Name: Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Scopri un saggio a fluorescenza del potenziale di membrana per studiare canali ionici endogeni nelle linee cellulari epiteliali Calu-3 e Caco-2. Questo metodo ad alta produttività facilita la ricerca su modulatori per la fibrosi cistica.

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Gli autori desiderano ringraziare Christopher Fladd e SPARC BioCentre presso l'Hospital for Sick Children per il loro aiuto nella conduzione dei saggi del potenziale di membrana che misurano CFTR ed ENaC. Questo lavoro è stato sostenuto dal programma CFIT con finanziamenti forniti da CF Canada e dalla Sick Kids Foundation. Questo lavoro è stato finanziato dal governo del Canada attraverso Genome Canada e l'Ontario Genomics Institute (OGI-148). Questo studio è stato finanziato dal governo dell'Ontario. S.X. è stato supportato dalla Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Scholarship.

1. Placcatura cellulare e differenziamento
<ol><li>Coltura di cellule Calu-3 e Caco-2 in EMEM contenenti il 20% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (penna/streptococco) in un matraccio T-75.</li>
	<li>Una volta che le cellule raggiungono l'80-100% di confluenza, aspirare il mezzo dal pallone T-75.</li>
	<li>Lavare delicatamente le cellule una volta con 10 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di tripsina preriscaldata allo 0,25% / EDTA allo 0,1% al monostrato cellulare e porre il matraccio T-75 a 37 °C per circa 5 minuti per consentire alle cellule di sollevarsi dalla superficie del pallone di coltura e dissociarsi in una sospensione unicellulare.</li>
	<li>Una volta che le cellule sono state sollevate dalla superficie del pallone, neutralizzare la reazione con 8 ml di terreno di coltura (fase 1.1) per un totale di 10 ml di sospensione cellulare. NOTA: Dissociare meccanicamente i grumi cellulari in una sospensione unicellulare con una pipetta sierologica da 10 ml.</li>
	<li>Placcare le celle su una piastra a 96 pozzetti (~140.000-150.000 celle/pozzetto) o una piastra a 384 pozzetti (~45.000-50.000 celle/pozzetto) al 30-40% di confluenza.<ol><li>Per placcare una piastra piena da 96 pozzetti, aggiungere 1,5 ml della sospensione cellulare a 18,5 ml del terreno di coltura in un tubo conico da 50 ml. Dopo la miscelazione, aggiungere 200 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto.</li>
		<li>Per placcare una piastra piena da 384 pozzetti, aggiungere 1 mL della sospensione cellulare a 17 mL del terreno di coltura in un tubo conico da 50 mL. Dopo la miscelazione, aggiungere 50 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto. NOTA: Assicurarsi che non ci siano grumi di cellule e che le singole celle siano distribuite uniformemente su ciascun pozzetto.</li>
	</ol></li>
	<li>Cambiare il mezzo ogni 2 giorni dopo la placcatura. Se le celle non raggiungono confluenza contemporaneamente tra pozzetti diversi, scartare la piastra e ripetere il passaggio 1.5.</li>
	<li>Una volta seminato, attendere che le cellule raggiungano il 100% di confluenza entro 3-5 giorni. Cambiare il mezzo 24 ore prima degli studi funzionali.</li>
</ol>2. Preparazione della soluzione tampone per il saggio funzionale CFTR
<ol><li>Preparare la soluzione tampone priva di sodio e senza cloruri con i reagenti elencati nella Tabella 1.</li>
	<li>Aggiungere i reagenti al grado di coltura tissutale, doppia distillazione H 2 O (ddH2O). Lasciare sciogliere i reagenti (in un contenitore chiuso per evitare l'evaporazione) mescolando per una notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una volta che la soluzione è stabile, misurare il pH. Se il pH della soluzione supera 7,4, aggiungere 1 M soluzione di N-metil-D-glucamina (NMDG) a goccia per regolare il pH a 7,4. NOTA: Non regolare il pH della soluzione con HCl perché la soluzione deve rimanere priva di cloruri.</li>
	<li>Lasciare mescolare la soluzione per altri 30 minuti e misurare l'osmolarità della soluzione.<ol><li>Ridurre l'osmolarità della soluzione tampone ad un intervallo fisiologico di 300 ± 5 mOsm/kg.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrare e conservare la soluzione tampone in flaconi sterili. NOTA: La soluzione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 6 mesi. Se conservato per più di 6 mesi, controllare il pH e l'osmolarità a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
</ol>3. Saggio funzionale CFTR
<ol><li>Sciogliere il colorante potenziale di membrana nella soluzione tampone priva di sodio e cloruri (0,5 mg di colorante/1 mL di soluzione tampone) e riscaldarla a 37 °C. NOTA: Evitare di esporre la polvere colorante potenziale di membrana alla luce.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dai monostrati cellulari Calu-3 o Caco-2 e aggiungere la soluzione contenente colorante a ciascun pozzetto (195 μL per pozzetto per una piastra da 96 pozzetti, 95 μL per pozzetto per una piastra da 384 pozzetti). NOTA: È possibile aggiungere fino a 112 μL per pozzetto di piastre da 384 pozzetti.</li>
	<li>Lasciare che le celle carichino il colorante per 35 minuti a 37 °C e al 5% di CO2.</li>
	<li>Spostare le cellule, caricate con soluzione colorante, sul lettore di piastre a fluorescenza. Effettuare misurazioni di fluorescenza dal fondo della piastra, con eccitazione = 530 ± 5 nm, emissione = 560 ± 5 nm</li>
	<li>Inizia prendendo letture di base continue per 5 minuti a intervalli di 30 s.</li>
	<li>Aggiungere 5 μL di una soluzione a bassa concentrazione di forskolina o DMSO a ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 1 μM di forskolina (1x). Eseguire una lettura di stimolazione per 20 minuti con misurazioni a intervalli di 15 secondi.<ol><li>Per il formato di piastra a 96 pozzetti, preparare la soluzione a bassa concentrazione (40 μM di forskolina (diluizione 1:25)) di forskolin diluendo 2 μL di 1 mM di soluzione madre di forskolina (1.000x) o DMSO in 48 μL di soluzione tampone priva di sodio e cloruro. NOTA: La forskolina a bassa concentrazione di 40 μM è seguita da una seconda diluizione (diluizione 1:40) nella fase successiva per una concentrazione finale di 1 μM di forskolina.</li>
		<li>Per il formato della piastra a 384 pozzetti, preparare la soluzione a bassa concentrazione (20 μM di forskolina (diluizione 1:50)) diluendo 1 μL di 1 mM (1.000x) di soluzione madre di forskolina o DMSO in 49 μL di soluzione tampone priva di sodio e cloruro. NOTA: La forskolina 20 μM a bassa concentrazione è seguita da una seconda diluizione (diluizione 1:20) nella fase successiva per una concentrazione finale di 1 μM di forskolina.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere 5 μL di soluzione a bassa concentrazione di CFTRInh172 per una concentrazione finale di 10 μM CFTRInh172. Effettuare una lettura di inibizione per 15 minuti con misurazioni a intervalli di 30 s.<ol><li>Per il formato della piastra a 96 pozzetti, preparare la soluzione CFTRInh172 a bassa concentrazione (400 μM CFTRInh172 (diluizione 1:25)) diluendo 2 μL di una soluzione madre CFTRInh172 (1.000x) da 10 mM in 48 μL di soluzione tampone priva di sodio e cloruro. NOTA: Il CFTRInh172 a bassa concentrazione da 400 μM è seguito da una seconda diluizione (diluizione 1:40) nella fase successiva per una concentrazione finale di 10 μM CFTRInh172.</li>
		<li>Per il formato della piastra a 384 pozzetti, preparare la soluzione CFTRInh172 a bassa concentrazione (200 μM CFTRInh172 (diluizione 1:50)) diluendo 1 μL di soluzione madre CFTRInh172 (1.000x) da 10 mM in 49 μL di soluzione tampone priva di sodio e cloruro. NOTA: Il CFTRInh172 a bassa concentrazione di 200 μM è seguito da una seconda diluizione (diluizione 1:20) nella fase successiva per una concentrazione finale di 10 μM CFTRInh172.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificare le misure di intensità di fluorescenza di ciascun pozzetto ed esportare i valori come foglio di calcolo in formato colonna contenente singoli pozzetti. Per calcolare le variazioni indotte dalla forskolina, dividere le misurazioni RFU (Relative Fluorescence Units) da ciascun pozzetto della piastra a 96 o 384 pozzetti per l'ultima misurazione dell'intensità di fluorescenza della lettura della linea di base e tracciarle.<ol><li>In alternativa, quantificare la risposta di inibizione mediata da CFTRInh172 per confermare meglio la specificità della funzione CFTR 12, poiché il trattamento acuto con forskolina può provocare la depolarizzazione della membrana attraverso l'attività di altri canali del cloruro, come SLC26A912.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare le risposte di picco come misurazione dell'intensità massima della fluorescenza dal basale durante la stimolazione della forskolina. Utilizzare questa misurazione o area sotto la curva per quantificare la risposta CFTR.</li>
</ol>4. Preparazione della soluzione tampone per saggi funzionali ENaC
<ol><li>Preparare la soluzione tampone ad alto contenuto di sodio priva di cloruri con i reagenti elencati nella Tabella 2.</li>
	<li>Una volta che la soluzione è stabile, misurare il pH. Se il pH della soluzione è inferiore a 7,4, aggiungere 1 N NaOH soluzione a goccia per regolare il pH a 7,4. NOTA: Non regolare il pH della soluzione con HCl perché la soluzione deve rimanere priva di cloruri.</li>
	<li>Ridurre l'osmolarità della soluzione tampone ad un intervallo fisiologico di 300 ± 5 mOsm/kg.</li>
	<li>Filtrare e conservare la soluzione tampone in flaconi sterili a 4 °C per un massimo di 6 mesi. NOTA: Se la conservazione dura più di 6 mesi, controllare il pH e l'osmolarità a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
</ol>5. Saggio funzionale ENaC
<ol><li>Sciogliere il colorante potenziale di membrana nella soluzione tampone ad alto contenuto di sodio priva di cloruri (0,5 mg di colorante/1 mL di soluzione tampone) e riscaldarla a 37 °C. NOTA: Evitare di esporre la polvere colorante potenziale di membrana alla luce.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dai monostrati cellulari Calu-3 o Caco-2 e aggiungere la soluzione contenente colorante a ciascun pozzetto (195 μL per pozzetto per piastre da 96 pozzetti, 95 μL per pozzetto per piastre da 384 pozzetti). NOTA: Evitare di esporre la soluzione colorante alla luce.</li>
	<li>Lasciare caricare il colorante per 35 minuti a 37 °C e al 5% di CO2.</li>
	<li>Spostare le cellule, caricate con soluzione colorante, sul lettore di piastre a fluorescenza. Leggi le misure di fluorescenza dal fondo della piastra, con eccitazione = 530 ± 5 nm, emissione = 560 ± 5 nm.</li>
	<li>Inizia prendendo letture di base continue per 5 minuti a intervalli di 30 s.</li>
	<li>Per inibire la funzione ENaC, aggiungere 5 μL di soluzione a bassa concentrazione amiloride o soluzione a bassa concentrazione DMSO disciolto nella soluzione tampone ad alto contenuto di sodio, senza cloruro per una concentrazione finale di amiloride di 10 μM.<ol><li>Per il formato di piastra a 96 pozzetti, preparare la soluzione di amiloride a bassa concentrazione (400 μM di amiloride (diluizione 1:25)) diluendo 2 μL di soluzione madre di amiloride 10 mM (1.000x) in 48 μL di soluzione tampone ad alto contenuto di sodio priva di cloruri. NOTA: L'amiloride 400 μM a bassa concentrazione è seguito da una seconda diluizione (diluizione 1:40) nella fase successiva per una concentrazione finale di amiloride di 10 μM.</li>
		<li>Per il formato di piastra a 384 pozzetti, preparare la soluzione a bassa concentrazione (200 μM di amiloride (diluizione 1:50)) di amiloride aggiungendo 1 μL di soluzione madre di amiloride 10 mM (1.000x) in 49 μL di soluzione tampone ad alto contenuto di sodio priva di cloruri. NOTA: L'amiloride 200 μM a bassa concentrazione è seguito da una seconda diluizione (diluizione 1:20) nella fase successiva per una concentrazione finale di amiloride di 10 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Effettuare una lettura di inibizione per 60 minuti con misurazioni a intervalli di 45 s.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.7 per l'analisi dei dati.</li>
	<li>Misurare la risposta amiloride come inibizione percentuale dal basale al punto di plateau, circa 15-20 minuti dopo l'aggiunta di amiloride. Utilizzare questa differenza per quantificare la risposta ENaC.</li>
</ol>

<ol><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+profiling+of+CFTR+modulators+in+patient-derived+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Genomic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia.</a> NPJ Genomic Medicine. 2, 12(2017).</li>
<li>Xia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+analysis+of+CFTR+and+other+apically+localized+proteins+in+iPSC-derived+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids.</a> Cells. 10 (12), 3419(2021).</li>
<li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+high-throughput+therapy+testing+on+iPSC-derived+lung+progenitor+cells+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients.</a> Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Kidney+293+Cells%3A+a+vehicle+for+biopharmaceutical+manufacturing%2C+structural+biology%2C+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology.</a> Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).</li>
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<li>Chen, M. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+optimization+of+novel+high-throughput+assays+for+human+epithelial+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).</li>
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<li>Moore, P. J., Tarran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+sodium+channel+%28ENaC%29+as+a+therapeutic+target+for+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).</li>
<li>Stutts, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+as+a+cAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269 (5225), 847-850 (1995).</li>
<li>Merkert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+modulators+of+CFTR+activity+based+on+genetically+engineered+cystic+fibrosis+disease-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).</li>
<li>Bertrand, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CFTR+trafficking+mutation+F508del+inhibits+the+constitutive+activity+of+SLC26A9%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).</li>
<li>Frelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride+and+its+analogs+as+tools+to+inhibit+Na%2B+transport+via+the+Na%2B+channel+the+Na%2B%2FH%2B+antiport+and+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger.</a> Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).</li>
<li>Di Paola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A14+is+a+genetic+modifier+of+cystic+fibrosis+that+regulates+Pseudomonas+aeruginosa+attachment+to+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells.</a> mBio. 8 (6), 02073(2017).</li>
<li>Schiavi, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+and+growth+abnormalities+are+associated+with+high-level+expression+of+CFTR+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells.</a> American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+ciliated+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 6504(2021).</li>
<li>Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PY+motif+of+ENaC%2C+mutated+in+Liddle+syndrome%2C+regulates+channel+internalization%2C+sorting+and+mobilization+from+subapical+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool.</a> Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Qui, abbiamo descritto metodi basati sulla fluorescenza per misurare l'attività CFTR ed ENaC nella linea cellulare di cancro colorettale epiteliale, Caco-2, e nella linea cellulare di cancro del polmone epiteliale umano, Calu-3. Questi saggi del potenziale di membrana in linee cellulari epiteliali possono essere utilizzati per confermare l'efficacia di composti modulatori di piccole molecole, precedentemente identificati in sistemi di espressione eterologa, prima della convalida finale in vitro in colture epiteliali primarie derivate dal paziente. 
È imperativo confermare che le misurazioni di cui sopra siano adeguatamente attribuite al canale di interesse. Ad esempio, la misurazione attribuita al CFTR dovrebbe mostrare dipendenza dall'espressione della proteina CFTR e dalla forza elettrochimica trainante del cloruro, che è modulata dalla forskolina e dall'inibitore CFTRInh-172. Allo stesso modo, i cambiamenti potenziali di membrana causati dall'amiloride da 10 μM possono essere attribuiti a ENaC, se dipendono dall'espressione proteica di ENaC e da una forza motrice di sodio verso l'interno. Sebbene abbiamo confermato queste proprietà di ENaC nelle cellule MDCK dopo trasfezione con tutte e tre le subunità di ENaC 2, non abbiamo ancora confermato formalmente che la risposta amiloride misurata nelle celluleCaco-2 e Calu-3 sia conferita da ENaC. Ciò è particolarmente importante, in quanto l'amiloride può modulare la funzione dello scambiatore sodio-protone NHE3 oltre a ENaC13. Plausibilmente, l'iperpolarizzazione indotta dall'amiloride osservata in questo test potrebbe parzialmente riflettere gli effetti indiretti dell'acidificazione intracellulare su altri canali. Per confermare che l'iperpolarizzazione indotta da amiloride misurata utilizzando questo colorante sensibile al potenziale di membrana è conferita da ENaC nelle suddette linee cellulari e nei sistemi cellulari più complessi, come i tessuti derivati da iPSC, confermiamo che questa attività viene persa eliminando una subunità ENaC obbligata (beta) in queste linee. 
Il successo di questi test richiede attenzione a diversi fattori. In primo luogo, le colture epiteliali devono essere confluenti e ben differenziate. Per la misurazione della funzione CFTR ed ENaC, circa 145.000 celle devono essere placcate per pozzetto in piastre a 96 pozzetti o 45.000 celle per pozzetto in piastre a 384 pozzetti. Una volta che le cellule epiteliali raggiungono la confluenza (entro 3-4 giorni dalla placcatura), lasciare 2-5 giorni di differenziazione. Questa tempistica è stata determinata in precedenza sulla base della massima espressione proteica CFTR mediante immunoblotting14. Allo stesso modo, è stata determinata la tempistica ottimale per l'espressione funzionale di ENaC in entrambe le linee cellulari, Calu-3 e Caco-2. 
Monostrati non confluenti o crescita eccessiva delle cellule portano a una bassa riproducibilità tra le repliche tecniche. Nei casi in cui le cellule nei singoli pozzetti non raggiungano la confluenza allo stesso tempo, queste piastre devono essere scartate. Inoltre, letture basali instabili o mancanza di risposte di stimolazione possono essere un'indicazione di scarsa qualità cellulare, che deve essere esclusa dall'analisi. Risposte ridotte all'attivatore CFTR, forskolin, o all'inibitore ENaC, amiloride, potrebbero potenzialmente riflettere l'uso di cellule eccessivamente passate15. Sebbene non sia un problema per le cellule Calu-3 e Caco-2, altre cellule o tessuti potrebbero non aderire bene alle piastre e potrebbero richiedere il prerivestimento dei pozzetti. Ad esempio, in studi precedenti, le colture di colangiociti 2D sono state attaccate alle piastre utilizzando il rivestimento di collagene16. In alternativa, l'aderenza dei tessuti intestinali 2D è stata aumentata utilizzando Poly-L-Lisina2. 
Inoltre, nel testare la modulazione dei canali ionici da parte di piccole molecole utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza, è fondamentale che vengano affrontati i potenziali artefatti conferiti dalle proprietà fluorescenti delle piccole molecole. Per confermare la specificità delle risposte funzionali, i saggi del potenziale di membrana possono essere ulteriormente convalidati utilizzando metodi elettrofisiologici convenzionali, come gli studi di Ussing17. 
Dopo aver confermato che la risposta rilevata dai coloranti sensibili al potenziale di membrana è specificamente conferita dal canale di interesse, questi test hanno un enorme potenziale per convalidare modulatori promettenti dei canali ionici epiteliali nel loro contesto cellulare pertinente. Questa piattaforma può colmare il divario tra gli schermi modulatori ad alto rendimento nei sistemi di espressione eterologa e le misurazioni bioelettriche che richiedono molto tempo nei tessuti primari di difficile accesso.

I saggi basati sulla fluorescenza e ad alta produttività delle proteine dei canali ricombinanti sono stati altamente efficaci nell'identificare modulatori di piccole molecole che hanno il potenziale per diventare terapie future 1,2,3,4. Un metodo comune per lo screening delle librerie di piccole molecole per i modulatori dei canali ionici è attraverso la misurazione dei cambiamenti nel potenziale di membrana. Tipicamente, questi schermi sono condotti utilizzando canali ricombinanti espressi eterologamente in linee cellulari come le cellule HEK-293 5,6,7.
Tuttavia, vi è la necessità di convalidare i "colpi" nei tipi di cellule rilevanti. Proponiamo che sia auspicabile uno screening secondario in linee cellulari rilevanti che esprimono endogenamente i canali di interesse. Tale screening secondario identificherà quei modulatori che hanno maggiori probabilità di essere efficaci nei test di convalida finale che si basano su tessuti umani primari meno accessibili.
C'è anche la necessità di sistemi di analisi che abbiano la flessibilità di segnalare l'attività di più bersagli di canali ionici nello stesso tipo di tessuto. Ad esempio, esiste una letteratura pubblicata sostanziale che supporta il concetto che CFTR e ENaC interagiscono funzionalmente 8,9,10. Sebbene diverse linee cellulari epiteliali ben studiate siano note per esprimere sia CFTR che ENaC, ad oggi, le condizioni di analisi per studiare entrambe in modo ad alto rendimento non sono state descritte.
Questo saggio del potenziale di membrana basato sulla fluorescenza è versatile, in quanto impiega una sonda chimica esogena per misurare la funzione di CFTR e ENaC, bypassando la necessità di sonde geneticamente codificate11. Come prova di principio, due linee cellulari epiteliali comunemente usate sono studiate come esempi per evidenziare i passaggi critici necessari per misurare l'attività del canale sia di CFTR che di ENaC.

<table><tbody><tr><td>Amiloride</td><td>Spectrum Chemical</td><td>TCI-A2599-5G</td><td>disciolto in DMSO e conservato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>CFTRInh-172</td><td>CF Foundation Therapeutics</td><td></td><td>Disciolto in DMSO e conservato a -20 gradi C</td></tr><tr><td>EMEM, 1xs</td><td>Wisent</td><td>320-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr>FLIPR Dispositivi <td>molecolari</td> per<td>colorante con potenziale di membrana</td><td>R8042</td><td>Conservato a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3917</td><td>Disciolto in DMSO e conservato a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Acido gluconico lattone o acido (D-(+)-gluconico &delta;-lattone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4750</td><td>Conservato a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP001.5</td><td>Conservato a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Linea cellulare di adenocarcinoma bronchiale umano (Calu-3)</td><td>ATCC</td><td>HTB-55</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare di adenocarcinoma colorettale epiteliale umano (Caco-2)</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td></td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>Conservato a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Wisent</td><td>450-200-EL</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td>Conservato a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Gluconato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9005</td><td>Conservato a temperatura ambiente</td></tr></tbody></table>

un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines

Gli studi basati sulla fluorescenza sono adatti per saggi di lettori di piastre ad alta produttività di cellule in coltura. Sono stati comunemente impiegati per campagne di scoperta di farmaci mirate alle proteine dei canali ionici ricombinanti sovraespresse in cellule come le cellule HEK-293. Tuttavia, vi è una crescente enfasi sull'uso di linee cellulari rilevanti per i tessuti per studiare gli effetti degli interventi di piccole molecole. Il seguente protocollo descrive l'adattamento di un saggio di potenziale di membrana basato sulla fluorescenza per lo studio dei canali ionici espressi endogenamente in linee cellulari epiteliali. Il test del potenziale di membrana descrive in dettaglio un test ad alto rendimento per l'attività dei canali del cloruro del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) in due linee cellulari epiteliali comunemente studiate, Caco-2 e Calu-3. Inoltre, questo articolo descrive una nuova applicazione di questo sistema per misurare l'attività del canale epiteliale del sodio (ENaC) in un formato ad alto rendimento nelle stesse linee cellulari epiteliali. Insieme, questi saggi basati sulla fluorescenza forniscono una piattaforma robusta e flessibile per lo studio di modulatori di piccole molecole, mirati a due canali epiteliali in un contesto cellulare rilevante.

Per misurare l'attività del canale CFTR, le cellule ben differenziate e aderenti vengono incubate in una soluzione extracellulare a zero cloruri contenente il colorante sensibile al potenziale di membrana. La funzione CFTR è costantemente rilevata come depolarizzazione della membrana dopo stimolazione della forskolina. L'efflusso di cloruri viene rilevato come un forte aumento della fluorescenza rispetto al controllo del veicolo. Il segnale di fluorescenza è mantenuto fino all'aggiunta dell'inibitore CFTR (CFTRInh172), portando ad un rapido declino dell'intensità della fluorescenza, come visto nelle cellule Caco-2 (Figura 1A), ed è riproducibile sia nelle cellule Caco-2 che Calu-3 (Figura 1B). La valutazione dell'attività CFTR come differenza nella variazione massima della fluorescenza dopo forskolina o DMSO (veicolo). I singoli punti variavano tra ± 3 deviazioni standard dalla stimolazione media della forskolina (punti neri) o dal controllo DMSO (punti grigi), che corrispondevano a un fattore Z' di 0,586. Questo eccellente punteggio ha indicato la riproducibilità di questo test (Figura 1C). Nel caso in cui vi sia una deriva minore nella linea di base, l'impatto della deriva può essere minimizzato estrapolando la linea di base in tutta la traccia dopo l'attivazione fino al punto di aggiunta dell'inibitore. La risposta può essere quantificata come l'area sotto la curva, con il limite inferiore definito dalla linea estrapolata.
L'attività di ENaC può anche essere misurata nelle vie aeree confluenti e nelle cellule epiteliali del colon coltivate in piastre a 96 pozzetti. In contrasto con il test per l'attività del canale CFTR, queste cellule sono immerse in una soluzione ad alto contenuto di sodio, consentendo l'assorbimento del sodio attraverso ENaC. Con l'aggiunta acuta di amiloride, l'assorbimento di sodio viene bloccato e le cellule sperimentano una relativa iperpolarizzazione della membrana. Ciò è mostrato nelle cellule Caco-2 sia a basse (10 μM) (Figura 2A) che ad alte concentrazioni (50 μM) di amiloride (Figura 2A,B) e nelle cellule Calu-3 con un'alta concentrazione di amiloride (50 μM) (Figura 2B). Il test ENaC è stato esteso a un formato di piastra a 384 pozzetti e ha dimostrato una grande riproducibilità nell'inibizione di ENaC. Allo stesso modo, i singoli punti variavano tra ± 3 deviazioni standard dall'inibizione media dell'amiloride (punti neri) o dal controllo DMSO (punti grigi). La risposta ENaC nelle cellule Calu-3 ha riportato un fattore Z' di 0,629 con trattamento acuto con amiloride (50 μM) (Figura 2C), che indica che questi parametri supportano lo screening ad alto rendimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63528/63528fig01.jpg"> Figura 1: Misurazione del canale CFTR come cambiamenti nella depolarizzazione della membrana nelle cellule Caco-2 e Calu-3. (A) Traccia rappresentativa della stimolazione CFTR con forskolina (1 μM) e controllo DMSO nelle cellule Caco-2. (B) Grafico a scatola e baffi della stimolazione della forskolina nelle cellule Caco-2 e Calu-3 (**** P &lt; 0,0001, n &gt; 3 repliche biologiche, n &gt; 3 repliche tecniche). Le repliche biologiche sono passaggi indipendenti della linea cellulare; Le repliche tecniche si riferiscono a pozzetti indipendenti delle piastre multipozzetto. Box plot raffigura il valore mediano; i limiti rappresentano IQR, con i baffi che definiscono i valori minimi e massimi. (C) Grafico Bland-Altman della risposta CFTR riproducibile con stimolazione della forskolina rispetto al controllo DMSO nelle cellule Caco-2. I punti neri rappresentano i massimi cambiamenti assoluti nella fluorescenza in risposta alla stimolazione della forskolina. I punti grigi rappresentano i cambiamenti nella fluorescenza in risposta al controllo DMSO. Abbreviazioni: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; DMSO = dimetilsolfossido; IQR = intervallo interquartile; Fsk = forskolina; ΔF/F0 = variazione della fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63528/63528fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63528/63528fig02.jpg"> Figura 2: Misure di inibizione di ENaC attraverso iperpolarizzazione di membrana in cellule Caco-2 e Calu-3. (A) Traccia rappresentativa dell'inibizione di ENaC con amiloride (10 μM) relativa al controllo DMSO nelle cellule Caco-2. (B) Grafico a scatola e baffi dell'inibizione dell'amiloride nelle cellule Caco-2 e Calu-3 (**** P &lt; 0,0001, n &gt; 3 repliche biologiche, n &gt; 3 repliche tecniche). (C) Grafico di Bland-Altman della risposta riproducibile ENaC con inibizione dell'amiloride rispetto al controllo DMSO nelle cellule Calu-3. I punti neri rappresentano le massime variazioni assolute della fluorescenza in risposta all'inibizione dell'amiloride. I punti grigi rappresentano i cambiamenti nella fluorescenza in risposta al controllo DMSO. Abbreviazioni: ENaC = canale epiteliale del sodio; DMSO = dimetilsolfossido; Amil. = amiloride; ΔF/F0 = variazione della fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63528/63528fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome</td>
			<td>Concentrazione</td>
		</tr><tr><td>NMDG (N-metil-D-glucamina)</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>Lattone dell'acido gluconico</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>Gluconato di potassio</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Reagenti e loro corrispondenti concentrazioni per il saggio funzionale CFTR con zero sodio e cloruro. Abbreviazione: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome</td>
			<td>Concentrazione</td>
		</tr><tr><td>Gluconato di sodio</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>Gluconato di potassio</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Reagenti e loro corrispondenti concentrazioni per tampone funzionale ENaC con alto contenuto di sodio, zero cloruro. Abbreviazione: ENaC = Canale epiteliale del sodio (Na).

Questo protocollo descrive un metodo per lo studio delle proteine di membrana elettrogeniche misurando le variazioni del potenziale di membrana. Questo test fornisce una piattaforma per la lettura funzionale di più canali ionici espressi endogenamente in linee cellulari epiteliali.

Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery ...

I saggi del potenziale di membrana basati sulla fluorescenza forniscono metodi robusti per studiare gli effetti dei modulatori sui canali ionici espressi endogenamente nelle cellule epiteliali. Come prova del concetto, stiamo misurando la funzione di due canali ionici in linee cellulari epiteliali ben note. Questo test è versatile, poiché utilizza una sonda chimica esogena per misurare la funzione dei canali ionici, evitando così la necessità di sonde codificate geneticamente.Questi saggi ad alto rendimento possono identificare e caratterizzare gli effetti dei modulatori di piccole molecole sui canali ionici, che hanno il potenziale per far progredire le terapie per la fibrosi cistica. Per iniziare, coltura di cellule Calu-3 e Caco-2 in un matraccio T75 contenente EMEM con siero bovino fetale al 20% e streptomicina alla penicillina all'1%. Aspirare il mezzo dal matraccio T75 dopo che le celle raggiungono l'80-100% di confluenza.Lavare delicatamente le cellule con 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Quindi, aggiungere 2 millilitri di tripsina preriscaldata allo 0,25%, con EDTA allo 0,1%, al monostrato cellulare. Porre il matraccio a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti.In questa fase, assicurarsi che le cellule si sollevino dalla superficie del pallone e si dissocino nella sospensione a cellula singola. Aggiungere 8 millilitri di terreno di coltura per neutralizzare la reazione. Quando le cellule raggiungono il 30-40% di confluenza, aggiungere 1,5 millilitri della sospensione cellulare a 18,5 millilitri di terreno di coltura in un tubo conico e mescolare.Aggiungere 200 microlitri di questa sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per ottenere circa 140.000 celle per pozzetto. Per placcare una piastra completa da 384 pozzetti, aggiungere 1 millilitro della sospensione cellulare a 17 millilitri del terreno di coltura in un tubo conico per ottenere circa 50.000 cellule per pozzetto. Dopo la miscelazione, aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto.Cambiare il terreno ogni due giorni e assicurarsi che le cellule raggiungano il 100% di confluenza entro tre-cinque giorni in tutti i pozzetti contemporaneamente. Cambiare il mezzo 24 ore prima degli studi funzionali. In primo luogo, preparare la soluzione tampone priva di sodio e cloruri con i reagenti elencati nel protocollo di testo.Aggiungere i reagenti all'acqua bidistillata di grado di coltura tissutale. Lasciare sciogliere i reagenti mescolando per una notte a temperatura ambiente. Dopo che la soluzione è stabile, regolare il pH a 7,4 aggiungendo 1 soluzione molare NMDG goccia a goccia.Mescolare per 30 minuti e regolare l'osmolarità della soluzione in un intervallo di 300 più o meno 5 millimoli per chilogrammo. Filtrare e conservare la soluzione tampone in flaconi sterili. Quindi, sciogliere 0,5 milligrammi del colorante potenziale di membrana in 1 millilitro di tampone privo di sodio e cloruro e riscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius.Rimuovere il terreno di coltura dai monostrati cellulari Calu-3 e Caco-2. Aggiungere 195 microlitri della soluzione colorante per pozzetto per la piastra a 96 pozzetti e 95 microlitri per pozzetto per una piastra da 384 pozzetti. Lasciare che le cellule carichino il colorante per 35 minuti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Quindi, prendere misure di fluorescenza con eccitazione a 530 nanometri ed emissione a 560 nanometri. Inizialmente, eseguire letture di base continue per cinque minuti a intervalli di 30 secondi. Quindi, aggiungere 5 microlitri di soluzione di Forskolin 400 micromolari a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti, per ottenere una concentrazione finale di Forskolin di un micromolare.Per la piastra a 384 pozzetti, aggiungere cinque microlitri di soluzione di Forskolin da 20 micromolari. Prendi una valutazione di stimolazione per 20 minuti con misurazioni a intervalli di 15 secondi. Quindi, aggiungere 5 microlitri di una soluzione da 400 micromolari di inibitore CFTR alla piastra a 96 pozzetti, per ottenere una concentrazione finale di 10 micromolari.Alla piastra a 384 pozzetti, aggiungere 5 microlitri di inibitore CFTR micromolare 200. Eseguire una lettura di inibizione per 15 minuti con misurazioni a intervalli di 30 secondi. Quantifica le misure di intensità di fluorescenza di ciascun pozzetto ed esporta i valori come foglio di calcolo.in formato colonna, contenente singoli pozzi. Per calcolare i cambiamenti indotti da Forskolin, dividere le misure relative dell'unità di fluorescenza da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti per l'ultima misurazione dell'intensità di fluorescenza della lettura della linea di base e tracciarle. Misurare le risposte di picco come intensità massima di fluorescenza misurata dal basale durante la stimolazione di Forskolin.Utilizzare questa misurazione, o area sotto la curva, per quantificare la risposta CFTR. La funzione CFTR è stata rilevata come depolarizzazione della membrana dopo stimolazione di Forskolin nelle cellule Caco-2. L'efflusso di fluoro è stato rilevato come un forte aumento della fluorescenza rispetto al DMSO come controllo del veicolo.Dopo la stimolazione della forskolina, il segnale fluorescente è stato mantenuto fino all'aggiunta dell'inibitore CFTR, dopo di che c'è stato un rapido declino dell'intensità della fluorescenza. Questo fenomeno era riproducibile sia nelle cellule Caco-2 che in quelle Calu-3. L'attività CFTR è stata calcolata come la differenza nella variazione massima della fluorescenza dopo stimolazione con Forskolin o DMSO.I singoli punti variavano tra più o meno 3 deviazioni standard dalla media nel caso della stimolazione di Forskolin e del controllo DMSO, indicando la riproducibilità del test. Per confermare la specificità delle risposte funzionali, questi saggi del potenziale di membrana possono essere ulteriormente convalidati utilizzando metodi elettrofisiologici convenzionali, come la camera di Ussing. Questa piattaforma è in grado di colmare il divario tra schermi modulatori ad alto rendimento e sistemi di espressione eterologhi e misurazioni bioelettriche dispendiose in termini di tempo in tessuti primari di difficile accesso.

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Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali (Video) | JoVE Journal

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