Esplorare l'interazione biomolecolare tra lo chaperone molecolare Hsp90 e la sua proteina chinasi cliente Cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo

FEB è una piattaforma di rilevamento dell'interazione ______ _______ senza etichette ed economica che offre misurazioni rapide e accurate. Questo metodo offre la convalida di interazioni note o sconosciute e un modo semplice per testare potenziali inibitori delle interazioni biomolecolari. Il vantaggio principale di FEB è il suo software automatizzato e intuitivo che blocca l'utente durante l'esperimento con una piattaforma di pipettaggio manuale aperta, consentendo agli utenti di lavorare con poca o addirittura nessuna formazione.

La tecnologia FEB offre anche applicazioni in diversi campi del settore farmaceutico, analisi biomolecolare di piccole molecole, peptidi e proteine, convalida di farmaci traducendo prontamente l'attività biologica in vitro in efficacia in vivo. Essendo un principiante, potresti dover affrontare sfide nella scelta delle giuste concentrazioni di analiti per ottimizzare l'esperimento per ottenere un valore KD affidabile. Consigliamo di prestare attenzione al processo di funzionalizzazione del chip e al corretto scambio di buffer.

Iniziare mescolando volumi uguali di soluzione EDC e sulfo-NHS tubando su e giù. Posizionare il chip del biosensore fornito dall'azienda in una capsula di Petri di vetro con un coperchio montato. Tutte le fasi di funzionalizzazione coinvolte nell'attivazione del chip sono suggerite per essere eseguite all'interno della capsula di Petri.

Applicare 50 microlitri di tampone MES monofusolare al chip del biosensore. Incubare per un minuto a temperatura ambiente. Quindi, aspirare il tampone e applicare immediatamente 50 microlitri della soluzione EDC sulfo-NHS al chip del sensore.

Coprire la capsula di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione EDC sulfo-NHS dal chip e applicare 50 microlitri di tampone MES monomolare. Aspirare il buffer MES e risciacquare il chip due volte con 50 microlitri di 1X PBS.

Aspirare il PBS dal chip e aggiungere la molecola bersaglio Hsp90. Coprire la capsula di Petri di vetro e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aspirare la soluzione contenente la molecola bersaglio e risciacquare tre volte con 50 microlitri di 1X PBS.

Aspirare la soluzione 1X PBS dal chip e aggiungere 50 microlitri della soluzione quench one. Coprire la capsula di Vetro di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di spegnimento dal chip e aggiungere 50 microlitri della soluzione di spegnimento due.

Coprire la capsula di Vetro di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare la soluzione di spegnimento due dal chip e risciacquare il chip cinque volte utilizzando 50 microlitri di 1X PBS lasciando l'ultima goccia PBS sul sensore. Preparare la serie di diluizione dell'analita per Cdc37 nell'intervallo di concentrazione desiderato.

Progettare l'esperimento per includere almeno otto diverse concentrazioni di analiti per ottenere una costante di dissociazione affidabile, o valore KD, e preparare queste diverse diluizioni nello stesso buffer utilizzato per la calibrazione e la proteina bersaglio. Posizionare il chip con attenzione sullo strumento. Assicurarsi che il software sia acceso e che la spia LED diventi verde.

Quindi, premere il modulo Esegui esperimento sul software automatizzato e scegliere 10 punti con rigenerazione o qualsiasi altro protocollo desiderato. Immettere i dettagli quali il nome dell'operatore, il nome dell'esperimento, la data, il buffer di rigenerazione, la destinazione immobilizzata e l'analita in soluzione. Premere il pulsante Inizia esperimento visualizzato sul software e seguire le istruzioni visualizzate dal software automatizzato.

Per eseguire la calibrazione dello strumento, aspirare la soluzione PBS rimanente dal chip e applicare 50 microlitri del buffer di calibrazione. Premere il pulsante Continua e attendere cinque minuti fino al termine della fase di calibrazione. Il software visualizza l'endpoint determinato per la fase di calibrazione con un allarme di avviso da seguire.

Quindi, eseguire un'associazione analitica aspirando il buffer di calibrazione dal chip e applicando 50 microlitri della più bassa concentrazione di analita. Premere il pulsante Continua e attendere cinque minuti fino al termine del passaggio di associazione. Il software visualizza il punto finale per la fase di associazione con un allarme di avviso per procedere.

Per eseguire una dissociazione dell'analita, aspirare la soluzione di analita dal chip e applicare 50 microlitri del tampone di dissociazione. Premere il pulsante Continua. Dopo la durata della fase di dissociazione, il software visualizza l'endpoint per la fase di dissociazione con un allarme di avviso.

Quindi, eseguire la rigenerazione del chip aspirando la soluzione di dissociazione dal chip e applicando 50 microlitri del buffer di rigenerazione. Quindi, premere il pulsante Continua. Il completamento della fase di rigenerazione richiede in genere circa 30 secondi.

Successivamente, il software visualizza il punto finale per la fase di rigenerazione con un allarme di avviso da seguire. Infine, per lavare il chip, aspirare la soluzione di rigenerazione dal chip e applicare 50 microlitri del tampone di lavaggio. Aspirare la soluzione dal chip e ripeterla cinque volte.

Lasciare l'ultima goccia del tampone di lavaggio sul chip. Quindi, premere il pulsante Continua e attendere 30 secondi fino al termine della durata della fase di lavaggio nel display del software. Ripetere i passaggi per ogni concentrazione di analita utilizzata.

Le cinque fasi della calibrazione, dell'associazione dell'analita, della dissociazione, della rigenerazione e del lavaggio cinque volte costituiscono un ciclo. Premere il pulsante Analisi nel software di analisi automatizzato alla fine dell'esperimento. Apparirà una finestra di visualizzazione contenente tutti i punti sperimentali.

Assicurarsi che le concentrazioni di analiti utilizzate per il protocollo prescritto siano corrette. Premere il pulsante Esegui analisi per generare automaticamente il valore KD. Il software genera un grafico hill fit tracciando le concentrazioni di analiti rispetto alle corrispondenti risposte I da cui viene calcolata la costante di dissociazione all'equilibrio.

La proteina bersaglio Hsp90 è stata immobilizzata al chip e per il primo esperimento sono state preparate 10 concentrazioni della proteina analitica Cdc37 che vanno da 25 nanomolari a 5.000 nanomolari. I file di dati generati dall'esperimento uno sono stati mostrati qui. I dati sperimentali monitorati in tempo reale sono mostrati qui.

L'asse Y corrisponde alla risposta I nelle unità del biosensore e l'asse X corrisponde ai diversi punti temporali e alle concentrazioni dell'analita nell'esperimento. L'immagine grafica qui mostrata rappresenta il grafico hill fit generato dal software di analisi automatizzato. L'asse Y corrisponde alla risposta I nelle unità del biosensore e l'asse X corrisponde alle diverse concentrazioni di analiti nell'esperimento.

L'immagine grafica qui mostrata rappresenta il grafico di associazione generato utilizzando il software di analisi statistica. L'asse Y corrisponde alla risposta I alla fine della fase di associazione e l'asse X corrisponde alle diverse concentrazioni dell'analita Cdc37. Nell'esperimento due, è stato utilizzato un diverso insieme di concentrazioni che vanno da 0,4 nanomolari a 200 nanomolari e i file di dati generati sono mostrati qui.

Le immagini grafiche rappresentano il termogramma ITC dell'interazione Hsp90 e Cdc37. Qui sono mostrate le corrispondenti curve di evoluzione termica ottenute a causa delle iniezioni consecutive di Cdc37 in Hsp90 a 298,15 Kelvin. La potenza differenziale utilizzata qui è una funzione del tempo.

I punti dati integrati in questo grafico designano il corrispondente calore normalizzato rispetto al rapporto Mueller di Hsp90 a Cdc37. L'approccio di pipettaggio aperto utilizzato qui richiede che l'utente abbia una padronanza di base del pipettaggio manuale, assicurandosi di non toccare il biosensore con la punta. La riproducibilità della temporizzazione del passo dipende interamente dall'utente.

Una volta che il ricercatore caratterizza un'interazione tra due biomolecole, possiamo eseguire un esperimento di screening progettando potenziali inibitori o modulatori mirati alla specifica interazione biomolecolare utilizzando il sistema FEB. Questa procedura può essere utilizzata per identificare, verificare e quantificare l'interazione nota e nuova tra proteine, nonché piccole molecole, inclusi farmaci e peptidi.