Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto

Il Digital Spatial Profiling, o DSP, offre un metodo efficiente per la quantificazione delle proteine stratificate spazialmente. La sua implementazione ci consente di caratterizzare l'espressione proteica attraverso regioni distinte di un tumore e del microambiente. Una caratteristica chiave del DSP è la sua capacità di multiplexing, che consente l'elaborazione dei dati ad alto throughput.

La capacità di definire regioni di interesse personalizzate fornisce inoltre una dimensione spaziale all'analisi dei dati. Il DSP può essere applicato a qualsiasi campione in cui la quantificazione spaziale della proteina o l'espressione dell'RNA possono aiutare a chiarire un processo patologico o fisiologico. Ciò è particolarmente rilevante in oncologia, dove la variabilità del target regionale può essere correlata alla crescita maligna o all'invasione.

A dimostrare la procedura saranno Scott Palisoul, un istotecnologo, e Rachael Barney, un tecnologo genomico. Per preparare i vetrini, iniziare prendendo diversi nuclei di due millimetri da ogni biopsia e mettendoli in un singolo blocco di microarray tissutale. Tagliare sezioni da quattro micron dal blocco e montarle su vetrini.

Posizionare ogni diapositiva all'interno della guarnizione del portaslitta e incubarla a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Nel sistema IHC semiautomatico, riempire il contenitore nella posizione uno con 150 microlitri di tampone di lavaggio per vetrino, più cinque millilitri di volume morto, e lasciare il coperchio aperto. Riempire la stessa quantità di soluzione bloccante nel contenitore nella posizione due.

Caricare il vassoio del contenitore del reagente sulla macchina. Selezionare Processo IHC, seguito da Blocco nome soluzione nella casella a discesa del campo Marcatore. Una volta terminato per tutte le diapositive, fare clic su Chiudi.

Quindi fare clic su Stampa etichette e selezionare Tutte le etichette diapositiva non ancora stampate e fare clic su Stampa. Applicare etichette sulla parte superiore delle diapositive. Caricare le diapositive sul vassoio di scorrimento, assicurandosi che il campione e l'etichetta siano rivolti verso l'alto.

Premere il pulsante LED per abbassare il vassoio e consentire allo strumento di iniziare la scansione e il riconoscimento delle diapositive. Fare clic sul pulsante Start per iniziare l'esperimento. Al termine della corsa, premere il pulsante LED quando lampeggia in verde.

Rimuovere il vassoio dallo strumento e sollevare con attenzione le piastrelle di copertura da ogni vetrino. Posizionare i vetrini nella soluzione salina tamponata con fosfato 1X. Rimuovere il tampone in eccesso e delineare ogni sezione di tessuto con una penna idrofobica per creare una barriera idrofobica.

Realizzare una soluzione oligo di anticorpi PC aggiungendo otto microlitri di ciascun anticorpo per vetrino e utilizzando Buffer W per raggiungere un volume finale di 200 microlitri. Quindi applicare la soluzione oligo di anticorpi PC ai vetrini e incubare i vetrini durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, posizionare i vetrini in un vassoio umidificato e lavare tre volte per 10 minuti in 1X TBST.

Post-fix in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da lavaggio due volte per cinque minuti in 1X TBST. Aggiungere la macchia nucleare SYTO 13 per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare due volte con 1X TBST. Passare il mouse sulla raccolta dati nel Centro di controllo e selezionare Nuovo o Continua esecuzione.

Posizionare la diapositiva nel portavetrini con l'etichetta rivolta verso l'utente. Abbassare il morsetto del vassoio di scorrimento, assicurandosi che il tessuto sia visibile nella finestra allungata. Aggiungere sei millilitri di Buffer S.Seguire le istruzioni nel Centro di controllo.

Ingrandisci tra assi diversi con i cursori x e y per delineare un'area per la scansione. Selezionare Scansione e consentire l'esecuzione della scansione fino a quando non è stata creata l'immagine dell'intera area di destinazione definita. Genera un'immagine 20 volte.

Definisci i ROI selezionando tre ROI circolari di uguali dimensioni di un diametro di 250 micrometri per ciascun nucleo di tessuto. Approvare i ROI facendo clic sul pulsante Esci dall'area di lavoro di scansione. Quindi attendere che la luce UV scindono gli oligo dagli anticorpi.

Dopo aver completato il processo dello strumento di pulizia, selezionare Nuova raccolta dati per continuare con le diapositive o la piastra corrente. Aprire la finestra della piastra finalizzata facendo doppio clic sull'area dell'icona Piatto. Immettere il numero di lotto del codice di ibridazione e fare clic su Aggiorna.

Quindi fare clic su Finalizza. Staccare il portavetrini e la piastra di raccolta seguendo le istruzioni. Conservare i vetrini in TBST o coprirli con un mezzo acquoso e un vetrino di copertura per la conservazione a lungo termine.

Sigillare le piastre utilizzando una guarnizione permeabile e asciugare le aspirate a 65 gradi Celsius in un termociclatore con la parte superiore aperta. Aggiungere sette microlitri di acqua trattata con dietil pirocarbonato e mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi centrifugare rapidamente.

Preparare la miscela tampone della sonda scegliendo le equazioni appropriate della sonda R e della sonda U applicando l'equazione come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 84 microlitri di miscela tampone sonda a ciascun pacchetto di codici di ibridazione. In una nuova piastra di ibridazione a 96 pozzetti, aggiungere otto microlitri di ciascun master mix di codice di ibridazione in tutti i 12 pozzetti della fila indicata.

Trasferire sette microlitri dalla piastra di raccolta DSP al pozzetto corrispondente nella piastra di ibridazione. Sigillare a caldo, girare la piastra e incubarla durante la notte a 67 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raffreddare la piastra sul ghiaccio ed eseguire un rapido giro.

Raggruppare i prodotti di ibridazione da ciascun pozzetto in un tubo a striscia, pipettando delicatamente ogni pozzetto cinque volte. Ruotare verso il basso e caricare i tubi a nastro nel sistema di analisi. Sullo strumento DSP, salvare il file CDF su un'unità USB e trasferire i dati all'analizzatore digitale.

Sullo schermo, premere Avvia elaborazione. Selezionare Alta sensibilità seguita da Avanti. Premere Seleziona tutto per il numero di pozzi con campioni, quindi Fine, seguito da Avanti nella notifica e-mail.

Quindi fare clic su Start. Una volta terminata la stazione di preparazione, sigillare la cartuccia e trasferirla all'analizzatore digitale. Premere Inizia conteggio.

Selezionare Posizione stage. Premere Carica file CDF esistente e selezionare il file caricato in precedenza. Premere Fine.

Selezionare nuovamente Posizione stage, premere Fine, quindi avviare per eseguire il programma. Salvare il file ZIP dei file di conversione del conteggio dei reporter dal sistema di analisi a un'unità USB. Inserire l'unità nella macchina DSP.

Nel Centro di controllo DSP, passare il puntatore del mouse su Raccolta dati, quindi fare clic su Carica account. Selezionare il file ZIP pertinente. Fare clic su Record nel Centro di controllo DSP.

Per visualizzare le scansioni nella coda, selezionare Aggiungi scansioni selezionate alla coda, quindi Coda di analisi personali. Selezionare Nuovo studio dalla coda passando il puntatore del mouse sull'opzione Analisi dati nel Centro di controllo. L'esperimento DSP è stato eseguito su campioni di glioblastoma e i risultati sono stati visualizzati come una mappa di calore.

Le righe rappresentano i bersagli proteici e ogni colonna corrisponde a una regione di interesse. Il livello di espressione è rappresentato da una gamma di colori che varia dal blu, che mostra bassa espressione, al rosso, che denota un'espressione elevata. La variabilità del colore all'interno di una riga riflette l'eterogeneità proteica regionale e suggerisce una possibile associazione spaziale con l'espressione differenziale delle proteine.

In questo esperimento, S100 e CD-56 erano universalmente alti, perché sono marcatori neurali. I marcatori con la maggiore variabilità includono B7-H3, KI-67, CD-44 e fibronectina, che sono noti per essere associati alla proliferazione, alla migrazione e alle metastasi del tumore. Da una vasta gamma di target candidati, DSP può identificare quelli che presentano variazioni regionali significative.

Ciò pone le basi per studiare i fattori associati alla variabilità e la loro rilevanza per la malattia.