Name: Precipitazione di proteine organiche a base di solventi per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Scopri la precipitazione proteica con solventi per purificare il proteoma prima della spettrometria di massa. Questo metodo rapido garantisce elevato recupero e purezza delle proteine.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Gli autori ringraziano Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) e SPARC BioCentre (Molecular Analysis) presso l'Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) per il loro contributo all'acquisizione dei dati sulla SM.

1. Considerazioni sui materiali e pre-preparazione del campione
<ol><li>Utilizzare solo solventi ad alta purezza (acetone, cloroformio, metanolo) (>99,5%) e sostanze chimiche, privi di umidità in eccesso.</li>
	<li>Preparare soluzioni di cloruro di sodio e solfato di zinco (1 M) in acqua. NOTA: le soluzioni saline possono essere conservate indefinitamente a temperatura ambiente, purché siano prive di contaminanti o crescita microbica.</li>
	<li>Utilizzare il più piccolo flaconcino di microcentrifuga in polipropilene (PP) sufficiente a trattenere il volume richiesto di campione e solventi per indurre la precipitazione.</li>
	<li>Assicurarsi che la concentrazione di SDS nel campione da precipitare non sia superiore al 2% (p/v). Se la SDS è più alta, diluire il campione con acqua.</li>
	<li>Garantire una concentrazione proteica compresa tra 0,01 e 10 g/L per un'efficienza di precipitazione ottimale. NOTA: La massa ottimale per le precipitazioni varia tra 1-100 μg di proteine.</li>
	<li>Assicurarsi che tutti i solventi e le soluzioni siano privi di particolato prima dell'uso. Eseguire una fase di filtrazione (<0,5 μm) o centrifugazione (10.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente) per rimuovere il particolato non disciolto.</li>
	<li>Se sono necessarie la riduzione del legame disolfuro e l'alchilazione, eseguire questi passaggi prima della precipitazione delle proteine. I reagenti riducenti e alchilanti in eccesso verranno rimossi attraverso il processo di precipitazione.</li>
	<li>Precipitare le proteine selezionando ed eseguendo uno dei protocolli (passaggi 2, 3, 4 o 5).</li>
</ol>2. Precipitazione rapida delle proteine (a base di flaconcino) con acetone
<ol><li>Pipettare 90 μL di proteina (priva di particolato) o soluzione di proteoma in un tubo microcentrifuga in PP. Quindi, aggiungere 10 μL di 1 M nacl acquoso. NOTA: Se la forza ionica dell'estratto di proteoma supera già i 100 mM, non è necessario alcun sale aggiuntivo.</li>
	<li>Pipettare 400 μL di acetone nel campione. Tappare il flaconcino e picchiettare delicatamente il flaconcino per unire i solventi. Non è richiesta una miscelazione vigorosa. NOTA: Il volume di proteine, sale e acetone può essere aumentato purché venga mantenuto il rapporto relativo di ciascuno.</li>
	<li>Lasciare incubare il flaconcino a temperatura ambiente, indisturbato, per un minimo di 2 minuti. NOTA: incubazioni più lunghe, comprese quelle a temperatura ridotta (ad esempio, la precipitazione convenzionale dell'acetone impiega precipitazioni notturne nel congelatore), possono comportare la formazione di particelle proteiche aggregate più grandi (visibili) (Figura 1A), che generalmente non migliorano il recupero totale delle proteine.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, posizionare i campioni in una centrifuga, notando l'orientamento del flaconcino. Ruotare per un minimo di 2 minuti, a 10.000 x g o superiore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scomporre il flaconcino e decantare delicatamente il surnatante invertendo lentamente il flaconcino in un contenitore per i rifiuti. Toccare il flaconcino invertito su un tovagliolo di carta per estrarre il solvente residuo dal flaconcino. ATTENZIONE: i solventi di scarto devono essere trattenuti e scartati secondo i protocolli appropriati.</li>
	<li>Per i campioni contenenti SDS, erogare 400 μL di acetone fresco, facendo attenzione a non disturbare il pellet. NOTA: il passaggio 2.6 è facoltativo.<ol><li>Centrifugare immediatamente il campione (10.000 x g o superiore per 1 minuto a temperatura ambiente), posizionando il flaconcino nel rotore con lo stesso orientamento dello spin iniziale. Decantare il solvente di lavaggio come descritto al punto 2.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Lasciare asciugare completamente il campione con il tappo aperto (~1 min). Ricapitolare il flaconcino e procedere con la solubilizzazione del pellet (fase 6).</li>
</ol>3. Precipitazione di peptidi a basso peso molecolare (LMW) (ZnSO4 + acetone)
<ol><li>Erogare 54 μL di estratto di proteoma in un flaconcino di PP da 2 mL, quindi aggiungere 6 μL di 1 M ZnSO4. NOTA: Il recupero ottimale dei peptidi LMW (≤5 kDa) si ottiene aggiungendo acetone ad un 97% finale in volume. Assumendo un flaconcino di PP da 2 mL, il volume massimo iniziale del campione è di 54 μL.</li>
	<li>Aggiungere 1940 μL di acetone a un 97% finale in volume. Ruotare delicatamente per mescolare e lasciare riposare indisturbato sul piano di lavoro per un minimo di 2 minuti.</li>
	<li>Centrifugare (10.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente) e rimuovere il surnatante invertendo il flaconcino, quindi toccando il flaconcino in un tovagliolo di carta.</li>
	<li>Per i campioni contenenti SDS, erogare 400 μL di acetone fresco, facendo attenzione a non disturbare il pellet. NOTA: il passaggio 3.4 è facoltativo.<ol><li>Centrifugare immediatamente il campione come da passo 3.3, posizionando il flaconcino nel rotore nello stesso orientamento dello spin iniziale. Decantare il solvente di lavaggio come descritto al punto 3.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Risolubilizzare il pellet secco risultante in un solvente acquoso con breve vortice o sonicazione (~5 min).</li>
</ol>4. Precipitazione delle proteine mediante cloroformio/metanolo/acqua (CMW)
<ol><li>Erogare 100 μL della proteina o della soluzione di proteoma in un flaconcino di PP. Aggiungere 400 μL di metanolo, seguiti da 100 μL di cloroformio. Chiudere brevemente il flaconcino e il vortice per mescolare. NOTA: per le precipitazioni CMW, sono preferiti flaconcini da 1,5 ml con fondo stretto (Figura 2A). ATTENZIONE: il solvente cloroformio deve essere maneggiato in un'adeguata cappa di ventilazione. Tutti i solventi che entrano in contatto con il cloroformio devono essere trattati come rifiuti alogenati quando vengono smaltiti.</li>
	<li>Erogare rapidamente 300 μL di acqua direttamente nel centro del flaconcino. Chiudere il flaconcino. Lasciare riposare il campione sul banco indisturbato per 1 minuto. NOTA: la soluzione apparirà immediatamente bianca torbida. Evitare di mescolare il flaconcino dopo l'aggiunta di acqua.</li>
	<li>Posizionare il flaconcino di PP in una centrifuga e ruotare per un minimo di 5 minuti (10.000 x g o superiore a temperatura ambiente). NOTA: Una volta centrifugati, si formeranno due strati di solvente visibili (strato superiore = metanolo/acqua; fondo = cloroformio). Un pellet proteico solido si forma all'interfaccia del solvente (Figura 2A).</li>
	<li>Utilizzando una grande punta a micropipetta (1 mL) e tenendo il flaconcino a ~45°, rimuovere ~700 μL del solvente dallo strato superiore ad una velocità uniforme.</li>
	<li>Utilizzare una punta di micropipetta più piccola (200 μL) per continuare a rimuovere lo strato superiore di solvente dal flaconcino inclinato di ~45°. Pipettare con un movimento continuo fino a quando lo strato superiore di solvente forma una perlina nel flaconcino.</li>
	<li>Aggiungere 400 μL di metanolo fresco al flaconcino campione, senza disturbare il pellet, erogando il solvente lungo il lato del flaconcino.</li>
	<li>Chiudere il flaconcino. Combinare gli strati di solvente dondolando delicatamente il flaconcino per far roteare i solventi insieme. NOTA: È essenziale evitare di interrompere il pellet. Non vortici il flaconcino.</li>
	<li>Notando l'orientamento del flaconcino nel rotore, centrifugare per un minimo di 10 minuti (10.000 x g a temperatura ambiente). Il pellet proteico aderisce al fondo del flaconcino (Figura 2B).</li>
	<li>Capovolgere il flaconcino a 45°, con il pellet rivolto verso il basso. Posizionare la punta della pipetta lungo il bordo superiore del flaconcino e rimuovere il surnatante con una punta di micropipetta da 1 mL a una velocità lenta ma continua. Trattenere ~20 μL di solvente nel flaconcino.</li>
	<li>Lavare il pellet proteico per i campioni contenenti SDS erogando lentamente 400 μL di metanolo fresco. Non vortici il flaconcino.<ol><li>Procedere direttamente con la centrifugazione (10.000 x g per 2 min a temperatura), posizionando il flaconcino nel rotore con lo stesso orientamento dello spin iniziale.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimuovere il solvente, come da passaggio 4.9. Lasciare asciugare il campione all'aria in un fumi fino a quando il solvente residuo evapora.</li>
	<li>Consultare le procedure di risolubilizzazione raccomandate nel passaggio 6.</li>
</ol>5. Precipitazione delle proteine utilizzando una cartuccia di filtrazione monouso
NOTA: Ogni protocollo di precipitazione a base solvente descritto nei passaggi da 2 a 5 può essere eseguito in una cartuccia di filtrazione ed estrazione a due stadi (vedere Tabella dei materiali).
<ol><li>Con il tappo collegato alla cartuccia di filtrazione superiore (Figura 3A), erogare il volume desiderato del proteoma, del sale e del solvente estratti come indicato in una delle tre opzioni seguenti.<ol><li>(Opzione 1) Per la precipitazione proteica con acetone, combinare 90 μL di proteina o soluzione di proteoma, 10 μL di NaCl acquoso 1 M e 400 μL di acetone. Incubare per un minimo di 2 minuti sul piano di lavoro. NOTA: si svilupperà un precipitato visibile per campioni proteici concentrati (1 g/L) (Figura 3B).</li>
		<li>(Opzione 2) Per la precipitazione peptidica LMW, combinare 15 μL del campione, 1,5 μL di 1 M ZnSO4 e 485 μL di acetone. Incubare per un minimo di 2 minuti sul piano di lavoro. NOTA: una concentrazione salina di 90 mM nel campione acquoso non influirà sul recupero rispetto ai 100 mM raccomandati nel passaggio 3.</li>
		<li>(Opzione 3) Per la precipitazione cmW, aggiungere 50 μL di estratto di proteoma, 200 μL di metanolo e 50 μL di cloroformio. Chiudere il flaconcino e vorticare brevemente per combinare.<ol><li>Erogare rapidamente 150 μL di acqua direttamente nel centro del flaconcino. Incubare per 1 minuto sul banco.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugare per 2 minuti a 2.500 x g a temperatura ambiente con la spina ancora attaccata alla cartuccia di filtrazione.</li>
	<li>Invertire la cartuccia, quindi svitare e rimuovere la spina dalla base della cartuccia.</li>
	<li>Posizionare la cartuccia filtrante in un flaconcino pulito e tornare alla centrifuga. Girare per 3 minuti a 500 x g a temperatura ambiente. Eliminare il solvente di flusso dal flaconcino inferiore. NOTA: se nella cartuccia di filtrazione superiore rimane del solvente, tornare alla centrifuga ed eseguire una rotazione aggiuntiva.</li>
	<li>Lavare il pellet proteico aggiungendo 400 μL di acetone alla cartuccia di filtrazione (per la precipitazione CMW, passaggio 5.1.3, aggiungere 400 μL di metanolo).</li>
	<li>Centrifugare per 3 minuti a 500 x g a temperatura ambiente o fino a quando non rimane alcun solvente nella cartuccia superiore.</li>
	<li>Risimolare il pellet di precipitazione come descritto nella fase 6.</li>
</ol>6. Resolubilizzazione del pellet proteico
<ol><li>Bagnare la membrana alla base della cartuccia di filtrazione erogando 2-5 μL di isopropanolo direttamente alla membrana immediatamente prima dei protocolli di risolubilizzazione descritti di seguito.</li>
	<li>Seguire uno dei seguenti metodi di resolubilizzazione.<ol><li>(Opzione 1) Aggiungere un minimo di 20 μL di tampone acquoso contenente ≥2% SDS alla cartuccia di filtrazione. Cappuccio e vortice vigorosamente (~ 1 min). In alternativa, sonicare (>10 min) per disperdere il pellet proteico.<ol><li>Riscaldare il campione a 95 °C per 5 min). Ripetere la fase di miscelazione dopo il riscaldamento. NOTA: Il tampone di carico del gel Laemmli può risisolare il pellet proteico. Tuttavia, i campioni contenenti SDS sono incompatibili con la digestione della tripsina e la LC e la SM in fase inversa.</li>
		</ol></li>
		<li>(Opzione 2) Preparare una soluzione di acido formico all'80% (v/v) in acqua. Prechill la soluzione acida (-20 °C), così come la cartuccia di filtrazione contenente proteine precipitate.<ol><li>Erogare 50 μL di acido formico freddo nella cartuccia; cappuccio e vortice per 30 s. Ritorno al congelatore (-20 °C) per 10 min.</li>
			<li>Vortice la cartuccia di nuovo per 30 s. Quindi, ripetere il ciclo di raffreddamento e miscelazione ancora una volta (10 min, -20 °C, vortice di 30 s).</li>
			<li>Aggiungere acqua a un finale di 500 μL, diluendo l'acido formico all'8%. NOTA: Il protocollo dell'acido formico freddo è incompatibile con la successiva digestione della tripsina, ma è compatibile con LC-MS.</li>
		</ol></li>
		<li>(Opzione 3) Aggiungere 50 μL di urea 8 M appena preparata in acqua alla cartuccia di filtrazione. Sonicate per 30 min.<ol><li>Lasciare incubare la cartuccia sul banco per 1 ora (fino a una notte).</li>
			<li>Diluire l'urea 8 M almeno 5 volte con acqua o tampone appropriato. NOTA: Una volta diluito, il protocollo di solubilizzazione dell'urea è compatibile con la successiva digestione della tripsina, così come con LC-MS.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Digestione delle proteine
<ol><li>Per l'analisi bottom-up della SM, sottoporre le proteine risolubilizzate alla digestione enzimatica utilizzando uno dei due metodi menzionati di seguito.<ol><li>(Opzione 1) Per la risolubilizzazione dell'acido formico, ridurre il volume iniziale dell'acido formico all'80% nei passaggi da 6.2.2.1 a 25 μL. Nel passaggio 6.2.2.3, utilizzare 375 μL di acqua per diluire l'acido formico al 5% (v/v).</li>
		<li>Erogare pepsina nella cartuccia con un rapporto approssimativo proteina/enzima di 50:1. Con un tappo collegato alla cartuccia di filtrazione, incubare il campione durante la notte a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>(Opzione 2) Per la risolubilizzazione nell'urea, garantire un pH compreso tra 8 e 8,3 con l'inclusione di 100 mM di Tris o bicarbonato di ammonio nel passaggio 6.2.3.2.<ol><li>Aggiungere tripsina ad un rapporto approssimativo tra proteine e massa enzimatica di 50:1. Con un tappo collegato alla cartuccia, incubare il campione durante la notte in un bagno d'acqua calda a 37 °C.</li>
		<li>Terminare la digestione acidificando la soluzione con il 10% di TFA fino all'1% finale.</li>
	</ol></li>
	<li>Recuperare la proteina digerita di pepsina o tripsina rimuovendo il tappo dalla base del filtro e centrifugando la cartuccia contenuta in un flaconcino pulito (2 min, 5000 x g, temperatura ambiente).</li>
</ol>8. Pulizia SPE
NOTA: per la dissalazione aggiuntiva del campione dopo la digestione o lo scambio di solventi, il campione può essere soggetto a pulizia in fase inversa come descritto.
<ol><li>Innescare una cartuccia SPE (vedi Tabella dei materiali) passando 300 μL di metanolo (2 min, 400 x g) seguiti da 300 μL di acetonitrile al 5% / 0,1% di TFA (2 min, 400 x g).</li>
	<li>Collegare la cartuccia SPE innescata alla base della cartuccia di filtrazione contenente proteine solubilizzate o digerite.</li>
	<li>Far girare la proteina attraverso la cartuccia SPE (5 min, 800 x g a temperatura ambiente). Se il solvente rimane nella cartuccia superiore, riportare la cartuccia alla centrifuga e ripetere lo spin. NOTA: il passaggio del campione attraverso la cartuccia SPE una seconda volta può migliorare il recupero.</li>
	<li>Aggiungere 300 μL di acetonitrile al 5% / 0,1% di TFA in acqua alla cartuccia. Per il lavaggio, scorrere attraverso la cartuccia SPE (2 min, 2000 x g). Scartare il flusso attraverso.</li>
	<li>Per le proteine LMW o i peptidi digeriti, eluire il campione facendo scorrere 300 μL di acetonitrile al 50%/0,1% TFA (5 min, 2500 x g).</li>
	<li>Per le proteine intatte, seguire il passaggio 8.5 con un'ulteriore fase di eluizione utilizzando 300 μL di acetonitrile al 75% / TFA allo 0,1%. Combinare i due estratti risultanti. NOTA: il passaggio 8.6 è facoltativo.</li>
</ol>

Il laboratorio Doucette ha ideato e brevettato il ProTrap XG impiegato in questo studio. AAD è anche socio fondatore di Proteoform Scientific, che ha commercializzato la cartuccia per la preparazione dei campioni.

La caratterizzazione ottimale della SM si ottiene quando la SDS residua è esaurita al di sotto di 10 ppm. Mentre approcci alternativi, come FASP e digestione su perline, offrono un esaurimento quantitativo della SDS con recupero variabile 31,32,33, l'obiettivo primario delle precipitazioni è massimizzare la purezza e la resa contemporaneamente. Ciò dipende dall'isolamento efficace del surnatante (contenente la SDS) senza disturb...

L'analisi del proteoma mediante spettrometria di massa è diventata sempre più rigorosa, grazie alla maggiore sensibilità, risoluzione, velocità di scansione e versatilità dei moderni strumenti MS. I progressi della SM contribuiscono a una maggiore efficienza di identificazione delle proteine e a una quantificazione più precisa 1,2,3,4,5. Con una migliore strumentazione per la SM, i ricercatori richiedono una strategia di preparazione del campione front-end corrispondentemente coerente in grado di recuperare quantitativamente proteine ad alta purezza in un tempo minimo in tutte le fasi del flusso di lavoro 6,7,8,9,10,11 . Per riflettere accuratamente lo stato del proteoma di un sistema biologico, le proteine devono essere isolate dalla matrice del campione nativo in modo efficiente e imparziale. A tal fine, l'inclusione di un tensioattivo denaturante, come il sodio dodecil solfato (SDS), garantisce un'efficiente estrazione e solubilizzazione delle proteine12. Tuttavia, la SDS interferisce fortemente con la ionizzazione elettrospray, causando una grave soppressione del segnale MS se non adeguatamente eliminata13.
Varie strategie di deplezione della SDS sono disponibili per la successiva analisi del proteoma, come la ritenzione di proteine al di sopra di un filtro di taglio a peso molecolare contenuto all'interno di cartucce di spin monouso 14,15,16. Il metodo di preparazione del campione assistito da filtro (FASP) è favorito in quanto esaurisce efficacemente la SDS al di sotto di 10 ppm, facilitando la SM ottimale. Tuttavia, il recupero delle proteine con FASP è variabile, il che ha spinto l'esplorazione di altre tecniche. Gli approcci cromatografici che catturano selettivamente le proteine (o tensioattivi) si sono evoluti in varie cartucce convenienti o formati basati su perline 17,18,19,20,21. Date queste strategie semplici e (idealmente) coerenti per la purificazione delle proteine, l'approccio classico della precipitazione delle proteine con solventi organici è spesso trascurato come un approccio promettente all'isolamento proteico. Mentre la precipitazione del solvente ha dimostrato di esaurire con successo la SDS al di sotto dei livelli critici, il recupero delle proteine è stato una preoccupazione di lunga data di questo approccio. Più gruppi hanno osservato un bias di recupero delle proteine, con rese di precipitazione inaccettabilmente basse in funzione della concentrazione proteica, del peso molecolare e dell'idrofobicità22,23. A causa della diversità dei protocolli di precipitazione riportati in letteratura, sono state sviluppate condizioni di precipitazione standardizzate. Nel 2013, Crowell et al. hanno riportato per la prima volta la dipendenza della forza ionica dall'efficienza di precipitazione delle proteine nell'80% di acetone24. Per tutte le proteine esaminate, l'aggiunta di cloruro di sodio fino a 30 mM si è dimostrata essenziale per massimizzare le rese (fino al 100% di recupero). Più recentemente, Nickerson et al. hanno dimostrato che la combinazione di una forza ionica ancora più elevata (fino a 100 mM) con temperatura elevata (20 ° C) durante la precipitazione dell'acetone ha dato un recupero quasi quantitativo in 2-5 min25. È stato osservato un leggero calo nel recupero delle proteine a basso peso molecolare (LMW). Pertanto, un successivo rapporto di Baghalabadi et al. ha dimostrato il successo del recupero di proteine e peptidi LMW (≤5 kDa) combinando sali specifici, in particolare solfato di zinco, con un livello più elevato di solvente organico (acetone al 97%)26.
Mentre il perfezionamento del protocollo di precipitazione conferisce una strategia di purificazione delle proteine più affidabile per la proteomica basata sulla SM, il successo della precipitazione convenzionale dipende fortemente dalla tecnica dell'utente. Un obiettivo primario di questo lavoro è quello di presentare una robusta strategia di precipitazione che faciliti l'isolamento del pellet proteico dal surnatante contaminante. È stata sviluppata una cartuccia di filtrazione monouso per eliminare il pipettaggio isolando proteine aggregate sopra un filtro poroso a membrana in PTFE27. I componenti che interferiscono con LA SM nel surnatante vengono efficacemente rimossi in una breve fase di centrifugazione a bassa velocità. La cartuccia filtrante monouso offre anche una cartuccia SPE intercambiabile, che facilita la successiva pulizia del campione dopo la resolubilizzazione e la digestione proteica opzionale, prima della spettrometria di massa.
Una serie di flussi di lavoro raccomandati per la precipitazione del proteoma sono presentati qui, compresi i protocolli modificati di acetone e cloroformio / metanolo / acqua28 , in un formato convenzionale (basato su fiala) e semi-automatizzato in una cartuccia di filtrazione ed estrazione a due stati usa e getta. Vengono evidenziati i recuperi proteici risultanti e le efficienze di deplezione SDS, insieme alla copertura del proteoma LC-MS/MS bottom-up, per dimostrare il risultato atteso da ciascun protocollo. Vengono discussi i vantaggi pratici e gli svantaggi associati a ciascun approccio.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC177170010</td><td>&le; 0,002 % aldeide</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>Grado HPLC</td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6141-1KG</td><td>solido</td></tr><tr><td>Beta mercaptoetanolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>Grado in biologia molecolare</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>B8026-5G</td><td>Bromofenolo sale di sodio blu</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-400</td><td>Cloroformio</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>Additivo eluent per LC-MS</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa Fusion Lumos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>per l'analisi di miscele proteiche standard</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>356352-1L-M</td><td>Per la biologia molecolare, > 99%</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4641</td><td>Grado HPLC</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td>Grado HPLC</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-400-102</td><td>Fino a 21.000 XG</td></tr><tr><td>Tubo microcentrifuga (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>Fondo rastremato</td></tr><tr><td>Tubo microcentrifuga &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td>Parte inferiore arrotondata</td></tr><tr><td>Punte per micropipette &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (0.1-10 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-197-28</td><td>Punta universale per pipetta, non sterile</td></tr><tr><td>Punte per micropipette &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (1-200 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-302</td><td>Punta universale per pipetta, non sterile</td></tr><tr><td>Punte per micropipette &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (200-1000 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-303</td><td>Punta universale per pipetta, non sterile</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-710-903</td><td>Pacchetto Trio a micropipette</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0525000</td><td>Polvere liofilizzata, &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; >3200 unità/mg</td></tr><tr><td>ProTrap XG</td><td>Proteoform Scientific</td><td>PXG-0002</td><td>50 unità complete per scatola</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td>Reagente ACS, >99 %</td></tr><tr><td>Dodecile solfato di sodio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28312</td><td>Solido in polvere</td></tr><tr><td>TimsTOF Pro Mass Spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td>per l'analisi dell'estratto di proteoma epatico</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L06374. AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Grado in biologia molecolare</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-7</td><td>Dal pancreas bovino, trattato con TPCK</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Bio-Rad</td><td>1610731</td><td>solido</td></tr><tr><td>Acqua (deionizzata)</td><td>Sistema di Purificazione Mini dell'Acqua Sartorius Arium</td><td>76307-662</td><td>Tipo 1 ultrapuro (18,2 M&Omega; cm)</td></tr><tr><td>Solfato di zinco</td><td>Millipore Sigma</td><td>307491-100G</td><td>solido</td></tr></tbody></table>

precipitazione di proteine organiche a base di solventi per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Mentre i molteplici progressi negli strumenti di spettrometria di massa (MS) hanno migliorato l'analisi qualitativa e quantitativa del proteoma, approcci front-end più affidabili per isolare, arricchire e processare le proteine prima della SM sono fondamentali per una caratterizzazione del proteoma di successo. Il recupero proteico basso e incoerente e le impurità residue come i tensioattivi sono dannosi per l'analisi della SM. La precipitazione delle proteine è spesso considerata inaffidabile, dispendiosa in termini di tempo e tecnicamente impegnativa da eseguire rispetto ad altre strategie di preparazione del campione. Queste preoccupazioni vengono superate utilizzando protocolli ottimali di precipitazione delle proteine. Per la precipitazione dell'acetone, la combinazione di sali specifici, controllo della temperatura, composizione del solvente e tempo di precipitazione è fondamentale, mentre l'efficienza della precipitazione del cloroformio / metanolo / acqua dipende dal corretto pipettaggio e manipolazione del flaconcino. In alternativa, questi protocolli di precipitazione sono semplificati e semi-automatizzati all'interno di una cartuccia di spin usa e getta. I risultati attesi della precipitazione proteica a base di solvente nel formato convenzionale e utilizzando una cartuccia di filtrazione ed estrazione monouso a due stadi sono illustrati in questo lavoro. Ciò include la caratterizzazione dettagliata delle miscele proteomiche mediante analisi LC-MS/MS bottom-up. Le prestazioni superiori dei flussi di lavoro basati su SDS sono dimostrate anche rispetto alle proteine non contaminate.

La Figura 4 riassume l'esaurimento SDS previsto a seguito della precipitazione di proteine basate su flaconcino o facilitata dalla cartuccia in una cartuccia filtrante monouso che utilizza acetone. L'incubazione notturna convenzionale (-20 °C) nell'acetone viene confrontata con il protocollo di precipitazione rapida dell'acetone a temperatura ambiente (fase 2), così come la precipitazione CMW (fase 4). La SDS residua è stata quantificata dal saggio dei principi attivi blu di metilene (MBAS)<...

Il presente protocollo descrive la precipitazione proteica a base solvente in condizioni controllate per il recupero e la purificazione robusti e rapidi dei campioni di proteoma prima della spettrometria di massa.

Precipitazione di proteine organiche a base di solventi per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Questi protocolli sono progettati per massimizzare il recupero e la purezza delle proteine attraverso la precipitazione a base di solventi. Ti mostreremo un paio di trucchi per eseguire la precipitazione in fiale, oltre a un approccio semi-automatico in un formato di cartuccia di rotazione. Abbiamo anche ottimizzato il protocollo di precipitazione per essere coerente e veloce.L'intero protocollo richiede solo pochi minuti. Questi protocolli dimostrano che la precipitazione con solvente delle proteine è ideale per la preparazione dei campioni prima della spettrometria di massa. I protocolli si adatteranno perfettamente ai flussi di lavoro professionali bottom-up e top down.A dimostrarci oggi saranno Ziheng Dang e Victoria Miller, scienziato senior presso Proteoform Scientific ad Halifax, Nuova Scozia Pipettare 90 microlitri di soluzione proteica priva di particolato in una provetta da microcentrifuga in polipropilene. Quindi aggiungere 10 microlitri di una mole di cloruro di sodio acquoso e 400 microlitri di acetone nella soluzione del campione, tappare e picchiettare delicatamente la fiala per combinare i solventi. Lasciare che il flaconcino lo incubi.A temperatura ambiente indisturbata per almeno due minuti dopo l'incubazione, centrifugare i campioni notando l'orientamento del flaconcino e centrifugare per un minimo di due minuti a 10.000 RCF o superiore a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, si osserva un pellet bianco visibile sul fondo del tubo. A questo punto, aprire il tubo e decantare il supernato in un contenitore per rifiuti invertendo il tubo.Utilizzare un tovagliolo di carta per estrarre qualsiasi residuo di solvente dal flaconcino. Per SDS contenenti campioni. Erogare con cura 400 microlitri di acetone fresco senza disturbare il pellet.Centrare immediatamente il campione per un minuto a 10.000 volte G o superiore a temperatura ambiente posizionando il flaconcino nel rotore con lo stesso orientamento della rotazione iniziale. Contate il solvente di lavaggio come descritto in precedenza. Asciugare il campione con il tappo aperto per circa un minuto.In una cappa aspirante, prima di una solubilizzazione del pellet. Erogare 100 microlitri della soluzione proteica in una fiala di polipropilene. Nella cappa aspirante, aggiungere 400 microlitri di metanolo seguiti da 100 microlitri di cloroformio.Chiudere brevemente il flaconcino e il vortice per mescolare. Erogare rapidamente 300 microlitri di acqua direttamente al centro della fiala. Tappare il flaconcino e lasciarlo riposare indisturbato sul piano del banco per un minuto, dopo aver posto il flaconcino di polipropilene in una centrifuga e ruotarlo per cinque minuti a 10.000 volte G o superiore a temperatura ambiente.Si osserva che il flaconcino ha due strati di solvente e un pellet bianco visibile fino al flaconcino a circa 45 gradi. Rimuovere circa 700 microlitri di solvente dallo strato superiore ad una velocità uniforme utilizzando inizialmente una punta di micropipetta da un millilitro e successivamente con una punta di pipetta da 200 microlitri fino a formare una perlina nel flaconcino. Aggiungere 400 microlitri di metanolo fresco al flaconcino del campione senza disturbare il pellet erogando il solvente lungo il lato del flaconcino.Tappare il flaconcino e unire gli strati di solvente dondolando delicatamente il flaconcino per far roteare i solventi insieme. Osservare il pellet di proteine bianche notando l'orientamento della fiala nella centrifuga a rotore per un minimo di 10 minuti a 10.000 volte G o superiore a temperatura ambiente. Inclinare il flaconcino con il pellet rivolto verso il basso.Posizionare una punta di pipetta lungo il bordo superiore del flaconcino e rimuovere il surnatante con una punta di micropipetta da un millilitro a una velocità lenta ma uniforme. Trattenendo circa 20 microlitri di solvente. Lasciare asciugare il solvente residuo nella cappa aspirante.Per precipitare la proteina. Utilizzando una cartuccia filtrante usa e getta, collegare la spina alla cartuccia filtrante superiore. Unire 90 microlitri di soluzione proteica 10 microlitri di una talpa aquas, cloruro di sodio e 400 microlitri di acetone.Incubare per un minimo di due minuti sul piano del banco, centrifugare il campione proteico preparato con il tappo ancora collegato alla cartuccia di filtrazione per due minuti a 2, 500 volte G.At temperatura ambiente, capovolgere la cartuccia e svitare e rimuovere il tappo dalla base della cartuccia. Introdurre la cartuccia di filtrazione in un flaconcino pulito centrifugare il campione proteico per tre minuti a 500 volte G a temperatura ambiente. Eliminare il flusso attraverso il solvente dal flaconcino inferiore.Lavare il pellet proteico aggiungendo 400 microlitri di acetone alla cartuccia di filtrazione, centrifugare per tre minuti a 500 volte G a temperatura ambiente o fino a quando non rimane alcun solvente nella cartuccia superiore. Seguendo i protocolli di precipitazione proteica precedentemente dimostrati. Risolubilizzare la proteina bagnando la membrana alla base della cartuccia di filtrazione erogando da due a cinque microlitri di propanolo ISO direttamente alla membrana immediatamente prima di procedere al protocollo di risolubilizzazione per la risolubilizzazione del pellet proteico preparare l'80% volume per volume soluzione di acido formico in acqua.Pre-raffreddare questa soluzione acida a meno 20 gradi Celsius e la cartuccia di filtrazione contenente proteine precipitate. Erogare 50 microlitri di acido formico diluito a freddo nel tappo della cartuccia refrigerata e nel vortice per 30 secondi. Riportare la cartuccia filtrante nel congelatore a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti.Ripeti i passaggi precedenti del vortice e dell'incubazione. Aggiungere 450 microlitri di acqua a un volume finale di 500 microlitri. Diluire l'acido formico all'8%Capovolgere la cartuccia svitando e rimuovendo il tappo dalla base della cartuccia e collegare la cartuccia SPE al flaconcino.Far girare la proteina attraverso la cartuccia SPE in una centrifuga a temperatura ambiente per cinque minuti a 800 volte G.Se il solvente rimane nella cartuccia superiore, riportare la cartuccia nella centrifuga e ripetere la centrifuga. Risciacquare aggiungendo 300 microlitri di acetonitrile al 5% con lo 0,1% di TFA in acqua alla cartuccia SPE, far scorrere attraverso la cartuccia SPE per due minuti a 2000 volte G.Per proteine a basso peso molecolare o peptidi digeriti eluire il campione facendo scorrere 300 microlitri. Un acetonitrile al 50% con lo 0,1% di TFA per cinque minuti a 2.500 volte G.For proteine intatte.Seguire con un'ulteriore fase di elusione utilizzando 300 microlitri di acetonitrile al 75% con acido ascetico trifluoro allo 0,1%. Combinare i due estratti risultanti. La figura confronta la deplezione di SDS dopo fiala o precipitazione di proteine in una cartuccia filtrante monouso.Utilizzando acetone con i protocolli convenzionali rapid e CMW. Tutti gli approcci riducono la SDS per consentire un'analisi ottimale della spettrometria di massa. Questa figura mostra il recupero quantitativo delle proteine seguendo la rapida precipitazione dell'acetone e la precipitazione della CMW attraverso l'analisi della pagina SDS di un lisato cellulare totale di lievito trasformato.Il recupero costante è stato ottenuto con tutti i protocolli di precipitazione. La precipitazione in una cartuccia di filtrazione usa e getta elimina la necessità di pipettare accuratamente SDS contenente surnatante mantenendo le proteine aggregate sopra un filtro a membrana. Quindi nessuna banda visibile è stata rilevata nelle frazioni di surnatante attraverso tre repliche indipendenti.La precipitazione proteica a base di cartuccia dimostra un recupero superiore di un campione di plasma bovino digerito con pepsina rispetto alla precipitazione a base di flaconcino. Differenze più significative nella resa si notano nella cartuccia quando l'impiego di cloruro di sodio mentre l'impiego di solvente di zinco ha portato alla massima resa. Questa figura quantifica l'intensità di picco del peptide da ciascun campione di peptide con un rapporto superiore a uno che riflette una maggiore abbondanza di peptidi per i campioni trattati nelle cartucce filtranti monouso.La figura confronta il numero di peptidi identificati per proteina tra i tre preparati campione replicati. I coefficienti di correlazione da 0,94 a 0,95 in questi grafici dimostrano l'elevata coerenza dell'approccio di preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa bottom-up. Quindi, una volta formato quel pellet, vuoi davvero evitare di disturbarlo.Se lo mantieni come pellet intatto otterrai una resa maggiore. Quindi assicurati di non dimenticare di lavare quel pellet con acetone extra. Questo ci sta assicurando che ci stiamo sbarazzando della SDS mantenendo il nostro campione il più pulito possibile e questo ci dà la migliore analisi di spettrometria di massa.Quindi abbiamo scoperto che rimuovere il solvente in eccesso invertendo il è molto più semplice che cercare di pipettare il campione. In questo modo otterrai rendimenti più costanti. L'esecuzione della precipitazione dell'acetone a temperatura ambiente ha portato a un recupero più coerente e più rapido rispetto alla precipitazione tradizionale nel congelatore.

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Precipitazione di proteine organiche a base di solventi per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal

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