Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine

Questo protocollo SiMPull consente una quantificazione della fosforilazione delle proteine migliorando le condizioni di etichettatura e fissazione degli anticorpi, riducendo l'autofluorescenza presente nel canale verde e fornendo robusti algoritmi di analisi a singola molecola. Il vantaggio principale di SiMPull è che ci permette di interrogare lo stato di fosforilazione delle singole proteine intatte. Con questo metodo, possiamo ottenere nuove informazioni che non sono accessibili attraverso tecniche tradizionali, come il western blotting e l'analisi delle specifiche di massa.

Abbiamo un team di ricercatori per aiutare a dimostrare il protocollo. In primo luogo, Julian Rojo mostrerà come incidere il piranha sul vetro di copertura. Rachel Grattan mostrerà quindi i passaggi per il rivestimento del vetro di copertura.

Ed Elizabeth Bailey mostrerà come disegnare l'array e i campioni di immagine. Per iniziare, il piranha incidere il coperchio scivola agitando delicatamente il becher di reazione ogni cinque minuti per 30 minuti. Neutralizzato la soluzione di piranha aggiungendo gradualmente una base debole.

Con un'asta di vetro, trasferire il coperchio inciso in un imbuto Buchner e risciacquare per cinque minuti in acqua doppia distillata. Quindi posizionare il coperchio scivola in un barattolo di vetro Coplin e coprire con metanolo. Sigillare il coperchio con un film sigillante e fare il bagno sonicate per 10 minuti.

Dopo la sonicazione, svuotare il metanolo in una bottiglia di vetro. Ripeti questo passaggio con acetone. Risciacquare il coperchio scivola tre volte con acqua doppia distillata nel barattolo Coplin.

Scolare l'acqua dagli scivoli di copertura e asciugarli agitando attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen. Posizionare gli slip di copertura in un barattolo coplin asciutto. Quindi aggiungere la soluzione di ammino-silano al barattolo Coplin per eseguire la silanizzazione dell'amminoscivolo di copertura.

Coprire e applicare una pellicola sigillante per proteggere dalla luce. Risciacquare il coperchio scivola con metanolo e scartare la soluzione utilizzata. Ancora una volta, risciacquare il coperchio scivola tre volte con acqua doppia distillata per due minuti ciascuno.

Tamponare l'umidità in eccesso e asciugare completamente l'aria per 10 minuti. Quindi, disegna l'array di griglie con una penna barriera idrofoba. Contrassegnare un identificatore sulla slitta di copertina per identificare l'orientamento corretto.

Dopo che l'inchiostro si asciuga, posizionare il coperchio scivola in una camera umidificata. Sospendere 153 milligrammi di mPEG e 3,9 milligrammi di biotina-PEG in 609 microlitri di bicarbonato di sodio 10 millimolari e vortice. Centrifugare a 10.000 x g da un minuto a temperatura ambiente per rimuovere le bolle.

Applicare da 10 a 15 microlitri di questa soluzione per quadrato per coprire completamente l'array senza traboccare. Conservare il coperchio scivola nella camera di umidità al buio per tre o quattro ore a temperatura ambiente. Quindi lavare il coperchio scivola immergendoli per 10 secondi in sequenza in tre bicchieri riempiti con acqua doppia distillata.

Rimuovere tutta l'umidità dagli scivoli di copertura utilizzando gas azoto. Conservare il coperchio scivola da una parte all'altra in un tubo conico da 50 millilitri riempito di azoto e sigillare con un film sigillante. Avvolgere il tubo con pellicola sigillante e posizionarlo a meno 20 gradi Celsius.

Rimuovere gli array funzionalizzati biotina-PEG dal congelatore ed equilibrarli a temperatura ambiente. Posizionare il coperchio con l'array rivolto verso l'alto su un piatto di coltura tissutale da 100 millimetri rivestito con pellicola sigillante. Incubare ogni quadrato dell'array con 10 milligrammi per millilitro di boroidruro di sodio in PBS per quattro minuti a temperatura ambiente.

Lavare tre volte con PBS. Successivamente incubare con 0,2 milligrammi per millilitro di NeutrAvidin in T50 per cinque minuti, seguito da lavaggio tre volte con T50 BSA. Ripetere l'incubazione con due microgrammi per millilitro di anticorpo specifico poi biotinilato in T50 BSA per 10 minuti, seguito da lavaggio.

In primo luogo, scongelare mescolare il lisato mediante pipettaggio. Diluire un microlitro del lisato in 100 microlitri di PPI T50 BSA ghiacciato. Incubare il lisato sull'array per 10 minuti, seguito dal lavaggio.

Preparare l'anticorpo anti-fostirosina coniugato AF647 in T50 BSA PPI ghiacciato e incubare sull'array per un'ora. Deposita una goccia di petrolio sull'obiettivo. Posiziona la nanogriglia sul palco per l'imaging.

Utilizzando la luce bianca trasmessa, concentrarsi sul modello di griglia. Acquisire una serie di 20 immagini della griglia, assicurarsi che i pixel non siano saturi e salvare la serie di immagini come fiduciale. Sfoca la nanogriglia per creare un modello arioso, acquisire una serie di 20 immagini per le calibrazioni del guadagno e salvare l'immagine come guadagno.

Quindi acquisire una serie di 20 immagini per l'offset della fotocamera bloccando tutta la luce alla fotocamera e salvare lo sfondo delle immagini. Per acquisire immagini semplici, in primo luogo, pulire l'obiettivo olio e depositare olio aggiuntivo sull'obiettivo. Fissare l'array di slip di copertura sul palco del microscopio.

Acquisire immagini per ciascun campione, prima nel canale rosso lontano, seguito da fluorofori a lunghezza d'onda inferiore. Controllare il livello del buffer ogni 30-45 minuti e ricostituire se necessario. Utilizzando questa tecnica, EGFR-GFP è stato catturato da lisati proteici totali.

L'autofluorescenza dell'inchiostro idrofobo è stata utilizzata come guida per trovare il piano focale del campione. Le immagini di dati grezzi sono state acquisite con canali spettrali separati sul chip della fotocamera. Una sovrapposizione dei canali verde e rosso lontano è stata ulteriormente esaminata per l'acquisizione dei dati.

La registrazione del canale è stata eseguita su immagini acquisite dalla nanogriglia. Una sovrapposizione di immagini fiduciarie mostrava una registrazione incompleta. L'allineamento è stato effettuato applicando una trasformata media ponderata locale sulle coordinate dei canali rosso e verde, che è stata utilizzata per registrare i dati SiMPull successivi.

Sono stati inscatolati singoli emettitori sopra il conteggio dei fotoni di sfondo dai canali GFP e AF647 ed è stata eseguita la localizzazione gaussiana per identificare le posizioni. La colocalizzazione di EGFR-GFP in un F647 è stata fatta per identificare i recettori fosforilati. E la percentuale di colocalizzazione è stata utilizzata per determinare la frazione di recettori fosforilati.

I rilevamenti di fondo sono stati ridotti quando il vetro inciso piranha è stato trattato con boroidruro di sodio. È stato osservato un robusto legame di EGFR-GFP nel lisato con un legame PY99-AF647 non specifico minimo, mostrando una ritenzione della funzionalizzazione superficiale utilizzando questa tecnica. SiMPull fornisce informazioni sulla fosforilazione delle proteine e può rispondere a una vasta gamma di domande di auto-segnalazione.

Questo può migliorare la nostra comprensione della segnalazione sia negli stati normali che in quelli patologici.