Intervista: Antigen Presentazione glicolipide da CD1d e il potenziale terapeutico di attivazione delle cellule NKT

Ciao, mi chiamo Mitchell Cronenberg e sono al La Jolla Institute for Allergy and Immunology. In realtà sono il presidente e il direttore scientifico, ma ho un laboratorio di ricerca molto attivo ed è di questo che parleremo, ovviamente, è una delle tecnologie che abbiamo, che sono i tetrameri CD 1D. La maggior parte del lavoro nel mio laboratorio riguarda le cellule T reattive CD 1D.

E queste cellule sono uniche perché riconoscono i glicolipidi piuttosto che i peptidi. E un'altra branca del mio laboratorio si occupa di un argomento completamente diverso, il sistema immunitario delle mucose e la sua regolazione. Le molecole CD 1 sono molecole presentanti l'antigene, il che significa che legano antigeni o frammenti di proteine o altre molecole e li sostengono per il riconoscimento delle cellule T.

Ora ci sono davvero due diversi tipi di molecole che presentano l'antigene. Ci sono quelli che contengono o presentano peptidi e ci sono quelli che trattengono lipidi e glicolipidi. E le molecole CD uno trattengono lipidi e glicolipidi.

Questa è la loro funzione e loro, sostengono o presentano questi lipidi e glicolipidi per le cellule T. E in realtà ci sono quattro diversi tipi di molecole CD uno, CD uno, A, B, C e D. E in realtà ci concentriamo su CD 1D e CD 1D in particolare è, è probabilmente il miglior studio in parte perché ci sono modelli murini. E il CD 1D presenta glicolipidi a un particolare tipo di cellula T chiamata cellula T natural killer, un insolito globulo bianco che ha caratteristiche della risposta immunitaria innata e adattativa.

I glicolipidi che si presentano possono essere autoglicolipidi, anche se a questo punto non sono molto ben caratterizzati, oppure possono essere glicolipidi microbici. E i glicolipidi che sappiamo che vengono presentati provengono da due fonti. Uno sono quelli che vengono chiamati batteri FMS, che sono probabilmente i batteri più abbondanti nella biosfera.

Vivono nell'oceano, vivono nelle piante, vivono nel suolo. Tuttavia, non fanno ammalare molte persone. Siamo molto abituati a convivere con questi batteri, suppongo.

E la seconda categoria che conosciamo, un diverso tipo di glicolipide chiamato dyl glicerolo contenente glicolipidi. Questi si trovano nella Borrelia borre, che causa la malattia di Lyme e probabilmente in molti altri agenti patogeni. E stiamo scoprendo solo ora quali sono i diversi tipi di batteri che hanno questi glicolipidi.

Quindi abbiamo quelli che vengono chiamati lipidi glico singali dall'SMS e lipidi dyl glicerolo dalla Borrelia e probabilmente molti altri che sono veramente patogeni. Questi lipidi vengono caricati su molecole CD 1D sulle cellule dendritiche, principalmente, anche se potrebbero essere linfociti B, cellule ER nel fegato e forse altri tipi di cellule. Queste molecole CD 1D passano attraverso i lisosomi e gli endosomi dove probabilmente legano questi lipidi e poi trasportano il lipide sulla superficie cellulare per il riconoscimento da parte delle cellule T, comprese le cellule T natural Killer che ho menzionato prima.

Una delle cose che accade se si è esposti a un batterio che ha glicolipidi è che le cellule T NK si attivano molto rapidamente. Cellule T convenzionali. In altre parole, le cellule T reattive ai peptidi in genere impiegano tre o quattro giorni per ottenere una buona risposta immunitaria, soprattutto se non hanno esperienza con l'antigene.

In altre parole, se lo fanno, sono ingenui. Al contrario, le cellule T NK possono essere attivate nel giro di poche ore e inizieranno a produrre citochine come l'interferone gamma, importanti per la clearance batterica in un periodo di tempo molto, molto breve. E in questo modo, assomigliano ad aspetti della risposta immunitaria innata del modello.

Dallo studio degli antigeni modello. Sappiamo che la CD 1D entra negli endosomi tardivi e nei lisosomi, compartimenti intracellulari molto acidi in cui gli antigeni glicolipidici vengono caricati in CD uno, e sono infatti speciali proteine di trasferimento all'interno delle cellule presentanti l'antigene come le cellule dendritiche che aiutano a caricare i lipidi nella molecola CD 1D con questi batteri fona. Borre Bacteria e altri avevano a che fare con batteri extracellulari. Quindi gli antigeni lipidici devono essere in qualche modo trasportati nella cellula, probabilmente in un lisosoma caricato nella molecola CD uno.

E poi c'è un'attivazione immediata della cellula NKT e tutto questo deve avvenire all'interno, entro poche ore nelle sinusoidi, nella Liv del fegato, nella milza, forse nel midollo osseo e in altri siti dove si trovano le cellule NKT. La struttura tetramerica è davvero la chiave per definire in modo inequivocabile queste cellule T natural killer, che hanno queste proprietà innate che le distinguono dalle altre cellule T. Gli altri marcatori disponibili sono davvero troppo ambigui, ma questo, i tetrameri consentono di identificare le cellule in base alla loro specificità del recettore dell'antigene, che è il fatto chiave che le definisce in un certo senso, la produzione di tetrameri risale a molto tempo fa.

È stato inventato da Mark Davis e John Alman, e l'idea era che il recettore delle cellule T ha una bassa affinità, e se si vogliono definire le cellule o identificare le cellule in base alla loro specificità, i peptidi che riconoscono o i complessi di peptidi e molecole presentanti l'antigene non hanno abbastanza affinità, abbastanza forza di legame per consentire di identificare la cellula. E così ciò che Mark Davis e John Allman hanno inventato è stata questa tecnologia del tetramero, un modo per rendere i tremori in alcuni casi OCR della molecola presentante l'antigene più la molecola che presentano, il che fondamentalmente aumenta l'affinità o l'affinità dell'interazione. Quindi puoi vedere la cellula specifica per il peptide dell'influenza e una particolare molecola che presenta l'antigene o qualunque sia l'antigene che ti interessa.

Una tecnologia molto importante perché permette, ad esempio, di vedere quanto potrebbe essere efficace un regime vaccinale. Quello che abbiamo fatto a partire dalla fine degli anni Novanta, in origine era un articolo pubblicato nel 2000 che è stato citato circa 500 volte fino ad ora. Quello che abbiamo fatto è stato semplicemente adottare quella tecnologia per i lipidi.

Così abbiamo creato delle molecole solubili di CD 1 e, con metodi, le descriverò tra poco, siamo stati in grado di mizzarle, in altre parole, di mizzarle, di aggiungerle con glicolipidi specifici, e in questo modo abbiamo potuto usarle come reagenti per saggiare specifici recettori delle cellule T. In altre parole, quelli che vedrebbero il glicolipide che ci interessa più il CD 1D. Il Tetris può essere utilizzato in qualsiasi situazione in cui si voglia analizzare il numero di cellule NKT e il loro stato di attivazione e la loro funzione.

E nel nostro laboratorio potrebbe provenire da uno qualsiasi dei numerosi progetti diversi. Ad esempio, se vuoi chiedere, un particolare mutante e una via di segnalazione influenzano lo sviluppo delle cellule T NK, possiamo farlo con i nostri tetrameri, chiedere il numero di cellule NKT. E poi ci sono altri marcatori, altre proteine della superficie cellulare che possiamo osservare che ci aiuteranno a valutare se le cellule NKT sono mature o se ci sono attivate utilizzando i tetrameri noi, dopo una stimolazione antigenica, possiamo anche chiederci, non solo sono attivati, ma quali citochine stanno producendo.

Quindi possiamo combinare la colorazione del tetramero con, ad esempio, la colorazione intracellulare delle citochine e chiedere quale percentuale delle cellule NKT produce interferone gamma, quale percentuale sta producendo IL quattro, quale percentuale sta producendo, sia con la citometria a flusso multiparametrico, possiamo, possiamo porre una varietà di domande sulla produzione di citochine direttamente ex vivo da queste cellule. Possiamo anche, possiamo anche fare ulteriori esperimenti. Ad esempio, possiamo utilizzare i tetrameri per purificare le cellule T NK per la coltura in vitro per chiedere come interagiscono con altri tipi di cellule, o anche per il trasferimento a un animale ricevente, ad esempio, che potrebbe essere privo di cellule T NK per motivi genetici.

Vogliamo ripristinare quella funzione. Possiamo farlo e chiedere e chiedere dove si trovano le cellule e come funzionano. Infine, so che, nel caso delle cellule NKT umane, le persone hanno effettivamente usato i tetrameri per espandere le linee cellulari in vitro per far crescere le cellule per scopi analitici e potenzialmente anche per scopi terapeutici.

Bene, usiamo un sistema di espressione del virus Bao per generare tetrameri CD 1D. Quindi il processo inizia con un costrutto di DNA comune che contiene il promotore e l'espressione della microglobulina BID due e della catena pesante CD 1D. Quindi, questa molecola CD 1 è un eterodimero di due polipeptidi.

Quindi abbiamo questo sistema di espressione a due, due promotori, e infettiamo le cellule di coltura dei tessuti degli insetti con i virus vao accuratamente titolati come spiegato dal nostro canale. E poi infettiamo le cellule e raccogliamo dal terreno di coltura tissutale, la proteina che viene espressa dalle cellule. La catena pesante CD 1D è stata progettata appositamente per la produzione di tetrameri.

Ci sono due cose, o meglio tre cose che dovrei dire, che facciamo. Uno è che rimuoviamo il pezzo transmembrana. Quindi noi, abbiamo, stiamo esprimendo una proteina solubile.

In secondo luogo, abbiamo aggiunto un esagono, la sua targhetta, in modo che la proteina possa essere purificata mediante cromatografia con ioni metallici. E il terzo è che abbiamo quella che viene chiamata una birra, un sito per la biotina enzimatica. E questa è l'innovazione.

È stato molto importante quando Davis e Alman hanno inventato per la prima volta la tecnologia di produzione dei tetrameri. Quindi, dopo aver raccolto la proteina, viene purificata sul comp di nichel mediante cromatografia su colonna di nichel. A volte eseguiamo la cromatografia ad esclusione dimensionale.

E poi la proteina può essere biotinilata enzimaticamente incubata, e una volta biotinilata enzimaticamente, quando viene incubata con streptococco ab, formerà tetrameri. Ma la proteina solubile CD 1 che è alimentata può essere incubata praticamente da un giorno all'altro in una soluzione di un glicolipide di interesse. È molto importante che il glicolipide non venga disciolto nel DMSO, perché è tipico dei glicolipidi come diluente o solvente, perché il CD è molto sensibile a questo.

Quindi in genere usiamo a, un buffer che contiene una piccola quantità di interpolazione e PBS. E quel tampone è, è, è molto efficace per sciogliere la maggior parte dei nostri glicolipidi. E per il caricamento nel CD 1D, che sembra avvenire spontaneamente, utilizziamo streptavidina di una varietà di produttori.

E accoppiato a coloranti pe, fico, eryn o PC ficocianine, entrambi, sembra funzionare molto bene e ci dà un'ottima colorazione. Quindi, nel complesso, la procedura non è troppo diversa dalle procedure ben caratterizzate per la produzione di tetrameri MHC di Classe Uno, tranne per il fatto che non lo facciamo, non usiamo l'espressione batterica, usiamo l'espressione di virus batterici e, naturalmente, abbiamo antigeni lipidici piuttosto che peptidi. Un punto che dovrei sottolineare è che gli esseri umani hanno cellule T NK e hanno la stessa specificità delle cellule T NK di topo.

Quindi la specificità è stata per almeno 60 milioni di anni da quando ci siamo separati dai roditori, e infatti, realizziamo tetrameri CD 1D umani con le stesse tecniche che voi, potete vedere nel video che è stato fatto qui. E, in realtà, le cellule T NK umane funzionano molto bene con i tetrameri di topo e viceversa. Quindi non produciamo i tetrameri umani così spesso solo perché possiamo usare i nostri tetrameri del mouse per il lavoro umano.

Quindi ci sono molti modelli murini in cui le cellule T NK hanno dimostrato di essere determinanti critici dell'esito della risposta immunitaria. E questo va dalla risposta ai tumori, alla regolazione delle malattie autoimmuni, all'eliminazione degli agenti infettivi e persino allo sviluppo di placche sclerotiche. Questo è un processo infiammatorio cronico che si verifica nelle arterie.

C'è un po' di dubbio sull'importanza di queste cellule negli esseri umani, dove ce ne sono un po' meno abbondanti, ci sono stati molti rapporti che indicano che sono alterate negli stati autoimmuni, e ci sono anche rapporti che sono molto arricchite nei polmoni dei pazienti asmatici. Sebbene questi rapporti siano l'unico rapporto dell'England Journal of Medicine, c'è qualche controversia al riguardo. Ma ci sono una serie di studi sugli esseri umani che suggeriscono che queste cellule potrebbero essere importanti.

In termini di studi clinici, la stimolazione delle cellule NKT è stata testata in quattro studi di fase uno per pazienti con cancro avanzato. E ci sono alcune prove di efficacia, naturalmente, queste persone sono molto malate e per questo sono in corso studi su diversi tipi di cancro. E ci sono persone che sono interessate a utilizzare la terapia con cellule T NK anche nelle malattie autoimmuni, anche se questo non è ancora decollato.

I tetrameri possono svolgere un ruolo in questi studi principalmente in termini di analisi di ciò che è accaduto alle cellule NKT dopo la terapia con agonisti. Quindi l'idea in genere è quella di utilizzare agonisti glicolipidici o in alcuni casi anche antagonisti glicolipidici, che altri gruppi stanno sviluppando, a seconda della risposta e della condizione. E poi per valutare cosa succede, cosa è successo alle cellule T NK, cosa che si farebbe normalmente con i tetrameri.

L'altro potenziale utilizzo sarebbe nell'espansione in vitro di cellule NKT umane. È abbastanza fattibile e del tutto possibile far crescere un gran numero di cellule NKT umane in vitro, ad esempio, mediante stimolazione antigenica, che potrebbe essere fatta con tetrameri o potrebbe essere fatta con cellule con i glicolipidi giusti. E oltre a utilizzare il tetramero o le cellule, è necessario aggiungere citochine.

Ma in queste condizioni, si può espandere un gran numero di cellule T NK umane. E un altro è almeno un gruppo a Boston interessato a quel tipo di terapia in contrapposizione alla terapia a base di glicolipidi. Un'altra parte del mio laboratorio è coinvolta nello studio dell'immunità della mucosa.

La maggior parte degli immunologi si è concentrata sui linfociti o sui globuli bianchi nel linfonodo e nella milza. Eppure forse la maggior parte di quelli che si trovano nel nostro corpo si trovano in realtà nella mucosa intestinale, un sito dove abbiamo anche tra il 10° e il 14° e il 10° e il 10° e il 15° batterio probabilmente. Quindi siamo per lo più sterili da un punto di vista microbico, ma non nel nostro intestino.

E anche nell'intestino abbiamo una collezione molto ampia di globuli bianchi. Queste cellule hanno proprietà uniche e in realtà sono in qualche modo poco studiate. Quindi abbiamo alcune indagini scientifiche di base su queste cellule.

Ma studiamo anche un processo di quella che chiamerei disregolazione immunitaria, l'intestino che porta alla malattia infiammatoria intestinale, che è fondamentalmente una malattia immunomediata dell'intestino tenue o crasso, e vanno sotto il nome di morbo di Crohn o colite ulcerosa. E anche se facciamo un po' di lavoro umano, la maggior parte del nostro lavoro è su modelli murini. Abbiamo quelli che considero ottimi modelli murini per la disregolazione del sistema immunitario della mucosa che porta a sintomi simili al morbo di Crohn.

Stiamo studiando questo processo e anche i modi per interferire con quel processo, in ultima analisi con la speranza di sviluppare terapie migliori per i pazienti che soffrono di queste malattie immuno-mediate. Quindi, in conclusione, potremmo pensare un po' a dove andrà l'immunologia nei prossimi 10 anni circa, ed è davvero difficile vedere 10 anni avanti. Per quanto sorprendente possa sembrare.

Penso che il sistema immunitario della mucosa sia una delle principali aree inesplorate dell'immunologia. Anche se sempre più persone e sempre più gruppi di alto profilo si stanno interessando agli studi di immunologia della mucosa. Penso che un'altra area che avrà un impatto enorme è la genetica, e in particolare la genetica umana. Mentre migriamo o avanziamo, direi, fino alla sequenza 1.000 di un genoma di un genoma umano, sarà davvero possibile fare studi sugli individui e valutare come la variabilità del DNA influenza la risposta immunitaria.

In questo momento, la maggior parte delle migliori indagini sui percorsi di base coinvolgono i roditori. I roditori, in particolare i topi, sono davvero fondamentali per i nostri studi. Ma penso che in futuro, quando considereremo fenomeni autoimmuni complessi o altre cose che potrebbero accadere negli individui, saremo in grado di farlo sulla base dei polimorfismi genetici umani.

Saremo in grado di valutare i polimorfismi e quindi utilizzare tali informazioni per cercare di prevedere come ciò influenzerà le risposte immunitarie e alla fine ci sposteremo verso ciò che io, ciò che chiamerei e ciò che altri chiamano terapie immunitarie personalizzate o, in senso più ampio, medicina personalizzata. Quindi la genetica avrà un impatto enorme. Abbiamo già ottimi strumenti nella genetica dei topi.

Possiamo eliminare qualsiasi gene vogliamo. Possiamo eliminare l'espressione di geni in particolari tipi di cellule. Possiamo fare cose incredibili.

Ma penso che in futuro cercheremo di capire la risposta immunitaria e l'immunità dal punto di vista delle risposte umane.