Name: Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Scopri l'inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi della riboflavina-5′-fosfato con luce violetta visibile. Questo metodo sicuro e semplice utilizza fibre ottiche per applicazioni terapeutiche e sanificazione alimentare.

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Gli autori sono grati al Dr. Tak-Wah Wong e al Sig. Zong-Jhe Hsieh per il loro sostegno agli esperimenti.

1. Configurazione del sistema di fotolisi
<ol><li>Montare sei diodi emettitori di luce (LED) (DC 12 V) all'interno di un bicchiere di plastica opaca (8 cm x 7 cm) come mostrato nella Figura 1 per stabilire un sistema di fotolisi31.</li>
	<li>Aggiungere i reagenti (vedi sotto) nelle provette di vetro (13 mm di diametro e 100 mm di altezza) e fissare le provette nella parte superiore della tazza come mostrato nella figura 1. Posizionare la configurazione sperimentale in una stanza con una temperatura costante di 25 ± 3 °C.</li>
	<li>Monitorare e registrare la temperatura delle unità di prova durante le reazioni fotolitiche mediante un termometro a infrarossi. NOTA: La Figura 2 mostra gli spettri di emissione per le luci blu, verdi, rosse e viola, registrate utilizzando uno spettrometro ottico UV-Vis calibrato. Le lunghezze d'onda corrispondenti al massimo di assorbanza per le luci LED blu, verdi, rosse e viola utilizzate nello studio sono rispettivamente 465, 529, 632 e 405 nm. I chip LED possono riscaldare l'apparecchio durante gli esperimenti di irradiazione. L'intero sistema di fotoreazione in ogni esperimento è stato quindi collocato in una stanza dove la temperatura è stata mantenuta costante a 25 ± 3 °C.</li>
</ol>2. L'effetto della lunghezza d'onda della luce sulla fotolisi della FMN (Figura 3)
<ol><li>Preparare una soluzione di 0,1 mM FMN in tampone fosfato di potassio (PB) da 100 mM (pH 7,8). Esporre campioni FMN (3 ml ciascuno) a luce blu, verde, rossa o viola ad un'intensità di 10 W/m2 per 5 minuti. Tenere 3 mL di soluzione FMN al buio come controllo.</li>
	<li>Registrare l'assorbanza dei campioni FMN irradiati nell'intervallo 250-750 nm utilizzando uno spettrofotometro UV/visibile.</li>
</ol>3. Metodo di riduzione del tetrazolio blu nitro (NBT) da rilevare <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;"> (Figura 4).
NOTA: Il metodo di riduzione NBT utilizzato qui è stato leggermente modificato dal test per la fotoreazione della riboflavina. Il metodo di riduzione NBT viene utilizzato per valutare il livello generato <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> dalla fotolisi FMN. L'FMN fotochimicamente eccitato viene prima ridotto dalla L-metionina in un semichinone, che poi dona un elettrone all'ossigeno dando origine a <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">31. L'as-generato <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> riduce NBT a formazan, che ha una caratteristica assorbanza a 560 nm32.
<ol><li>Aggiungere 109,3 mg di L-metionina a 73,3 ml di PB (100 mM; pH 7,8). Vortex la soluzione per sciogliere la L-metionina.</li>
	<li>Dopo che la L-metionina è completamente sciolta, aggiungere 10 mg di polvere NBT e 1,53 ml di 0,117 mM FMN alla soluzione. Per ogni 1 mL della soluzione di reazione (cioè una miscela di FMN, L-metionina e NBT) applicata, le concentrazioni finali di FMN, metionina e NBT sono rispettivamente 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M e 1,6 x 10-4 M.</li>
	<li>Esporre la soluzione di reazione (1 ml) all'irradiazione luminosa LED blu o viola a 10 W/m2 per 1-5 minuti.</li>
	<li>Rilevare la <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> specie (dall'assorbanza a 560 nm) prodotta dalla reazione fotochimica, che riduce NBT e produce formazan.</li>
</ol>4. Vitalità di S. aureus dopo fotolisi FMN (Figura 5)
<ol><li>Trasmettere una colonia di S. aureus (BCRC 10451) da una piastra coltivata in 10 ml di brodo lisogenico prelevato in una provetta con tappo a vite da 15 ml. Coltura in agitatore a 37 °C per 16 h.</li>
	<li>Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere acqua sterilizzata nel tubo della centrifuga per diluire la coltura a una densità ottica di 0,5 a 600 nm (OD600) (~6 x 107 CFU/mL).</li>
	<li>Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 ml, centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante per ottenere un pellet cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione tamponata FMN (30, 60 e 120 μM FMN in PB) ai pellet cellulari ottenuti come al punto 4.3 e al vortice. Per il controllo irradiato, aggiungere 1 mL di PB da solo.</li>
	<li>Trasferire 1 mL ciascuna di soluzioni cellulari batteriche vitali contenenti 30 μM FMN e PB da sole in tubi di vetro e irradiarle con luce violetta a 10 W/m2 per 30 minuti.</li>
	<li>Trasferire 1 ml ciascuno di soluzioni cellulari batteriche vitali contenenti 30, 60 e 120 μM FMN e PB da soli in tubi di vetro e irradiarli con luce blu a 20 W / m2 per 120 minuti. Installare un altro tubo di vetro con 1 mL di soluzione di cellule batteriche vitali contenente 120 μM FMN e irradiarlo con luce blu a 20 W / m2 per 60 minuti.</li>
	<li>Installare le provette come descritto nei passaggi 4.5 e 4.6 e coprirle con fogli di alluminio spessi. Questi tubi fungono da controlli oscuri.</li>
	<li>Conservare la camera di irradiazione (così come i controlli di oscurità) in una cella frigorifera a 9 ± 1 °C durante il periodo di irradiazione di 30-120 minuti. NOTA: Il calore rilasciato dalle luci a LED non può essere ignorato in quanto i chip LED posti all'interno della tazza possono riscaldare il sistema di fotoreazione durante gli esperimenti di irradiazione. Gli esperimenti sono stati quindi condotti in una cella frigorifera mantenuta a 9 ± 1 °C.</li>
	<li>Dopo irradiazione, trasferire 0,2 mL da ciascuna delle soluzioni di reazione su una piastra di agar Luria (LA). Distribuire i batteri sulla piastra con una bacchetta di vetro a forma di L e incubare per una notte a 37 °C.</li>
	<li>Calcolare il conteggio delle piastre vitali e i tassi di inattivazione di S. aureus dopo la crescita durante la notte. NOTA: Il tasso di inattivazione di S. aureus è calcolato come riduzione percentuale, che è pari a [1 -I / D] ×100%, dove I e D denotano, rispettivamente, il numero di CFU nel campione irradiato e il controllo di oscurità. La riduzione percentuale è definita come un valore negativo del tasso di inattivazione.</li>
</ol>5. Rilevamento di <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;"> in S. aureus (Figura 6)
<ol><li>Preparare i campioni di S. aureus come descritto al punto 4.</li>
	<li>Diluire la densità batterica dei campioni con acqua sterilizzata ad una densità ottica di 0,5 a 600 nm (OD600, ~6 x 106 CFU/mL). Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante per ottenere un pellet cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 0,1093 g di L-metionina, 0,1 g di NBT e 25 ml di FMN (400, 240 o 120 μM) a 75 ml di PB. Per ogni 1 mL del reagente applicato, le concentrazioni finali di FMN, metionina e NBT sono rispettivamente 100 (60 o 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M e 1,2 x 10-3 M.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di ciascuna soluzione di reagente (cioè con concentrazioni di FMN variabili) ai pellet cellulari ottenuti come al punto 5.2. Irradiare le soluzioni mediante luce violetta a 10 W/m2 per 10 min.</li>
	<li>Centrifugare la miscela a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) per estrarre l'NBT ridotto. Rilevare le specie prodotte <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> dall'assorbanza a 560 nm.</li>
</ol>6. Analisi statistica
<ol><li>Esprimere i dati come media ± deviazione standard (SD) di tre test indipendenti.</li>
	<li>Applicare un t-test omoscedasticostico, a due campioni, per valutare se due misurazioni sono diverse. Valori p &lt; 0,05 sono considerati statisticamente significativi.</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Un fotosensibilizzatore aumenta la reazione fotochimica dei composti chimici per generare ROS. I microrganismi patogeni possono essere inattivati dall'irradiazione luminosa in presenza di fotosensibilizzatori. Questo studio determina l'aPDI di S. aureus a causa di ROS generati dall'irradiazione di luce violetta di un fotosensibilizzatore esogeno, FMN.
Come mostrato nella figura 3, per FMN, l'assorbanza a 444 nm si riduce significativamente dopo 5 minuti d...

La riboflavina-5′-fosfato (FMN) è formata dalla fosforilazione nella posizione della riboflavina 5' della catena laterale del ribitil ed è richiesta da tutte le flavoproteine per numerosi processi cellulari per generare energia. Svolge anche il ruolo di vitamina per alcune funzioni nel corpo umano1. FMN è circa 200 volte più solubile in acqua rispetto alla riboflavina2.
L'inattivazione fotodinamica antibatterica (aPDI) dei batteri è un modo efficace per controllare la resistenza ai batteri 3,4 perché non dipende dalla modalità di resistenza batterica. Clinicamente, aPDI è usato per trattare le infezioni dei tessuti molli al fine di ridurre l'infezione della pelle nosocomiale dovuta a batteri multi-resistenti 5,6,7,8,9. aPDI produce anche morte cellulare generando specie reattive dell'ossigeno (ROS). I ROS, come i radicali superossido (), l'ossigeno singoletto, i radicali ossidrilici (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">•OH) e i radicali perossilici, sono radicali liberi o molecole che contengono ossigeno reattivo 10,11,12 e sono normalmente reattivi 13. Simile al danno al DNA causato dai ROS, la perossidazione della membrana e la distruzione delle cellule endoteliali sono anche reazioni biochimiche avverse che sono attribuite ai ROS nelle cellule12.
L'uso di aPDI per batteri patogeni coinvolge una sorgente di luce visibile o UV per inattivare i microrganismi in presenza di composti chimici, come il cloruro di metiltioninio 14, PEI-ce6 coniugato 15, porfirina 16, biossido di titanio17, blu di toluidina O 18 e nanoparticelle di ossido di zinco 19. Il blu di toluidina O e il blu di metilene sono coloranti fenotiazinici e il blu di metilene ha proprietà tossiche. Le nanoparticelle di ossido di zinco e l'irradiazione UV sono collegate a effetti negativi sulla salute e sull'ambiente. Pertanto, lo sfruttamento di un fotosensibilizzatore affidabile, sicuro e semplice tramite fotolisi sotto irradiazione visibile merita ulteriori studi.
Il micronutriente, riboflavina o FMN, non è tossico ed è infatti utilizzato per la produzione o l'alimentazione alimentare20. Sia l'FMN che la riboflavina sono altamente sensibili all'irradiazione luminosa2. Sotto UV 1,2,21,22,23 e irradiazione di luce blu10,24, questi due composti raggiungono uno stato eccitato. La riboflavina attivata o FMN prodotta dalla fotolisi viene promossa al suo stato di tripletto e i ROS vengono generati simultaneamente 2,25. Kumar et al. hanno riferito che la riboflavina attivata dalla luce UV provoca selettivamente un aumento delle lesioni alla porzione guanina del DNA nei microrganismi patogeni26. Sotto irradiazione mediante luce UV, è stato dimostrato che la riboflavina attivata fotodinamicamente promuove la generazione di 8-OH-dG, che è un biomarcatore per lo stress ossidativo, nel DNA27 a doppio filamento. È stato riportato che S. aureus ed E. coli sono disattivati da ROS durante la riboflavina o la fotolisi FMN10,24,28. Uno studio precedente degli autori ha dimostrato che le reazioni fotolitiche che coinvolgono riboflavina e FMN riducono il viola cristallino, un colorante triarilmetano e un agente antibatterico che genera <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">ed eliminano la maggior parte della capacità antimicrobica del viola cristallino28. Quando la flavina adenina dinucleotide o FMN viene irradiata dalla luce blu, i ROS risultanti producono apoptosi nelle cellule HeLa per il loro avvelenamento in vitro29. Utilizzando il trattamento fotochimico in presenza di riboflavina, Cui et al. inattivano i linfociti inibendo la loro proliferazione e produzione di citochine30.
La fotolisi della riboflavina viene utilizzata per l'inattivazione dell'agente patogeno del sangue da UV 10,24, ma i componenti del sangue possono essere compromessi sotto irradiazione di luce UV30. È stato anche riportato che le piastrine esposte ai raggi UV migliorano progressivamente le prestazioni dei marcatori di attivazione P-selectina e LIMP-CD63 sulle loro membrane. La citotossicità dei raggi UV e dell'irradiazione ad alta intensità deve essere studiata e un fotosensibilizzatore che sia semplice e sicuro durante una fotoreazione FMN che coinvolge la luce visibile sarebbe di grande utilità.
La luce di lunghezze d'onda più corte ha più energia ed è molto più probabile che causi gravi danni alle cellule. Tuttavia, in presenza di un fotosensibilizzatore adatto, l'irradiazione con luce viola a bassa intensità può inibire i microrganismi patogeni. La fotosensibilizzazione e la generazione di FMN quando irradiato con luce violetta è quindi importante da studiare, al fine di <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> determinare la via attraverso la quale i ROS da fotolisi FMN aumentano l'inattivazione dei batteri.
Il controllo antimicrobico è un problema comune e lo sviluppo di nuovi antibiotici richiede spesso decenni. Dopo l'irradiazione con luce viola, la fotoinattivazione intermediata dalla FMN può annientare i batteri patogeni ambientali. Questo studio presenta un efficace protocollo antimicrobico in vitro che utilizza la luce viola per guidare la fotolisi FMN e quindi generare <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> aPDI. La vitalità microbica di S. aureus viene utilizzata per determinare la fattibilità dell'aPDI indotta da FMN.

<table><tbody><tr><td>Luci LED blu, verdi e rosse</td><td>Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan</td><td></td><td>DC 12 V 5050</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>190186</td><td></td></tr><tr><td>Termometro a infrarossi</td><td>Raytek Co. Santa Cruz, CA</td><td>MT4</td><td></td></tr><tr><td>LB brodo</td><td>Difco Co., NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>1.05707</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>China tech Co., New Taipei City, Taiwan</td><td>YP30-3-2</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavina 5&prime;-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R7774</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di energia solare</td><td>Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan</td><td>TM-207</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus subsp. aureus</td><td>Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan</td><td>10451</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro ottico UV-Vis</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>USB4000</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, Giappone</td><td>U-2900</td><td></td></tr><tr><td>LED viola</td><td>Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Cina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavina-5'-fosfato (o flavina mononucleotide; FMN) è sensibile alla luce visibile. Vari composti, comprese le specie reattive dell'ossigeno (ROS), possono essere generati dalla fotolisi FMN dopo irradiazione con luce visibile. I ROS generati dalla fotolisi FMN sono dannosi per i microrganismi, compresi i batteri patogeni come lo Staphylococcus aureus (S. aureus). Questo articolo presenta un protocollo per disattivare S. aureus, ad esempio, attraverso reazioni fotochimiche che coinvolgono FMN sotto irradiazione di luce visibile. L'anione radicale superossido () generato durante la fotolisi FMN viene valutato mediante riduzione del tetrazolio nitro blu (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;">NBT). La vitalità microbica di S. aureus attribuita alle specie reattive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;"> è stata utilizzata per determinare l'efficacia del processo. Il tasso di inattivazione batterica è proporzionale alla concentrazione di FMN. La luce viola è più efficiente nell'inattivare S. aureus rispetto all'irradiazione di luce blu, mentre la luce rossa o verde non guida la fotolisi FMN. Il presente articolo dimostra la fotolisi FMN come metodo semplice e sicuro per i processi sanitari.

Effetto della lunghezza d'onda della luce sulla FMN Gli spettri di assorbanza di 0,1 mM FMN irradiati utilizzando LED blu, verdi, rossi e viola sono mostrati nella Figura 3. Ci sono due picchi per FMN (372 nm e 444 nm) per il controllo scuro. La luce verde e rossa non ha alcun effetto perché i cambiamenti negli spettri sono insignificanti. D'altra parte, la rispettiva assorbanza di FMN a 444 nm è ridotta di circa il 19% e il 34%, rispettivamente, dopo irradiazione di luce...

Qui presentiamo un protocollo per inattivare i batteri patogeni con specie reattive dell'ossigeno prodotte durante la fotolisi del mononucleotide flavina (FMN) sotto irradiazione di luce blu e viola di bassa intensità. La fotolisi FMN ha dimostrato di essere un metodo semplice e sicuro per i processi sanitari.

Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Questo protocollo utilizza l'irradiazione a luce violetta visibile per indurre la fotolisi mononucleotidica della flavina. Questo produce una grande quantità di radicali liberi, che inibiscono i batteri patogeni come Staphylococcus aureus ed E.coli. Abbiamo testato il mononucleotide di flavina come fotosensibilizzante appropriato.In questo protocollo, utilizziamo la luce viola visibile che è sicura e non richiede attrezzature costose. Questo metodo può essere utilizzato per la terapia della pelle lesa o dei tessuti sottocutanei infetti inserendo una fibra ottica per l'illuminazione. Può anche essere applicato alla pratica igienico-sanitaria nell'industria alimentare.A dimostrare la procedura sarà Tang-Yu Chen, uno studente laureato del mio laboratorio Per iniziare, montare sei diodi emettitori di luce di 12 volt ciascuno all'interno di un bicchiere di plastica opaca. Prendi una provetta di vetro con un diametro di 13 millimetri e un'altezza di 100 millimetri e aggiungi i reagenti alla provetta. Fissare i tubi nella parte superiore della tazza e posizionare questa configurazione a una temperatura costante di 25 tre gradi Celsius.Monitorare e registrare la temperatura delle unità di prova durante le reazioni fotolitiche mediante un termometro a infrarossi. Quindi, preparare una soluzione FMN da 0,1 millimolari in tampone fosfato di potassio da 100 millimolari a pH 7,8. Esporre tre millilitri di campioni FMN ciascuno alla luce blu, verde, rossa o viola per cinque minuti.In parallelo, tenere tre millilitri di soluzione FMN al buio come controllo. Inserire il campione in uno spettrofotometro visibile ai raggi UV e registrare l'assorbanza dei campioni irradiati nell'intervallo da 250 a 750 nanometri. Per prepararsi alla rilevazione dei radicali superossido, aggiungere prima 109,3 milligrammi di L-metionina a 73,3 millilitri di tampone fosfato da 100 millimolari a pH 7,8.Nella soluzione, aggiungere 10 milligrammi di polvere NBT e 1,5 millilitri di FMN da 0,117 millimolari. Esporre un millilitro della soluzione di reazione alla luce LED blu o viola per uno a cinque minuti. Registrare l'assorbanza di 516 nanometri per rilevare il formazan, che è prodotto dalla reazione fotochimica di NBT.Inoculare una colonia di Staphylococcus aureus in 10 millilitri di brodo lisogenico in una provetta con tappo a vite da 15 millilitri. Coltiva la cultura a 37 gradi Celsius per 16 ore in uno shaker. Trasferire 0,5 millilitri della coltura in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.Diluire la coltura a una densità ottica di 0,5 a 600 nanometri aggiungendo acqua sterilizzata. Quindi, trasferire 0,5 millilitri della coltura in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare a 14.000 G per 10 minuti e decantare il surnatante.Aggiungere un millilitro di soluzione tamponata FMN al pellet e al vortice della cellula. Per il controllo irradiato, aggiungere un millilitro di tampone fosfato. Trasferire un millilitro di soluzione cellulare batterica contenente 30 micromolari FMN e tampone fosfato in tubi di vetro.Posizionali per una radiazione sotto la luce viola a 10 watt per metro quadrato per 30 minuti. Quindi, trasferire un millilitro di soluzione cellulare batterica contenente 30-60 e 120 micromolari FMN e tampone fosfato in tubi di vetro. Irradiare con luce blu per 120 minuti a 20 watt per metro quadrato.Inoltre, irradiare un tubo contenente un millilitro di FMN 120-micromolare per 60 minuti. Dopo l'irradiazione, aggiungere 0,2 millilitri della soluzione di reazione su una piastra di agar luria. Stendere la soluzione utilizzando una bacchetta di vetro a forma di L e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, calcolare il conteggio delle piastre vitali e il tasso di inattivazione di Staphylococcus aureus. Preparare i campioni di stafilococco aureo come descritto in precedenza per ottenere un pellet cellulare. A 75 millilitri di tampone fosfato aggiungere 0,1093 grammi di L-metionina, 0,1 grammi di NBT e 25 millilitri di soluzione FMN.Aggiungere un millilitro di ciascuna soluzione di reagente con concentrazioni di FMN variabili ai pellet cellulari e al vortice. Irradiare le soluzioni sotto luce viola a 10 watt per metro quadrato per 10 minuti. Centrifugare la miscela a 14.000 G per 10 minuti e decantare il surnatante.Risospendere il pellet in un millilitro di dimetilsolfossido per estrarre l'NBT ridotto. Registrare l'assorbanza a 560 nanometri. L'irradiazione di FMN con luce verde e rossa non ha mostrato alcun effetto sui picchi a 372 e 444 nanometri rispetto al controllo scuro, mentre la riduzione dell'assorbanza di FMN a 444 nanometri è stata osservata sotto luce blu e viola, indicando un aumento della fotolisi.La rilevazione dei radicali superossido formati durante la fotolisi FMN sotto luce blu o viola è stata effettuata utilizzando la riduzione NBT. L'effetto fotochimico della FMN dipendeva dal tempo di irradiazione. La fotolisi FMN mediante irradiazione di luce blu o viola ha determinato una significativa inattivazione dello Staphylococcus aureus.L'inattivazione dose-dipendente è stata osservata per l'irradiazione con luce blu, con un'inattivazione del 97% raggiunta per FMN a 120 micromolari. Sotto luce viola, è stato raggiunto un tasso di inattivazione del 96% per lo stafilococco aureo, con 30 micromolari FMN che hanno mostrato una maggiore efficacia per l'inattivazione batterica. La riduzione dell'NBT ha mostrato che l'effetto fotolitico dell'FMN sotto luce violetta nello Staphylococcus aureus era proporzionale alla concentrazione di FMN.In condizioni non trattate, una minore abbondanza di radicali superossido è stata indicata da una bassa assorbanza a 560 nanometri, mentre valori di assorbanza più elevati nel trattamento FMN hanno mostrato un'abbondante produzione di radicali superossido, con conseguente aumento dell'effetto fotochimico. È fondamentale avere una buona sorgente luminosa a LED. La larghezza spettrale del regime di luce viola deve essere stretta per evitare qualsiasi sovrapposizione con l'assorbimento UV, poiché la radiazione UV può essere pericolosa.Dopo la procedura, altri composti chimici come tetraciclina, doxiciclina, catechina e possono essere testati per la fotolisi simile a FMN.

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Mostriamo che un dispositivo biomedicale sviluppato comporta il trattamento laser basato visibile continua o pulsata che è combinato con il trattamento antibiotico (gentamicina), determina una statisticamente significativo effetto sinergico che porta a una riduzione della...

L&#39;effetto sinergico di luce visibile e Gentamicina su<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Microrganismi

Fonte: Cheng, C., et al. Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra un metodo per valutare gli effetti fototossici della flavina mononucleotide (FMN) sui batteri patogeni. Le colture batteriche sono esposte a concentrazioni crescenti di FMN e illuminate con luce visibile per generare specie reattive dell'ossigeno (ROS) che danneggiano i componenti cellulari. I batteri sopravvissuti vengono quindi...

Inattivazione dei batteri mediante mononucleotide flavina attivato dalla luce

Fonte: Cheng, C., et al. Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022).In questo video, una miscela di reazione tamponata contenente L-metionina, nitro blu tetrazolio (NBT) e flavina mononucleotide (FMN) viene irradiata con luce viola per indurre la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Ciò porta all'inattivazione batterica e alla formazione di formazan spettrometricamente rilevabile.

Quantificazione dell'inattivazione batterica indotta dalla luce attraverso la generazione di specie reattive dell'ossigeno

Fonte: Zhao, K., et al. Un modello in vitro per studiare l'effetto della terapia fotodinamica mediata da acido 5-aminolevulinico sul biofilm di Staphylococcus aureus . J. Vis. Esp. (2018)Il video mostra un protocollo di terapia fotodinamica per valutare gli effetti antibatterici sui biofilm batterici Gram-positivi. I biofilm sono suddivisi in quattro gruppi: due ricevono un precursore del fotosenziatore e due ricevono un buffer. Tutti vengono incubati al buio, seguiti dall'esposizione alla luce...

Trattamento attivato dalla luce dei biofilm batterici utilizzando un precursore fotosensibilizzatore

Questo video dimostra il processo di riduzione dei patogeni basato sulla riboflavina e sulla luce UV contro la contaminazione batterica ad alto titolo nei prodotti piastrinici umani. Questo processo potrebbe aiutare a ridurre il rischio di gravi eventi trasfusionali avversi associati alla contaminazione batterica.

Un trattamento con riboflavina e luce UV dei prodotti piastrinici per eliminare i batteri

Le condizioni di conservazione dei prodotti piastrinici creano un ambiente ideale per la moltiplicazione dei contaminanti batterici a livelli pericolosi.  L'obiettivo di questo studio è stato quello di utilizzare un saggio di formazione di colonie per valutare un processo di riduzione dei patogeni a base di riboflavina contro la contaminazione batterica ad alto titolo nei prodotti piastrinici umani.

Trattamento dei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV: Efficacia Contro alto titolo contaminazione batterica

Le infezioni causate da ceppi batterici multiresistenti (MDR) sono emerse come una seria minaccia per la salute pubblica, rendendo necessario lo sviluppo di terapie alternative. Presentiamo un protocollo per valutare l'efficacia della terapia antimicrobica con luce blu (aBL) per le infezioni da MDR Acinetobacter baumannii nelle ustioni di topo utilizzando l'imaging a bioluminescenza.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy per la multi-resistente baumannii Acinetobacter Masterizzare Infezioni Utilizzando bioluminescenza Imaging

La crescente incidenza di Candida albicans resistente ai farmaci è un grave problema di salute in tutto il mondo. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire una strategia per combattere le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Il presente protocollo descrive l'efficacia dell'aPDT mediata da Rose bengala su un ceppo di C. albicans multiresistente in vitro.

Terapia fotodinamica mediata dal Bengala Rosa per inibire la Candida albicans

Il presente protocollo descrive le modifiche al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) con un sistema di illuminazione della luce, la fabbricazione di cellule liquide e osservazioni TEM in situ delle interazioni indotte dalla luce tra cellule batteriche e un fotosensibilizzatore. Vengono inoltre discussi i metodi di preparazione del campione, il danno al fascio di elettroni e l'imaging.

Microscopia elettronica a trasmissione in situ indotta dalla luce per l'osservazione dell'interazione liquido-materia molle

Questo protocollo descrive un metodo semplice ed economico per valutare l'efficacia di potenziali fotosensibilizzatori nell'inattivazione fotodinamica antibatterica (aPDI), utilizzando un formato di piastra a 96 pozzetti combinato con una sorgente luminosa a pannello LED. Questo approccio consente di testare simultaneamente più condizioni sperimentali, tra cui diverse concentrazioni, composti e ceppi batterici.

Screening in vitro basato su LED per la valutazione di molecole fotoattivabili nell'inattivazione fotodinamica batterica

Un dispositivo LED a luce blu da 405 nm dimostra efficacia antimicrobica contro un'ampia gamma di patogeni della ferita quando valutato su un modello cutaneo sintetico a base di collagene. Questo approccio semplificato in vitro offre un'alternativa riproducibile ed eticamente valida per la valutazione nelle fasi iniziali delle terapie antimicrobiche basate sulla luce.

Indagine di un dispositivo LED a luce blu per sopprimere patogeni delle ferite utilizzando un modello cutaneo sintetico a base di collagene

Scopri l'inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi della riboflavina-5′-fosfato con luce violetta visibile. Questo metodo sicuro e semplice utilizza fibre ottiche per applicazioni terapeutiche e sanificazione alimentare.

Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato

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