Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto
September 13th, 2022
La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L'elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l'espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all'invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.
Il Digital Spatial Profiling, o DSP, offre un metodo efficiente per la quantificazione delle proteine stratificate spazialmente. La sua implementazione ci consente di caratterizzare l'espressione proteica attraverso regioni distinte di un tumore e del microambiente. Una caratteristica chiave del DSP è la sua capacità di multiplexing, che consente l'elaborazione dei dati ad alto throughput.
La capacità di definire regioni di interesse personalizzate fornisce inoltre una dimensione spaziale all'analisi dei dati. Il DSP può essere applicato a qualsiasi campione in cui la quantificazione spaziale della proteina o l'espressione dell'RNA possono aiutare a chiarire un processo patologico o fisiologico. Ciò è particolarmente rilevante in oncologia, dove la variabilità del target regionale può essere correlata alla crescita maligna o all'invasione.
A dimostrare la procedura saranno Scott Palisoul, un istotecnologo, e Rachael Barney, un tecnologo genomico. Per preparare i vetrini, iniziare prendendo diversi nuclei di due millimetri da ogni biopsia e mettendoli in un singolo blocco di microarray tissutale. Tagliare sezioni da quattro micron dal blocco e montarle su vetrini.
Posizionare ogni diapositiva all'interno della guarnizione del portaslitta e incubarla a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Nel sistema IHC semiautomatico, riempire il contenitore nella posizione uno con 150 microlitri di tampone di lavaggio per vetrino, più cinque millilitri di volume morto, e lasciare il coperchio aperto. Riempire la stessa quantità di soluzione bloccante nel contenitore nella posizione due.
Caricare il vassoio del contenitore del reagente sulla macchina. Selezionare Processo IHC, seguito da Blocco nome soluzione nella casella a discesa del campo Marcatore. Una volta terminato per tutte le diapositive, fare clic su Chiudi.
Quindi fare clic su Stampa etichette e selezionare Tutte le etichette diapositiva non ancora stampate e fare clic su Stampa. Applicare etichette sulla parte superiore delle diapositive. Caricare le diapositive sul vassoio di scorrimento, assicurandosi che il campione e l'etichetta siano rivolti verso l'alto.
Premere il pulsante LED per abbassare il vassoio e consentire allo strumento di iniziare la scansione e il riconoscimento delle diapositive. Fare clic sul pulsante Start per iniziare l'esperimento. Al termine della corsa, premere il pulsante LED quando lampeggia in verde.
Rimuovere il vassoio dallo strumento e sollevare con attenzione le piastrelle di copertura da ogni vetrino. Posizionare i vetrini nella soluzione salina tamponata con fosfato 1X. Rimuovere il tampone in eccesso e delineare ogni sezione di tessuto con una penna idrofobica per creare una barriera idrofobica.
Realizzare una soluzione oligo di anticorpi PC aggiungendo otto microlitri di ciascun anticorpo per vetrino e utilizzando Buffer W per raggiungere un volume finale di 200 microlitri. Quindi applicare la soluzione oligo di anticorpi PC ai vetrini e incubare i vetrini durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, posizionare i vetrini in un vassoio umidificato e lavare tre volte per 10 minuti in 1X TBST.
Post-fix in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da lavaggio due volte per cinque minuti in 1X TBST. Aggiungere la macchia nucleare SYTO 13 per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare due volte con 1X TBST. Passare il mouse sulla raccolta dati nel Centro di controllo e selezionare Nuovo o Continua esecuzione.
Posizionare la diapositiva nel portavetrini con l'etichetta rivolta verso l'utente. Abbassare il morsetto del vassoio di scorrimento, assicurandosi che il tessuto sia visibile nella finestra allungata. Aggiungere sei millilitri di Buffer S.Seguire le istruzioni nel Centro di controllo.
Ingrandisci tra assi diversi con i cursori x e y per delineare un'area per la scansione. Selezionare Scansione e consentire l'esecuzione della scansione fino a quando non è stata creata l'immagine dell'intera area di destinazione definita. Genera un'immagine 20 volte.
Definisci i ROI selezionando tre ROI circolari di uguali dimensioni di un diametro di 250 micrometri per ciascun nucleo di tessuto. Approvare i ROI facendo clic sul pulsante Esci dall'area di lavoro di scansione. Quindi attendere che la luce UV scindono gli oligo dagli anticorpi.
Dopo aver completato il processo dello strumento di pulizia, selezionare Nuova raccolta dati per continuare con le diapositive o la piastra corrente. Aprire la finestra della piastra finalizzata facendo doppio clic sull'area dell'icona Piatto. Immettere il numero di lotto del codice di ibridazione e fare clic su Aggiorna.
Quindi fare clic su Finalizza. Staccare il portavetrini e la piastra di raccolta seguendo le istruzioni. Conservare i vetrini in TBST o coprirli con un mezzo acquoso e un vetrino di copertura per la conservazione a lungo termine.
Sigillare le piastre utilizzando una guarnizione permeabile e asciugare le aspirate a 65 gradi Celsius in un termociclatore con la parte superiore aperta. Aggiungere sette microlitri di acqua trattata con dietil pirocarbonato e mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi centrifugare rapidamente.
Preparare la miscela tampone della sonda scegliendo le equazioni appropriate della sonda R e della sonda U applicando l'equazione come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 84 microlitri di miscela tampone sonda a ciascun pacchetto di codici di ibridazione. In una nuova piastra di ibridazione a 96 pozzetti, aggiungere otto microlitri di ciascun master mix di codice di ibridazione in tutti i 12 pozzetti della fila indicata.
Trasferire sette microlitri dalla piastra di raccolta DSP al pozzetto corrispondente nella piastra di ibridazione. Sigillare a caldo, girare la piastra e incubarla durante la notte a 67 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raffreddare la piastra sul ghiaccio ed eseguire un rapido giro.
Raggruppare i prodotti di ibridazione da ciascun pozzetto in un tubo a striscia, pipettando delicatamente ogni pozzetto cinque volte. Ruotare verso il basso e caricare i tubi a nastro nel sistema di analisi. Sullo strumento DSP, salvare il file CDF su un'unità USB e trasferire i dati all'analizzatore digitale.
Sullo schermo, premere Avvia elaborazione. Selezionare Alta sensibilità seguita da Avanti. Premere Seleziona tutto per il numero di pozzi con campioni, quindi Fine, seguito da Avanti nella notifica e-mail.
Quindi fare clic su Start. Una volta terminata la stazione di preparazione, sigillare la cartuccia e trasferirla all'analizzatore digitale. Premere Inizia conteggio.
Selezionare Posizione stage. Premere Carica file CDF esistente e selezionare il file caricato in precedenza. Premere Fine.
Selezionare nuovamente Posizione stage, premere Fine, quindi avviare per eseguire il programma. Salvare il file ZIP dei file di conversione del conteggio dei reporter dal sistema di analisi a un'unità USB. Inserire l'unità nella macchina DSP.
Nel Centro di controllo DSP, passare il puntatore del mouse su Raccolta dati, quindi fare clic su Carica account. Selezionare il file ZIP pertinente. Fare clic su Record nel Centro di controllo DSP.
Per visualizzare le scansioni nella coda, selezionare Aggiungi scansioni selezionate alla coda, quindi Coda di analisi personali. Selezionare Nuovo studio dalla coda passando il puntatore del mouse sull'opzione Analisi dati nel Centro di controllo. L'esperimento DSP è stato eseguito su campioni di glioblastoma e i risultati sono stati visualizzati come una mappa di calore.
Le righe rappresentano i bersagli proteici e ogni colonna corrisponde a una regione di interesse. Il livello di espressione è rappresentato da una gamma di colori che varia dal blu, che mostra bassa espressione, al rosso, che denota un'espressione elevata. La variabilità del colore all'interno di una riga riflette l'eterogeneità proteica regionale e suggerisce una possibile associazione spaziale con l'espressione differenziale delle proteine.
In questo esperimento, S100 e CD-56 erano universalmente alti, perché sono marcatori neurali. I marcatori con la maggiore variabilità includono B7-H3, KI-67, CD-44 e fibronectina, che sono noti per essere associati alla proliferazione, alla migrazione e alle metastasi del tumore. Da una vasta gamma di target candidati, DSP può identificare quelli che presentano variazioni regionali significative.
Ciò pone le basi per studiare i fattori associati alla variabilità e la loro rilevanza per la malattia.
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Panoramica
Il Digital Spatial Profiling (DSP) è una tecnica potente per quantificare l'espressione proteica in regioni distinte dei tumori e dei loro microambienti. Questo metodo migliora la nostra comprensione del ruolo della disregolazione proteomica nei gliomi infiltranti diffusamente, in particolare per quanto riguarda la loro invasione e migrazione.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Oncologia
- Proteomica
Conoscenze di base
- La disregolazione proteomica è cruciale nella diffusione dei gliomi.
- Molte proteine coinvolte nell'invasione dei gliomi rimangono non identificate.
- DSP consente un'analisi ad alto rendimento dell'espressione proteica.
- Comprendere la variabilità proteica regionale può informare le strategie di trattamento.
Obiettivo dello studio
- Caratterizzare l'espressione proteica differenziale nei gliomi.
- Identificare proteine candidate che contribuiscono all'invasione dei gliomi.
- Utilizzare DSP per un'efficiente quantificazione spaziale delle proteine.
Metodi utilizzati
- Digital Spatial Profiling (DSP) per la quantificazione delle proteine.
- Capacità di multiplexing per l'elaborazione dei dati ad alto rendimento.
- Regioni di interesse personalizzabili per l'analisi spaziale.
- Applicazione di DSP a campioni tumorali per approfondimenti patologici.
Risultati principali
- DSP caratterizza efficacemente l'espressione proteica attraverso le regioni tumorali.
- Le proteine identificate possono correlarsi con l'invasione e la crescita dei gliomi.
- L'elaborazione ad alto rendimento migliora l'efficienza dell'analisi dei dati.
- La quantificazione spaziale fornisce informazioni sui microambienti tumorali.
Conclusioni
- DSP è uno strumento prezioso per studiare la biologia dei gliomi.
- Comprendere i modelli di espressione proteica può aiutare nella ricerca sui gliomi.
- L'ulteriore identificazione di proteine può portare a nuovi obiettivi terapeutici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Digital Spatial Profiling (DSP) enables high-resolution, multiplexed quantification of protein expression across spatially distinct tumor and microenvironment regions in adult-type diffusely infiltrating glioma. This capability addresses a critical gap in spatial proteomic stratification, supporting mechanistic de-risking and target validation at the discovery and translational interface. DSP's spatially resolved data inform predictive confidence for target selection and portfolio triage in neuro-oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of spatially variable protein targets implicated in tumor proliferation and invasion.
- Supports functional target validation by mapping protein heterogeneity within tumor and microenvironment compartments.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing region-specific expression patterns of candidate biomarkers.
- Improves predictive confidence for prioritizing targets with spatially restricted or enriched expression.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue microarrays for downstream multiplexed analysis workflows.
- Standardizes quantitative spatial proteomic outputs for reproducible assay development.
- Enables high-throughput screening of protein panels across defined regions of interest (ROIs).
- Supports reliable evaluation of compound effects on spatially distinct tumor microenvironments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomic data with disease-relevant regions, informing translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking protein heterogeneity to tumor biology.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on spatially resolved target expression profiles.
- De-risks translational efforts by clarifying microenvironmental contributions to tumor progression.
Pipeline & Workflow Integration
DSP integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatially resolved hypothesis testing, target validation, and biomarker alignment in glioma research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through spatial mapping of protein expression.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and cross-condition comparisons.
- Analytics: Provides multiplexed measurements and heatmap visualizations to assess regional protein heterogeneity.
- Translational Research: Connects spatial proteomic signatures to disease-relevant biology and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for spatial proteomic analysis across diverse tumor models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes spatial proteomic workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of spatially validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in spatial proteomics, tissue microarray construction, and fluorescence microscopy.
- Demands access to DSP instrumentation, multiplexed antibody panels, and advanced data analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of ROI selection and data interpretation protocols.
- Adaptation may be needed for different tumor types or tissue architectures.
- Throughput and panel size may be limited by available reagents and instrument capacity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:08
Preparation of Slides and Semi‐Automated IHC System
2:50
Antibody Incubation and Nuclei Staining
3:39
Fluorescence Visualization, ROI Identification, and UV Photocleavage
5:17
Protein Readout and Data Analysis
7:51
Results: Digital Spatial Profiling on Glioblastoma Samples
8:47
Conclusion
