Name: Valutazione dellossidazione del substrato energetico in vitro con 14INtrappolamento di CO 2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Impara a misurare l'ossidazione del substrato energetico in vitro tramite il tracciamento del 14CO2. Questo metodo scalabile facilita la ricerca sui disturbi metabolici in diversi tipi cellulari.

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Il lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione NIH R01 AR060456 (FL). Ringraziamo il Dr. Michael Robinson ed Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) per il loro generoso aiuto con il contatore di scintillazione.

L'uso di materiali radioattivi (RAM) richiede l'approvazione preventiva di un comitato di sicurezza designato presso ciascuna istituzione. Le RAM utilizzate in questo protocollo sono state approvate da Environmental Health &amp; Radiation Safety (EHRS) presso l'Università della Pennsylvania. L'uso di animali richiede l'approvazione preventiva da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'istituzione di origine. Il seguente studio è stato approvato dalla IACUC presso il Children's Hospital di Philadelphia.
1. Preparazione di soluzioni stock per 14substrati con etichetta C
<ol><li>Produrre 4 mM di soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) mescolando 11 g di BSA e 33,1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco e agitandola delicatamente a temperatura ambiente per ~ 3 ore fino a quando BSA non è completamente disciolto. Riscaldare la soluzione madre BSA a bagnomaria a 70 °C prima dell'uso.</li>
	<li>Asciugare all'aria 50 μCi 14C-oleato (50 μCi/μmol in etanolo) nel flaconcino con il coperchio spento per 8 ore in una cappa di lavoro RAM designata. Aggiungere 312,5 μL di H2O e poi 3,5 mg (11,5 μmol) di oleato di sodio. Mescolare accuratamente.</li>
	<li>Riscaldare la soluzione risultante a 70 °C a bagnomaria. Aggiungere 0,9375 mL della soluzione madre BSA preriscaldata per produrre 10 mM di soluzione madre di oleato caldo (contenente un rapporto 1:11,5 di 14C-oleato e oleato non etichettato). Aliquotare la soluzione madre e conservarla a -20 °C per un uso a lungo termine.</li>
	<li>Utilizzare 14C-glucosio e 14C-glutammina direttamente dopo lo scongelamento.</li>
</ol>2. Preparazione di un mezzo contenente 14substrati marcati con etichetta C
NOTA: per garantire concentrazioni affidabili di substrati energetici nel fluido, è necessario utilizzare supporti personalizzati con substrati freschi aggiunti poco prima dell'uso. Qui viene utilizzato un minimum essential medium (MEMα) su misura senza glucosio, piruvato, glutammina, rosso fenolo o bicarbonato di sodio. Tuttavia, un mezzo ottimale dovrebbe essere determinato per ogni tipo di cellula.
<ol><li>Ricostituire 8,67 g di polvere media in 1 L di acqua purificata. Aggiungere 2,2 g di bicarbonato di sodio per ottenere un pH di 7,4 e filtrare la soluzione utilizzando la filtrazione sotto vuoto da 0,22 μm.</li>
	<li>Aggiungere ingredienti freschi per ottenere il mezzo completo (cMEMα) con concentrazioni finali di 5,5 mM di glucosio, 2 mM di glutammina, 1 mM di piruvato e 10% di siero bovino fetale (FBS). Integrare ulteriormente cMEMα con 100 mM di L-carnitina e 10 μM HEPES per facilitare l'ossidazione degli acidi grassi.</li>
	<li>Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 14substrati con etichetta C a cMEMα appena preparato per ottenere supporti caldi. Per rendere il mezzo oleato caldo, aggiungere la soluzione madre di oleato caldo da 10 mM a cMEMα per una concentrazione finale di oleato di 100 μM (diluizione 1:100, radioattività finale 0,4 μCi/mL). NOTA: il materiale oleato caldo da 10 mM contenente un rapporto 1:11,5 di oleato caldo/freddo (vedere punto 1.3) viene utilizzato per raggiungere un livello fisiologico di oleato totale di 100 μM nel fluido riducendo al minimo la quantità di materiale radioattivo.</li>
	<li>Produrre 10 mM di brodo di oleato non etichettato aggiungendo 24,36 mg di oleato di sodio a 2 mL di H2O a bagnomaria a 70 °C per ~20 minuti fino a completa dissoluzione prima di mescolare rapidamente con 6 mL della soluzione madre BSA da 4 mM preriscaldata a 70 °C. Trasferire a bagnomaria a 37 °C per 1 ora e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Aliquota e conservazione a -20 °C per uso a lungo termine.</li>
	<li>Per produrre glucosio mezzo caldo, aggiungere 14C-glucosio ad una concentrazione finale di 1,333 μM (diluizione 1:4.125, radioattività finale 0,4 μCi/mL). Per rendere la glutammina media calda, aggiungere 14C-glutammina alla concentrazione finale di 2 μM (diluizione 1:1.000, radioattività finale 0,4 μCi/mL).</li>
	<li>Integrare il mezzo caldo di glucosio e glutammina con una soluzione madre da 10 mM di oleato non marcato dal punto 2.4 per ottenere la concentrazione finale di oleato di 100 μM, la stessa di quella nel mezzo caldo oleato.</li>
</ol>3. Preparazione delle cellule
NOTA: I preosteoblasti calvariali e i macrofagi del midollo osseo sono usati come esempi qui. Gli utenti dovrebbero preparare il loro tipo di cella di scelta in base ai protocolli appropriati. Ottimizzare la concentrazione di collagenasi II da utilizzare per la digestione in esperimenti pilota in quanto l'attività enzimatica può variare tra diversi lotti.
<ol><li>Isolamento e coltura dei preosteoblasti calvariali<ol>
<li>Sacrificare i cuccioli postnatali giorno 3-5 (P3-5) per decapitazione e trasferirli in DPBS ghiacciato contenente penicillina-streptomicina (P / S).</li>
		<li>Esporre la calvaria rimuovendo la pelle e i tessuti molli. Raccogliere la regione centrale tagliando via i tessuti circostanti da dietro a davanti in DPBS (Figura 1A). Gratta delicatamente le superfici interne ed esterne della calvaria usando una pinzetta per aiutare a rilasciare le cellule dopo la successiva digestione.</li>
		<li>Preparare una soluzione da 2 mg/mL e una soluzione da 4 mg/mL di collagenasi di tipo II in DPBS e filtrare ogni soluzione con un filtro fresco da 0,22 μm. Digerire prima la calvaria pulita con la soluzione di collagenasi da 2 mg/ mL per 15 minuti e scartare la soluzione di digestione. Digerire i campioni puliti in soluzione di collagenasi da 4 mg/mL 3 volte per 15 minuti ogni volta, mettendo in comune e risparmiando la soluzione di digestione.</li>
		<li>Filtrare la soluzione di digestione attraverso filtri cellulari da 70 μm e centrifugare il filtrato a 300 × g per 5 minuti. Sospendere il pellet cellulare in cMEMα (vedere punto 2.2) contenente il 10% di FBS e P/S.</li>
		<li>Contare e seminare le cellule a 4 × 104 cellule/cm2 in piastre da 10 cm. Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per 3 giorni.</li>
		<li>Dissociare le cellule a 37 °C con lo 0,25% di tripsina-EDTA. Contare e seminare le cellule in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti con cMEMα contenente il 10% di FBS e P/S a 7,5 × 105/cm2. Seminare almeno 4 pozzetti per tipo di cellula per substrato e almeno tre pozzetti extra per ogni tipo di cellula per il conteggio delle cellule prima del test.</li>
		<li>Coltivare le cellule a 37 °C durante la notte prima dei test di ossidazione del substrato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento e cultura dei BMM NOTA: La coltura di BBM richiede un fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), che può essere acquistato commercialmente come proteina ricombinante. Il mezzo condizionato dalla linea cellulare CMG14-12 progettato per esprimere M-CSF è un'alternativa economica utilizzata qui13.<ol>
<li>Raccogli femori e tibie da topi di 8 settimane dopo aver rimosso il muscolo e i tessuti connettivi. Tagliare e scartare entrambe le estremità delle ossa con forbici affilate.</li>
		<li>Sciacquare il midollo osseo da un femore e una tibia in una capsula di Petri di 10 cm con una siringa dotata di un ago da 23 G contenente 15 ml di cMEMα con il 10% di FBS, P/S e il 10% di CMG14-12 di mezzo condizionato (mezzo BMM). Coltivare le cellule nella capsula di Petri in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
		<li>Dopo 3 giorni, scartare il terreno di coltura e risciacquare con DPBS. Dissociare le cellule attaccate a 37 °C con lo 0,25% di tripsina-EDTA per 5 minuti. Centrifugare e risospendare il pellet cellulare nel mezzo BMM.</li>
		<li>Contare e seminare le cellule in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti a 7,5 × 105/cm2 nello stesso modo descritto al punto 3.1.6. Coltura a 37 °C durante la notte nel mezzo BMM prima di iniziare i test.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Saggio di ossidazione del substrato con trappola di CO2
NOTA: deve essere determinata una densità di semina appropriata per ciascun tipo di cellula per raggiungere una confluenza dell'80-90% prima dell'inizio del test. Si noti che la densità cellulare può influenzare lo stato metabolico delle cellule.
<ol><li>Lavare le cellule nei pozzetti extra due volte con DPBS. Dissociare le cellule con lo 0,25% di tripsina-EDTA e cellule miste da 20 μL risospese in DPBS con 20 μL di acridina arancia/ioduro di propidio (AO/PI) pronta all'uso soluzione colorante commerciale. Determinare il numero di cellule vive con un contatore di celle automatizzato e registrare il numero per i calcoli finali.</li>
	<li>Lavare le cellule nei pozzetti di analisi due volte con DPBS. Aggiungere 500 μL di mezzo caldo a ciascun test bene nella cappa di coltura tissutale designata dalla RAM. Sigillare le piastre con parafilm e incubare le celle in un incubatore designato dalla RAM a 37 °C per 4 ore.</li>
	<li>Durante l'incubazione, tagliare la carta da filtro in pezzi circolari leggermente più grandi dell'area all'interno del cappuccio di tubi di microcentrifuga da 1,5 ml e inserire la carta comodamente nel cappuccio (Figura 1B). Aggiungere 200 μL di acido perclorico 1 M a ciascun tubo e 20 μL di idrossido di sodio alla carta da filtro montata all'interno del tappo.</li>
	<li>Dopo l'incubazione delle cellule, trasferire 400 μL di terreno di coltura da ciascun pozzetto ai tubi preparati e chiudere immediatamente i tappi. Lasciare i tubi in un portatubi a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
	<li>Durante l'incubazione, impostare una fiala di scintillazione per ogni tubo e riempirla con 4 ml di liquido di scintillazione. Trasferire ogni pezzo di carta da filtro in un flaconcino scintillante e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
	<li>Eseguire test di pulizia sulla cappa di coltura del tessuto, sul bagno d'acqua (utilizzato per la preparazione di 14C-oleato), sul frigorifero, sull'incubatore, sul lavandino, sul terreno e su qualsiasi altra area di lavoro per una potenziale contaminazione da RAM. Mettere le salviette di carta in flaconcini di scintillazione contenenti liquido di scintillazione.</li>
	<li>Misurare la radioattività di 14C nei flaconcini di scintillazione con un contatore di scintillazione. Registrare i risultati di lettura. Decontaminare l'ambiente di lavoro secondo le linee guida sulla sicurezza delle radiazioni, se necessario.</li>
</ol>5. Analisi dei dati
NOTA: Supponendo che ogni substrato sia completamente ossidato per rilasciare CO2, il tasso di ossidazione del substrato può essere calcolato dalla radioattività CO2 intrappolata .
<ol><li>Calcolare il tasso di ossidazione del substrato utilizzando Eq (1) e i valori X, Y e Z indicati nella Tabella 1 per diversi substrati. Tasso di ossidazione del substrato (μmol/cell/h) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg">   (1)<ol>
<li>Calcola le disintegrazioni totali al minuto (DPM) per ogni reazione bene. Per X, utilizzare il valore DPM (lettura del contatore di scintillazione) da 0,4 mL del mezzo di reazione utilizzato per l'intrappolamento di CO2 su 0,5 mL del mezzo di reazione totale. Pertanto, il DPM totale di ciascun pozzo di reazione è X × 1,25.</li>
		<li>Dividere il DPM totale per un fattore di 2.220.000 da convertire in μCi.</li>
		<li>Convertire la radioattività in μCi nel numero di 14molecole marcate con C. Dividere il valore μCi per l'attività specifica (Y) di ciascun substrato etichettato. Utilizzare i seguenti valori Y (Tabella 1): 14C-glucosio: 300 mCi/mmol; 14 anni C-glutammina: 200 mCi/mmol; 14 anni C-oleato: 50 mCi/mmol.</li>
		<li>Calcola il numero totale di molecole ossidate dalle 14molecole marcate C ossidate moltiplicando queste ultime per il fattore di diluizione da caldo a totale (Z). Utilizzare i seguenti valori Z (Tabella 1): Glucosio: 4.125; glutammina: 1.000; oleato: 12.5.</li>
		<li>Dividere il prodotto risultante per numero di cella (cell#) e 4 (per il tempo di reazione di 4 h) per determinare il tasso di ossidazione del substrato per cella. Utilizzare il cell# determinato nei pozzetti paralleli all'inizio del test.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il protocollo fornisce un metodo facile da usare per determinare il tasso di ossidazione dei principali substrati energetici. È un'alternativa più semplice ad altri protocolli che utilizzano palloni contenenti un pozzo centrale e ricoperti da tappi di gomma 14,15,16. Sebbene lo studio di esempio qui sia eseguito con coltura cellulare, il metodo può essere facilmente adattato per espianti tissutali o omogeneizzati tissutali conte...

La fosforilazione ossidativa (OXPHOS) negli eucarioti è il processo attraverso il quale i nutrienti vengono scomposti all'interno dei mitocondri per rilasciare energia chimica sotto forma di ATP attraverso il consumo di ossigeno.  Il catabolismo di vari substrati all'interno dei mitocondri attraverso il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) genera direttamente poche molecole di ATP, ma piuttosto immagazzina energia attraverso la riduzione dei portatori di elettroni nicotinamide adenina dinucleotide (NAD +) e flavina adenina dinucleotide (FAD +). I portatori ridotti vengono quindi ossidati da ETC situati sulla membrana interna dei mitocondri per generare un gradiente di concentrazione protonica attraverso la membrana. I protoni alla fine fluiscono lungo il loro gradiente nella matrice mitocondriale attraverso l'ATP sintasi per produrre ATP. OXPHOS è il mezzo più efficiente di produzione di ATP da substrati energetici e generalmente preferito in ambienti aerobici. In precedenza, la glicolisi aerobica - produzione di lattato dal glucosio mentre l'ossigeno è presente - era ritenuta fisiopatologica, spesso un segno distintivo delle cellule tumorali. Sempre di più, si sta scoprendo che alcuni tipi di cellule normali usano la glicolisi aerobica per ragioni che devono ancora essere completamente decifrate.
La flessibilità metabolica è la capacità delle cellule o degli organismi di adattarsi alle mutevoli richieste di energia e alle fonti di combustibile disponibili. Ad esempio, la domanda energetica del muscolo scheletrico è soddisfatta principalmente da OXPHOS allo stato stazionario, ma dalla glicolisi anaerobica durante l'esercizio ad alta intensità1. Con l'aumentare della durata dell'esercizio, l'ossidazione del glucosio e degli acidi grassi contribuisce maggiormente alla produzione complessiva di energia2. Tuttavia, l'uso del substrato non dipende solo dalla disponibilità, poiché i substrati competono antagonisticamente durante l'ossidazione. In particolare, l'ossidazione degli acidi grassi ha dimostrato di inibire l'utilizzo del glucosio da parte del muscolo scheletrico in un fenomeno noto come effetto Randle3. Un effetto reciproco è stato dimostrato da studi successivi 4,5. Inoltre, molte malattie sono associate a un cambiamento nella preferenza del substrato e allo sviluppo di inflessibilità metabolica nelle cellule. Ad esempio, l'ossidazione degli acidi grassi è ridotta nel muscolo scheletrico dei pazienti diabetici di tipo II rispetto ai normali soggetti di controllo6. I cambiamenti metabolici nelle impostazioni della malattia sono oggetto di intense indagini in quanto possono contribuire alla patogenesi.
Il metabolismo energetico nei tipi di cellule scheletriche è relativamente poco studiato, ma ha attirato l'attenzione negli ultimi anni7. Lavori precedenti hanno dimostrato che la glicolisi aerobica è la via energetica dominante negli osteoblasti calvariali, mentre l'ossidazione del glucosio attraverso il ciclo TCA svolge un ruolo nella formazione degli osteoclasti 8,9. Altri hanno fornito prove per gli acidi grassi come fonte di energia per gli osteoblasti10. Il catabolismo della glutammina ha anche dimostrato di supportare la differenziazione degli osteoblasti dai progenitori11,12. Tuttavia, manca ancora una comprensione completa dell'utilizzo del substrato da parte di vari tipi di cellule scheletriche. Inoltre, si prevede che i cambiamenti nel metabolismo cellulare durante la differenziazione cellulare o in risposta a segnali patologici alterino l'utilizzo del substrato del carburante. Di seguito è descritto un protocollo di facile utilizzo per l'analisi dell'ossidazione del substrato in vitro.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Utilizzato per filtrare la soluzione BSA</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Dissociare le cellule da piastre per colture cellulari</td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 mL</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>Utilizzato per l'incubazione di reazione</td></tr><tr><td>Piastre da 10 cm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Utilizzato per colture cellulari</td></tr><tr><td>Siringa da 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td>Utilizzato per lavare il midollo dalle ossa lunghe</td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td>Per la preparazione di terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>14C-glucosio</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042X050UC</td><td>Utilizzato per produrre terreni caldi</td></tr><tr><td>14C-glutammina</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td><td>Utilizzato per produrre terreni caldi</td></tr><tr><td>14C-oleato</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC317050UC</td><td>Utilizzato per realizzare terreni caldi</td></tr><tr><td>Ago da 23 G</td><td>BD</td><td>305120</td><td>Utilizzato per lavare il midollo dalle ossa lunghe Piastre a</td></tr><tr><td>24 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Utilizzato per colture cellulari</td></tr><tr><td>70 &mu; filtri cellulari m</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>Utilizzato per filtrare il surnatante durante la digestione cavalleresca</td></tr><tr><td>Colorante Acridina Arancio/Propidio Ioduro (AO/PI)</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>Colora le cellule vive per determinare la densità dei semi</td></tr><tr><td>Siero bovino Ablumin</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>Utilizzato per la coniugazione degli acidi grassi</td></tr><tr><td>Cellometro Auto 2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>Determinare il numero di cellule vitali</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Fisher</td><td>Legend Micro 21R</td><td>Utilizzato per pellettare le cellule</td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Dissociare le cellule dal tessuto</td></tr><tr><td>MEM alfa</td><td>GIBCO</td> PERSONALIZZATO <td>SKU: ME 18459P1</td><td>Utilizzato per creare terreni caldi personalizzati</td></tr><tr><td>Gibco</td> salino<td>tamponato con fosfato di Dulbecco</td><td>10010023</td><td>Utilizzato per sciogliere e diluire i reagenti e lavare le stoviglie di coltura</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>Trappole CO2 con idrossido di sodio</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g7528</td><td>Utilizzato per realizzare terreni personalizzati</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Trappole CO2 durante la coltura cellulare</td></tr><tr><td>L-carnitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td>Integrato per l'ossidazione degli acidi grassi</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g3126</td><td>Utilizzato per realizzare terreni personalizzati</td></tr><tr><td>MEM alfa</td><td>Thermo</td><td>A10490</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pecheney Plastic Packaging</td><td>PM998</td><td>Utilizzato per sigillare le piastre di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Previene la contaminazione nelle colture cellulari</td></tr><tr><td>Acido perclorico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>Rilascia CO2 durante il saggio metabolico</td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p5280</td><td>Utilizzato per realizzare terreni personalizzati</td></tr><tr><td>Contatore di scintillazione Beckman</td><td>Coulter</td><td>LS6500</td><td>Determina la radioattività dalla carta da filtro</td></tr><tr><td>Fluido di scintillazione</td><td>MP Biomedicals</td><td>882453</td><td>Assorbe l'energia emessa dai RAM e la riemette sotto forma di lampi di luce</td></tr><tr><td>Fiala di scintillazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td>Contenitori di reazione per fluido di scintillazione</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Tampone di equilibrio per</td></tr><tr><td>idrossido di sodio</td> medio <td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>Intrappola CO2 durante il saggio metabolco</td></tr><tr><td>Oleato di</td> <td>sodioSANTA CRUZ</td><td>SC-215879</td><td>Preparazione di acidi grassi coniugati BSA</td></tr><tr><td>Filtrazione sottovuoto 1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>Filtro cMEM&alpha;</td></tr></tbody></table>

valutazione dell'ossidazione del substrato energetico in vitro con 14intrappolamento di co 2

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

I mitocondri ospitano i macchinari per il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e la catena di trasporto degli elettroni (ETC), che generano adenosina trifosfato (ATP) per mantenere l'omeostasi energetica. Glucosio, acidi grassi e amminoacidi sono i principali substrati energetici che alimentano la respirazione mitocondriale nella maggior parte delle cellule somatiche. L'evidenza mostra che diversi tipi di cellule possono avere una netta preferenza per determinati substrati. Tuttavia, l'utilizzo del substrato da parte di varie cellule nello scheletro non è stato studiato in dettaglio. Inoltre, poiché il metabolismo cellulare è in sintonia con i cambiamenti fisiologici e fisiopatologici, le valutazioni dirette della dipendenza dal substrato nelle cellule scheletriche possono fornire importanti informazioni sulla patogenesi delle malattie ossee.
Il seguente protocollo si basa sul principio del rilascio di anidride carbonica dalle molecole del substrato dopo fosforilazione ossidativa. Utilizzando substrati contenenti atomi di carbonio marcati radioattivamente (14C), il metodo fornisce un saggio sensibile e facile da usare per il tasso di ossidazione del substrato in coltura cellulare. Un caso di studio con preosteoblasti calvariali primari rispetto a macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) dimostra un diverso utilizzo dei substrati principali tra i due tipi di cellule.

In questo esempio, il metodo di intrappolamento della CO2 viene utilizzato per confrontare l'ossidazione del substrato da parte dei preosteoblasti calvariali primari rispetto ai BMM, che vengono spesso utilizzati rispettivamente per la differenziazione in vitro degli osteoblasti o degli osteoclasti. Dopo che le cellule primarie sono passate e coltivate in cMEMα durante la notte, in genere raggiungono l'80-90% della confluenza e mostrano la loro morfologia caratteristica. I preosteoblasti calvariali so...

Questo protocollo descrive un metodo facile da usare per esaminare l'ossidazione del substrato monitorando la produzione di 14CO2 in vitro.

Valutazione dell'ossidazione del substrato energetico in vitro con 14INtrappolamento di CO 2

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

L'uso di diversi substrati energetici è sia specifico del tipo cellulare che indicativo della malattia. Misurare il consumo dei substrati specifici può far luce sia sulla normale biologia che sulla patologia. La tecnica non ha bisogno di attrezzature specializzate ed è facile da scalare.È anche più facile da usare rispetto ai metodi pubblicati in precedenza. Comprendere i cambiamenti nel tasso di ossidazione del substrato consentirà lo sviluppo di interventi dietetici e farmacologici per i disturbi metabolici. Sebbene dimostrata con il tessuto osseo, questa tecnica è facilmente personalizzabile per studiare la flessibilità metabolica in tutti i tipi di cellule fornendo una comprensione sia delle cause che delle conseguenze dei cambiamenti metabolici.Dopo aver sacrificato i cuccioli da tre a cinque giorni postnatali, trasferirli in D PBS ghiacciato contenente penicillina streptomicina doppia soluzione antibiotica. Esporre la calvaria rimuovendo la pelle e i tessuti molli. Raccogliere la regione centrale tagliando i tessuti circostanti da dietro a davanti in D PBS.Gratta delicatamente le superfici interne ed esterne della calvaria usando una pinzetta per aiutare a rilasciare le cellu

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La risonanza paramagnetica elettronica (EPR) spettroscopia è stato impiegato per rilevare ossido nitrico da cellule endoteliali aortiche bovine e radicale superossido da neutrofili umani utilizzando ferro (II)-N-metil-D-glucammina ditiocarbammato, Fe...

Rilevamento di ossido nitrico e anione superossido radicale da spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica da cellule con Spin Traps

Questo video mostra una tecnica di quantificazione per la CO2 rilasciata durante l'ossidazione del substrato utilizzando 14substrati radiomarcati con C. Il 14CO2 rilasciato viene intrappolato in una soluzione alcalina e quantificato da un contatore a scintillazione. L'ossidazione dei diversi substrati varia tra i tessuti e riflette la condizione fisiopatologica del tessuto.

Saggio di ossidazione del substrato in cellule in coltura: un saggio in vitro per quantificare l'ossidazione del substrato nelle cellule misurando i segnali radioattivi da CO2 intrappolato

Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L'uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

L'obiettivo del presente protocollo è di monitorare spettrofotometricamente trans-plasma membrana elettrone trasporto utilizzando accettori extracellulari e di analizzare le interazioni enzimatiche che possono verificarsi con questi accettori extracellulari.

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Impara a misurare l'ossidazione del substrato energetico in vitro tramite il tracciamento del 14CO2. Questo metodo scalabile facilita la ricerca sui disturbi metabolici in diversi tipi cellulari.

Valutazione dell'ossidazione del substrato energetico in vitro con ¹⁴_{INtrappolamento} di CO 2

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