azienda in una capsula di Petri di vetro con un coperchio montato. Tutte le fasi di funzionalizzazione coinvolte nell'attivazione del chip sono suggerite per essere eseguite all'interno della capsula di Petri.Applicare 50 microlitri di tampone MES monofusolare al chip del biosensore. Incubare per un minuto a temperatura ambiente. Quindi, aspirare il tampone e applicare immediatamente 50 microlitri della soluzione EDC sulfo-NHS al chip del sensore.Coprire la capsula di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione EDC sulfo-NHS dal chip e applicare 50 microlitri di tampone MES monomolare. Aspirare il buffer MES e risciacquare il chip due volte con 50 microlitri di 1X PBS.Aspirare il PBS dal chip e aggiungere la molecola bersaglio Hsp90. Coprire la capsula di Petri di vetro e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aspirare la soluzione contenente la molecola bersaglio e risciacquare tre volte con 50 microlitri di 1X PBS.Aspirare la soluzione 1X PBS dal chip e aggiungere 50 microlitri della soluzione quench one. Coprire la capsula di Vetro di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di spegnimento dal chip e aggiungere 50 microlitri della soluzione di spegnimento due.Coprire la capsula di Vetro di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare la soluzione di spegnimento due dal chip e risciacquare il chip cinque volte utilizzando 50 microlitri di 1X PBS lasciando l'ultima goccia PBS sul sensore. Preparare la serie di diluizione dell'analita per Cdc37 nell'intervallo di concentrazione desiderato.Progettare l'esperimento per includere almeno otto diverse concentrazioni di analiti per ottenere una costante di dissociazione affidabile, o valore KD, e preparare queste diverse diluizioni nello stesso buffer utilizzato per la calibrazione e la proteina bersaglio. Posizionare il chip con attenzione sullo strumento. Assicurarsi che il software sia acceso e che la spia LED diventi verde.Quindi, premere il modulo Esegui esperimento sul software automatizzato e scegliere 10 punti con rigenerazione o qualsiasi altro protocollo desiderato. Immettere i dettagli quali il nome dell'operatore, il nome dell'esperimento, la data, il buffer di rigenerazione, la destinazione immobilizzata e l'analita in soluzione. Premere il pulsante Inizia esperimento visualizzato sul software e seguire le istruzioni visualizzate dal software automatizzato.Per eseguire la calibrazione dello strumento, aspirare la soluzione PBS rimanente dal chip e applicare 50 microlitri del buffer di calibrazione. Premere il pulsante Continua e attendere cinque minuti fino al termine della fase di calibrazione. Il software visualizza l'endpoint determinato per la fase di calibrazione con un allarme di avviso da seguire.Quindi, eseguire un'associazione analitica aspirando il buffer di calibrazione dal chip e applicando 50 microlitri della più bassa concentrazione di analita. Premere il pulsante Continua e attendere cinque minuti fino al termine del passaggio di associazione. Il software visualizza il punto finale per la fase di associazione con un allarme di avviso per procedere.Per eseguire una dissociazione dell'analita, aspirare la soluzione di analita dal chip e applicare 50 microlitri del tampone di dissociazione. Premere il pulsante Continua. Dopo la durata della fase di dissociazione, il software visualizza l'endpoint per la fase di dissociazione con un allarme di avviso.Quindi, eseguire la rigenerazione del chip aspirando la soluzione di dissociazione dal chip e applicando 50 microlitri del buffer di rigenerazione. Quindi, premere il pulsante Continua. Il completamento della fase di rigenerazione richiede in genere circa 30 secondi.Successivamente, il software visualizza il punto finale per la fase di rigenerazione con un allarme di avviso da seguire. Infine, per lavare il chip, aspirare la soluzione di rigenerazione dal chip e applicare 50 microlitri del tampone di lavaggio. Aspirare la soluzione dal chip e ripeterla cinque volte.Lasciare l'ultima goccia del tampone di lavaggio sul chip. Quindi, premere il pulsante Continua e attendere 30 secondi fino al termine della durata della fase di lavaggio nel display del software. Ripetere i passaggi per ogni concentrazione di analita utilizzata.Le cinque fasi della calibrazione, dell'associazione dell'analita, della dissociazione, della rigenerazione e del lavaggio cinque volte costituiscono un ciclo. Premere il pulsante Analisi nel software di analisi automatizzato alla fine dell'esperimento. Apparirà una finestra di visualizzazione contenente tutti i punti sperimentali.Assicurarsi che le concentrazioni di analiti utilizzate per il protocollo prescritto siano corrette. Premere il pulsante Esegui analisi per generare automaticamente il valore KD. Il software genera un grafico hill fit tracciando le concentrazioni di analiti rispetto alle corrispondenti risposte I da cui viene calcolata la costante di dissociazione all'equilibrio.La proteina bersaglio Hsp90 è stata immobilizzata al chip e per il primo esperimento sono state preparate 10 concentrazioni della proteina analitica Cdc37 che vanno da 25 nanomolari a 5.000 nanomolari. I file di dati generati dall'esperimento uno sono stati mostrati qui. I dati sperimentali monitorati in tempo reale sono mostrati qui.L'asse Y corrisponde alla risposta I nelle unità del biosensore e l'asse X corrisponde ai diversi punti temporali e alle concentrazioni dell'analita nell'esperimento. L'immagine grafica qui mostrata rappresenta il grafico hill fit generato dal software di analisi automatizzato. L'asse Y corrisponde alla risposta I nelle unità del biosensore e l'asse X corrisponde alle diverse concentrazioni di analiti nell'esperimento.L'immagine grafica qui mostrata rappresenta il grafico di associazione generato utilizzando il software di analisi statistica. L'asse Y corrisponde alla risposta I alla fine della fase di associazione e l'asse X corrisponde alle diverse concentrazioni dell'analita Cdc37. Nell'esperimento due, è stato utilizzato un diverso insieme di concentrazioni che vanno da 0,4 nanomolari a 200 nanomolari e i file di dati generati sono mostrati qui.Le immagini grafiche rappresentano il termogramma ITC dell'interazione Hsp90 e Cdc37. Qui sono mostrate le corrispondenti curve di evoluzione termica ottenute a causa delle iniezioni consecutive di Cdc37 in Hsp90 a 298,15 Kelvin. La potenza differenziale utilizzata qui è una funzione del tempo.I punti dati integrati in questo grafico designano il corrispondente calore normalizzato rispetto al rapporto Mueller di Hsp90 a Cdc37. L'approccio di pipettaggio aperto utilizzato qui richiede che l'utente abbia una padronanza di base del pipettaggio manuale, assicurandosi di non toccare il biosensore con la punta. La riproducibilità della temporizzazione del passo dipende interamente dall'utente.Una volta che il ricercatore caratterizza un'interazione tra due biomolecole, possiamo eseguire un esperimento di screening progettando potenziali inibitori o modulatori mirati alla specifica interazione biomolecolare utilizzando il sistema FEB. Questa procedura può essere utilizzata per identificare, verificare e quantificare l'interazione nota e nuova tra proteine, nonché piccole molecole, inclusi farmaci e peptidi.

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Saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato: un saggio di prossimità basato su perline per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni proteina-proteina

In questo video, descriviamo la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo (FEB) per rilevare e quantificare le interazioni proteina-proteina. Le proteine bersaglio immobilizzate sul biosensore di grafene interagiscono con le proteine dell'analita in soluzione, provocando alterazioni della corrente elettrica nel sistema FEB. Questo cambiamento nella risposta elettrica indica l'affinità di legame tra le proteine.

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Utilizzando microarray proteici contenenti quasi tutta la S. cerevisiae proteoma è sondato per un rapido interrogatori imparziale di migliaia di interazioni proteina-proteina in parallelo. Questo metodo può essere utilizzato per la proteina-piccola molecola, modificazione post-traslazionale, e altri saggi in high-throughput.

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Qui, presentiamo un protocollo per ottenere dati di tre colori smFRET e la sua analisi con un ensemble 3D modello di Markov nascosto. Con questo approccio, gli scienziati possono estrarre informazioni cinetiche da sistemi proteici complessi, tra cui il cooperativity o interazioni correlate.

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Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

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Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle

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Test di complementazione basato su Escherichia coli per studiare la funzione chaperone della proteina da shock termico 70

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la cattura e l'identificazione di interazioni proteina-proteina specifiche della malattia da cellule e tessuti nativi utilizzando sonde chimiche e spettrometria di massa. I set di dati di interazione risultanti vengono analizzati attraverso una piattaforma web dedicata per rivelare disfunzioni dinamiche della rete e alterazioni del percorso legate alla malattia.

Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Scopri il rilevamento di interazioni biomolecolari senza etichette tra Hsp90 e Cdc37 utilizzando la tecnologia FEB. Questo metodo automatizzato consente misurazioni rapide e accurate per la validazione di interazioni proteiche.

Esplorare linterazione biomolecolare tra lo chaperone molecolare Hsp90 e la sua proteina chinasi cliente Cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo (Video) | JoVE Journal

Esplorare l'interazione biomolecolare tra lo chaperone molecolare Hsp90 e la sua proteina chinasi cliente Cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo

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