Name: Quantificazione a livello globale delle modifiche post-traduzionali degli istoni in un modello di coltura cellulare 3D del tessuto epatico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri la quantificazione globale delle modifiche post-traduzionali degli istoni in colture cellulari 3D di epatociti C3A. Questo metodo LC-MS/MS permette di analizzare centinaia di PTMs in un singolo esperimento per studiare la dinamica della cromatina.

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Il laboratorio Sidoli riconosce con gratitudine la Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck e l'NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

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<li>Chan, J. C., Maze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nothing+is+yet+set+in+%28hi%29stone%3A+novel+post-translational+modifications+regulating+chromatin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).</li>
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<li>Moradian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top-down%2C+middle-down%2C+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li>
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<li>Wojcik, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27+dimethyl+loss+is+highly+specific+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+and+distinguishes+true+PRC2+loss+from+isolated+H3K27+trimethyl+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss.</a> Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).</li>
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<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADP-ribosylation+of+histone+variant+H2AX+promotes+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair.</a> The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).</li>
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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

L'analisi dei PTM istonici è fondamentalmente diversa dalla tipica pipeline di analisi proteomica. La maggior parte dei PTM istonici hanno ancora funzioni biologiche enigmatiche; di conseguenza, annotazioni come Gene Ontology o database di pathway non sono disponibili. Esistono diverse risorse che associano le modificazioni istoniche all'enzima responsabile della loro catalisi o proteine contenenti domini che legano questi PTM (ad esempio, HISTome36). Inoltre, è possibile speculare sullo stato gen...

Dalla fine del 19° secolo, i sistemi di coltura cellulare sono stati utilizzati come modello per studiare la crescita e lo sviluppo delle cellule al di fuori del corpo umano 1,2. Il loro uso è stato esteso anche per studiare come funzionano i tessuti e gli organi in contesti sia sani che malati 1,3. Le cellule in sospensione (ad esempio, le cellule del sangue) crescono in piastre di Petri o fiaschi senza soluzione di continuità e in modo intercambiabile poiché non si assemblano in strutture tridimensionali (3D) in vivo. Le cellule derivate da organi solidi possono crescere in sistemi di coltura bidimensionali (2D) o 3D. Nella coltura 2D, le cellule vengono coltivate in un monostrato che aderisce a una superficiepiana 2,4. I sistemi di coltura cellulare 2D sono caratterizzati da una crescita esponenziale e da un tempo di raddoppio rapido, in genere da 24 ore a pochi giorni5. Le cellule nei sistemi 3D crescono fino a formare intricate interazioni cellula-cellula modellando più da vicino conglomerati simili a tessuti e sono caratterizzate dalla loro capacità di raggiungere un equilibrio dinamico in cui il loro tempo di raddoppio può raggiungere 1 mese o più5.
In questo articolo viene presentata una metodologia innovativa per far crescere sferoidi 3D in sistemi di coltura cellulare rotante che simulano la gravità ridotta6. Questo è un derivato semplificato di un sistema di coltura cellulare introdotto dalla NASA nel 19907. Questo approccio riduce al minimo le forze di taglio, che si verificano nei metodi esistenti come i palloni rotanti, e aumenta la riproducibilità dello sferoide6. Inoltre, il bioreattore rotante aumenta la diffusione attiva dei nutrienti, riducendo al minimo la formazione necrotica che si verifica in sistemi come la coltura cellulare a goccia sospesa in cui lo scambio di media non è pratico6. In questo modo, le cellule crescono per lo più indisturbate, consentendo la formazione di caratteristiche strutturali e fisiologiche associate alle cellule che crescono nei tessuti. Gli epatociti C3A (HepG2 / C3A) coltivati in questo modo non solo avevano organelli ultrastrutturali, ma producevano anche quantità di ATP, adenilato chinasi, urea e colesterolo paragonabili ai livelli osservati in vivo 1,2. Inoltre, le cellule cresciute in sistemi di coltura cellulare 2D vs.3D presentano diversi modelli di espressione genica8. L'analisi dell'espressione genica degli epatociti C3A cresciuti come sferoidi 3D ha mostrato che queste cellule esprimevano una vasta gamma di proteine specifiche del fegato, nonché geni coinvolti in percorsi chiave che regolano la funzionalità epatica8. Pubblicazioni precedenti hanno dimostrato le differenze tra i proteomi di cellule in crescita esponenziale in coltura 2D rispetto alle cellule in equilibrio dinamico in colture sferoidi 3D5. Queste differenze includono il metabolismo cellulare, che a sua volta influenza la struttura, la funzione e la fisiologia della cellula5. Il proteoma delle cellule cresciute in coltura 2D era più arricchito in proteine coinvolte nella replicazione cellulare, mentre il proteoma degli sferoidi 3D era più arricchito nella funzionalità epatica5.
Il tasso di replicazione più lento delle cellule cresciute come sferoidi 3D modella in modo più accurato fenomeni specifici associati allo stato e alle modifiche della cromatina (ad esempio il ritaglio dell'istone9). Il clipping istonico è una modificazione post-traduzionale irreversibile dell'istono (PTM) che causa la scissione proteolitica di parte della coda N-terminale dell'istone. Mentre la sua funzione biologica è ancora in discussione 10,11,12,13, è chiaro che la sua presenza nelle cellule primarie e nel tessuto epatico è modellata da cellule HepG2 / C3A cresciute come sferoidi, ma non come cellule piatte 9. Questo è fondamentale, poiché lo stato della cromatina e le modifiche regolano la lettura del DNA principalmente modulando l'accessibilità ai geni e quindi la loro espressione14. I PTM istonici influenzano direttamente lo stato della cromatina influenzando la carica netta dei nucleosomi in cui sono assemblati gli istoni, o indirettamente reclutando scrittori, lettori e cancellatori di cromatina14. Centinaia di PTM istonici sono stati identificati fino ad oggi15, rafforzando l'ipotesi che la cromatina ospiti un "codice istonico" utilizzato dalla cellula per interpretare il DNA16. Tuttavia, l'identificazione di una miriade di combinazioni PTM15 e la scoperta che le combinazioni di PTM istonici hanno spesso funzioni biologiche diverse dalle PTM presenti in isolamento (ad esempio Fischle, et al.17), evidenzia che è necessario più lavoro per decifrare il "codice istonico".
Attualmente, l'analisi PTM degli istoni si basa su tecniche che utilizzano anticorpi (ad esempio, western blots, immunofluorescenza o immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento [ChIP-seq]) o spettrometria di massa (MS). Le tecniche basate su anticorpi hanno un'elevata sensibilità e possono fornire informazioni dettagliate sulla localizzazione a livello di genoma dei segni istonici, ma sono spesso limitate nello studio di PTM o PTM rari presenti in combinazioni 18,19,20. La SM è più adatta per l'identificazione e la quantificazione imparziali e ad alto rendimento di modificazioni proteiche singole e coesistenti, in particolare proteine istoniche 18,19,20. Per questi motivi, questo e molti altri laboratori hanno ottimizzato la pipeline MS per l'analisi di peptidi istonici (MS bottom-up), code istoniche intatte (MS middle-down) e proteine istoniche a lunghezza intera (MS top-down)21,22,23.
Di seguito è riportato un flusso di lavoro per la coltivazione di sferoidi HepG2 / C3A e la loro preparazione per l'analisi dei peptidi istonici (MS bottom-up) tramite cromatografia nano-liquida, accoppiata online con spettrometria di massa tandem (nLC-MS / MS). È stata coltivata una coltura cellulare 2D e le cellule sono state raccolte e trasferite in un bioreattore dove avrebbero iniziato a formare sferoidi (Figura 1). Dopo 18 giorni in coltura, gli sferoidi sono stati trattati con butirrato di sodio o succinato di sodio per aumentare l'abbondanza relativa di acetilazione e succinilazione degli istoni. In particolare, le colture 3D possono essere trattate con composti genotossici altrettanto bene dei loro equivalenti di coltura piatta; infatti, recenti pubblicazioni evidenziano che la risposta tossicologica delle cellule in coltura 3D è più simile ai tessuti primari rispetto a quelli in coltura piatta 2D 24,25. Le cellule sono state quindi raccolte in punti temporali specificati ed è stato eseguito l'isolamento nucleare. Quindi, gli istoni sono stati estratti e derivatizzati con anidride propionica prima e dopo la digestione della tripsina secondo un protocollo sviluppato per la prima volta da Garcia et al.26. Questa procedura genera peptidi di dimensioni appropriate per la separazione online con cromatografia a fase inversa (C18) e il rilevamento con SM. Infine, i peptidi istonici sono stati identificati e quantificati e i dati generati sono stati rappresentati in più modi per un'interpretazione biologica più completa.

<table><tbody><tr><td>soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,5-20 &micro; L pipette</td><td>BRAND</td><td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 &; Pipetta multicanale L</td><td>BRAND</td><td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td><td>Punta Luer lock, graduata a 12 mL</td></tr><tr><td>10, 20, 200 e 1000 &; L pipette monocanale</td><td>Eppendorf</td><td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L puntali per pipette</td><td>Rainin</td><td>30389164</td><td></td></tr><tr><td>ago per siringa da 18 G</td><td>Air-Tite</td><td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td><td>3" lunghezza, 0,05" diametro</td></tr><tr><td>200 &; Pipetta multicanale a L</td><td>Corning</td><td>4082</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &micro; L puntali per pipette</td><td>MARCA</td><td>Z740118 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra a 24 pozzetti con attacco ultrabasso</td><td>Corning</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2&nbsp; Pallone per colture cellulari a forma di U</td><td>Corning</td><td>461464U</td><td>Non trattato, con tappo di sfiato</td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C (Corning)</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td>L'acetone deve essere utilizzato a freddo</td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio (NH4HCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio Fisher</td><td>Scientific AC423300250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReattore</td><td>CelVivo</td><td>10004-12</td><td>Bioreattore per colture cellulari 3D</td></tr><tr><td>ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Clinostat CO2 incubatore per colture cellulari 3D</td></tr><tr><td>Unità di controllo</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Tablet per ClinoStar </td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>17-205-CV</td><td>1X soluzione con 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio, senza L-glutammina e rosso fenolo</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Cappa aspirante</td><td>Mott</td><td>N/A</td><td>Modello 7121000</td></tr><tr><td>Vetro Pipetta Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td>9", tappo di cotone, vetro borosilicato, integratore</td></tr><tr><td>di Glutagro</td> non sterile <td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td>200 mM L-ananil-L-glutammina</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>Soluzione 1X senza calcio, magnesio e fenolo rosso</td></tr><tr><td>Acetonitrile di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoacidi non essenziali</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td>100X soluzione</td></tr><tr><td>Oasis Resina HLB</td><td>Acque</td><td>186007549</td><td>Resina idrofila-lipofila-bilanciata (HLB) con 30&micro; dimensione delle particelle</td></tr><tr><td>m Orbitrap Fusion Spettrometro di massa Lumos Tribrid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Spettrometro di massa ad alta risoluzione</td></tr><tr><td>Piastra filtrante in polipropilene Oro-Flex I</td><td>Orochem</td><td>OF1100</td><td>Piastra filtrante in polipropilene a 96 pozzetti con 10 e micro; M PE fritta</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X soluzione</td></tr><tr><td>pH carta</td><td>Hydrion</td><td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td><td>0-13 pH test</td></tr><tr><td>carta Pistola pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro capillary</td><td>Molex</td><td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td><td>Tubo capillare flessibile in silice fusa con rivestimento in poliammide, 75 &; M ID x 363 & micro; M OD</td></tr><tr><td>Polistirene 10 mL pipette sierologiche, sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Anidride propionica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur resina</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.0003</td><td>120 & Dimensione dei pori di Aring; , fase C18-AQ, 3 & micro; Dimensione delle perle</td></tr><tr><td>M Rotator</td><td>Clay Adams</td><td>25477 (American Laboratory Trading)</td><td>Nutator Mixer 1105</td></tr><tr><td>Grado di sequenziamento tripsina modificata</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11079</td><td></td></tr><tr><td>Succinato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160-100G</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentratore sottovuoto (provette per microcentrifuga da 1,5 mL)</td><td>Savant</td><td>20249 (American Laboratory Trading)</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore sottovuoto SpeedVac (96 pozzetti)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15308325</td><td>Cappa</td></tr><tr><td>sterile</td><td>Savant SPD1010 Thermo Scientific</td><td>1375</td><td>Classe II, Tipo A2</td></tr><tr><td>Acido solforico (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-375</td><td>Baker Analizzato Reagente</td></tr> <tr><td>ACSPiastra da 100 mm x 20 mm trattata con coltura tissutale</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-23</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico (TCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC421451000</td><td>Risospensione 100% p/v in acqua di grado HPLC</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico (TFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28904</td><td>Grado di sequenziamento</td></tr><tr><td>Collettore sottovuoto a 96 pozzetti</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma-Aldrich Z258415</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette a foro largo 1000 & micro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette a foro largo 200 & micro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione a livello globale delle modifiche post-traduzionali degli istoni in un modello di coltura cellulare 3d del tessuto epatico

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Le colture piatte di cellule di mammifero sono un approccio in vitro ampiamente utilizzato per comprendere la fisiologia cellulare, ma questo sistema è limitato nella modellazione dei tessuti solidi a causa della replicazione cellulare innaturalmente rapida. Ciò è particolarmente difficile quando si modella la cromatina matura, poiché le cellule a replicazione rapida sono spesso coinvolte nella replicazione del DNA e hanno una popolazione poliploide eterogenea. Di seguito è presentato un flusso di lavoro per la modellazione, il trattamento e l'analisi delle modifiche della cromatina quiescente utilizzando un sistema di coltura cellulare tridimensionale (3D). Utilizzando questo protocollo, le linee cellulari di carcinoma epatocellulare vengono coltivate come sferoidi 3D riproducibili in un incubatore che fornisce una diffusione attiva dei nutrienti e basse forze di taglio. Il trattamento con butirrato di sodio e succinato di sodio ha indotto un aumento rispettivamente dell'acetilazione e della succinilazione degli istoni. Gli aumenti dei livelli di acetilazione e succinilazione degli istoni sono associati a uno stato di cromatina più aperto. Gli sferoidi vengono quindi raccolti per l'isolamento dei nuclei cellulari, da cui vengono estratte le proteine istoniche per l'analisi delle loro modificazioni post-traduzionali. L'analisi degli istoni viene eseguita tramite cromatografia liquida accoppiata online con spettrometria di massa tandem, seguita da una pipeline computazionale interna. Infine, vengono mostrati esempi di rappresentazione dei dati per indagare la frequenza e la presenza di segni di istoni combinatori.

In questo protocollo, gli sferoidi HepG2/C3A sono stati trattati con 20 mM NaBut e 10 mM NaSuc, entrambi i quali hanno influenzato i livelli globali di PTM istonici (Figura 3A). I PTM istonici sono stati quindi identificati e quantificati a livello di singolo residuo tramite acquisizione ms/MS (Figura 3B).
Quando i campioni vengono eseguiti in repliche, è possibile eseguire analisi statistiche per valutare l'arricchimento del...

Questo protocollo delinea come un sistema di coltura cellulare tridimensionale può essere utilizzato per modellare, trattare e analizzare le modifiche della cromatina in uno stato quasi fisiologico.

Quantificazione a livello globale delle modifiche post-traduzionali degli istoni in un modello di coltura cellulare 3D del tessuto epatico

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

La dinamica globale della cromatina ha dimostrato di essere un importante mediatore di diversi stati patologici, come il cancro e l'invecchiamento. Il nostro protocollo fornisce un modello fisiologicamente rilevante per studiare questo processo. L'analisi di laboratorio standard delle modifiche post-traduzionali degli istoni o PTMS è solitamente limitata al sondaggio per un singolo PTM alla volta utilizzando saggi basati su anticorpi.L'analisi della spettrometria di massa per cromatografia liquida dell'istone PTMS ci consente di misurare l'abbondanza di centinaia di PTMS in un singolo esperimento. A dimostrare la procedura saranno Stephanie Stransky, Ronald Cutler e Julie Kim, rispettivamente postdoc, studente laureato e tecnico di ricerca del laboratorio. In primo luogo, utilizzando mezzi di crescita standard, far crescere le cellule come un monostrato fino a quando non sono confluenti all'80%.Quindi lavare le cellule con HBSS. Aggiungere cinque millilitri di 0,05% tripsina-EDTA diluiti in HBSS. Incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Utilizzare un microscopio per controllare il distacco delle cellule. Dopo aver contato le cellule, diluire la sospensione cellulare con mezzi di crescita freschi. Aggiungere 0,5 millilitri di mezzi di crescita per equilibrare una piastra inferiore rotonda a 24 pozzetti con più micro-pozzetti in ciascuno.Quindi centrifugare le piastre a 3000 x g per rimuovere le bolle d'aria dalla superficie della piastra. Ora trasferire la sospensione cellulare precedentemente prodotta nella piastra a 24 pozzetti e centrifugare per tre minuti a 120 x g. Controllare le cellule nella piastra a 24 pozzetti e quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore per la formazione di sferoidi.Nel frattempo, per equilibrare il bioreattore, aggiungere 25 millilitri di acqua sterile alla camera di umidità e nove millilitri di mezzi di crescita alla camera cellulare. Incubare il bioreattore in un incubatore clinostat rotante per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Staccare gli sferoidi dalla piastra a 24 pozzetti con attacco ultra basso mediante pipettaggio delicato con punte di foro larghe un millilitro e trasferirle in un piatto di coltura tissutale.Per selezionare sferoidi sufficientemente forme, controllare la qualità degli sferoidi al microscopio. Gli sferoidi di buona qualità hanno dimensioni, compattezza e rotondità uniformi. Riempire il bioreattore equilibrato con cinque millilitri di terreni di crescita freschi e trasferire gli sferoidi in esso.Quindi riempire completamente il bioreattore con mezzi di crescita freschi e mettere il bioreattore nell'incubatore clinostat a 10-11 RPM. Ogni due o tre giorni, scambia i mezzi di crescita sostituendo 10 millilitri di vecchi media con nuovi media. Poiché questi sferoidi aumentano in dimensioni e numero, aumentare la velocità di rotazione dell'incubatore.Dopo aver ottenuto il pellet sferoide, aggiungere cinque volumi di acido solforico molare freddo 0,2 al pellet e pipettare su e giù per interrompere il pellet e rilasciare istoni. Una volta ottenuto il surnatante dopo la centrifugazione, aggiungere acido tricloroacetico concentrato a freddo, in modo tale che la concentrazione finale diventi dal 25 al 30% volume per volume. E mescolalo invertendo il tubo un paio di volte e centrifuga come descritto nel manoscritto.Dopo aver scartato il surnatante, utilizzando una pipetta di pascolo in vetro, lavare il pellet e le pareti del tubo con circa 500 microlitri di acetone freddo e acido cloridrico allo 0,1%, quindi centrifugare a 3.400 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi capovolgere il tubo per scartare il surnatante. Utilizzando una pipetta da pascolo in vetro, aggiungere 500 microlitri di acetone freddo al 100% per lavare il pellet e la centrifuga come dimostrato in precedenza.Dopo aver scartato il surnatante, rimuovere completamente l'acetone pipettando con cura e lasciare asciugare il campione con un coperchio aperto per circa 20 minuti. Risospendare il pellet in 20 microlitri dal 15 al 20% di acetonitrile in un bicarbonato di ammonio da 100 millimolari di pH 8. Dopo il vortice, abbassare la sospensione a 1000 x g per 30 secondi.Per otto o più campioni, trasferire ciascun campione sospeso su una piastra a 96 pozzetti. Quindi, in una cappa, aggiungere due microlitri di anidride propionica e mescolare pipettando cinque volte. Aggiungere rapidamente 10 microlitri di idrossido di ammonio e mescolare pipettando cinque volte.Mescolare la resina HLB su una piastra magnetica. Quindi aggiungere 70 microlitri della sospensione HLB a ciascun pozzetto di una piastra filtrante a 96 pozzetti su una piastra di raccolta a 96 pozzetti. Dopo aver scartato il flusso, lavare la resina con 100 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1%.Dopo aver risospeso ogni campione in 100 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1%, caricare ogni campione in ciascun pozzetto ed evitare schizzi usando un vuoto. Dopo aver scartato il flusso, lavare i campioni con 100 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1% e posizionare la piastra filtrante su una nuova piastra di raccolta. Quindi, aggiungere 60 microlitri di acetonitrile al 60% in acido trifluoroacetico allo 0,1% a ciascun pozzetto e prevenire schizzi usando il vuoto.Raccogliere il flusso attraverso e asciugare in un vuoto di velocità. Caricare la piastra di raccolta essiccata nell'HPLC ed eseguire il metodo LC/MS/MS come descritto nel manoscritto. In questo studio, la relativa abbondanza di modificazioni post-traduzionali degli istoni comuni è stata osservata negli epatociti C3A cresciuti come sferoidi tridimensionali.Modifiche post-traduzionali potrebbero anche essere osservate su un singolo residuo in peptidi generati da proteine istoniche. Il trattamento degli sferoidi con butirrato di sodio ha aumentato l'abbondanza relativa di acetilazione degli istoni, mentre quello con il succinato di sodio ha migliorato la succinilazione dei residui di istoni. Il metodo ha anche dimostrato il modello di distribuzione dell'acetilazione degli istoni dopo il trattamento con butirrato di sodio e quello della succinilazione degli istoni dopo il trattamento con succinato di sodio.Il risultato ha anche mostrato modelli commonatoriali di diverse modifiche istoniche. I trattamenti con butirrato di sodio hanno migliorato significativamente l'acetilazione del residuo di lisina 14 su un peptide generato dalla proteina istonica H3, solo quando il suo nono residuo di lisina aveva due gruppi metilici, ma non uno o tre gruppi metilici. Sono state calcolate anche le abbondanze relative di singole modificazioni e varie combinazioni di modifiche post-traduzionali nel peptide derivato da H3.Modelli combinatori di modificazioni post-traduzionali dopo il trattamento con butirrato di sodio sono stati osservati anche in un peptide generato dalla proteina istone H4. Anche in questo caso, il trattamento con butirrato di sodio ha comportato un aumento significativo dell'acetilazione. L'attenzione critica dovrebbe essere posta sul mantenere gli sferoidi sul banco il meno possibile e in una fase di dissalazione per evitare la fuoriuscita del campione. Questo flusso di lavoro può essere utilizzato per esplorare la cromatina nei tessuti solidi utilizzando un modello più fisiologico rispetto alle colture cellulari piatte a replica rapida.

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Descriviamo una serie di saggi per analizzare i livelli di espressione di istoni linker H1. mRNA di geni H1 individuali sono quantitativamente misurato casuale trascrizione inversa primer a base seguita da PCR in tempo reale, mentre la quantificazione della proteina istoni H1 è ottenuta mediante analisi HPLC.

Analisi di espressione di mammifero Linker-istoni Sottotipi

I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l'analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine ​​associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad...

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Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completamente integrato per la caratterizzazione di istone modificazioni post-traslazionali utilizzando la spettrometria di massa (MS). Il flusso di lavoro prevede la purificazione istone da colture di cellule o tessuti, istone derivatizzazione e la digestione, analisi MS utilizzando nano-flusso cromatografia liquida e le istruzioni per l'analisi dei dati. Il protocollo è stato progettato per il completamento entro 2 - 3 giorni.

Flusso di lavoro completo per l&#39;analisi dell&#39;istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all&#39;analisi dei dati

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Questo protocollo si concentra sulla preparazione della cromatina da tessuti congelati a scatto ed è adatto per l'immunoprecipitazione della cromatina reticolante (X-ChIP) seguita da analisi quantitative PCR (X-ChIP-qPCR) o approcci di sequenziamento di nuova generazione (X-ChIP-seq).

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Quantificazione a livello globale delle modifiche post-traduzionali degli istoni in un modello di coltura cellulare 3D del tessuto epatico (Video) | JoVE Journal

Quantificazione a livello globale delle modifiche post-traduzionali degli istoni in un modello di coltura cellulare 3D del tessuto epatico

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