Name: Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Scopri il protocollo SiMPull per quantificare la fosforilazione proteica a livello di singola molecola. Questo metodo migliora l'etichettatura anticorpale e riduce l'autofluorescenza per un'analisi accurata.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 e R01CA248166 to DSL. EMB è stato supportato attraverso il programma ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) e JAR dal programma UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Riconosciamo con gratitudine l'utilizzo della risorsa condivisa di microscopia a fluorescenza del Comprehensive Cancer Center dell'Università del New Mexico, supportata da NIH P30CA118100. Vogliamo ringraziare i dottori Ankur Jain e Taekijip Ha, il cui sviluppo originale di SiMPull ha ispirato questo lavoro. Indirizzo attuale di ES-C: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda

<ol><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li>
<li>Coba, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+drive+combinatorial+multistate+postsynaptic+density+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks.</a> Science Signaling. 2 (68), (2009).</li>
<li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li>
<li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li>
<li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).</li>
<li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARQUIS%3A+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).</li>
<li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+lenses+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li>
<li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendriks%2C+CLL+%22Dipimage%3A+a+scientific+image+processing+toolbox+for+MATLAB%22">Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB</a>. , (1999).</li>
<li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013).</li>
<li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li>
<li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+single-cell+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per consentire misurazioni quantitative della fosforilazione del recettore a livello di singola proteina. Sono state sviluppate diverse modifiche semplici ma importanti al protocollo SiMPull che hanno migliorato l'affidabilità della misurazione per il rilevamento della fosfo-tirosina, compresa la riduzione dell'autofluorescenza con il trattamento con NaBH4 e il postfissaggio del campione per prevenire la dissociazione degli anticorpi. L'utilizzo della maschera a ...

La segnalazione associata alla membrana è sintonizzata da una combinazione di attivazione del recettore di membrana indotta dal ligando e reclutamento di proteine accessorie a valle che propagano il segnale. La fosforilazione delle tirosinine chiave nelle code citoplasmatiche dei recettori è fondamentale per avviare la formazione di complessi di segnalazione, o signalosomi 1,2. Pertanto, una domanda importante in biologia è come vengono creati e mantenuti i modelli di fosforilazione per reclutare partner di segnalazione e dettare i risultati cellulari. Ciò include la comprensione dell'eterogeneità della fosforilazione del recettore, sia in abbondanza che nei modelli specifici di fosfotirosina che possono fornire un mezzo per manipolare le uscite di segnalazione dettando la composizione del signalosoma 3,4,5,6,7. Tuttavia, ci sono limitazioni nei metodi attuali per interrogare la fosforilazione delle proteine. L'analisi Western blot è eccellente per descrivere le tendenze della fosforilazione delle proteine, ma è semi-quantitativa8 e non fornisce informazioni sull'eterogeneità del sistema perché migliaia o milioni di recettori sono mediati insieme. Mentre i western blot consentono di sondare un campione utilizzando anticorpi fosfo-specifici contro tirosine specifiche, non possono fornire informazioni sui modelli di fosforilazione multisito all'interno della stessa proteina. La fosfoproteomica quantitativa riporta l'abbondanza di fosfotirosina, ma ci sono limitazioni al rilevamento della fosforilazione multisito, poiché i residui di interesse devono essere localizzati all'interno dello stesso peptide (tipicamente 7-35 amminoacidi) generato dalla digestione enzimatica 9,10,11.
Per superare i limiti sopra menzionati, il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato adattato per quantificare gli stati di fosforilazione dei recettori intatti a livello di singola molecola. SiMPull è stato dimostrato per la prima volta come un potente strumento per interrogare complessi macromolecolari da Jain et al.12,13. In SiMPull, i complessi macromolecolari sono stati immunoprecipitati (IP) su coverslip di vetro funzionalizzati con anticorpi e quindi analizzati attraverso la microscopia a singola molecola per il numero di subunità proteiche e co-IP con componenti complessi12. Una modifica di Kim et al.14, chiamata SiMBlot, è stata la prima a utilizzare una variazione di SiMPull per analizzare la fosforilazione delle proteine denaturate. Il protocollo SiMBlot si basa sulla cattura di proteine di superficie cellulari biotinilate utilizzando coverslip rivestiti con NeutrAvidin, che vengono quindi sondati per la fosforilazione con l'etichettatura degli anticorpi fosfo-specifici14. Nonostante questi progressi, erano necessari miglioramenti per rendere la quantificazione della modificazione post-traduzionale più robusta e applicabile a una gamma più ampia di proteine.
Il presente protocollo descrive un approccio SiMPull ottimizzato che è stato utilizzato per quantificare i modelli di fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico intatto (EGFR) in risposta a una serie di condizioni del ligando e mutazioni oncogeniche15. Mentre questo lavoro si concentra sull'EGFR, questo approccio può essere applicato a qualsiasi recettore di membrana e proteine citosoliche di interesse (POI), per le quali sono disponibili anticorpi di qualità. Il protocollo include passaggi per ridurre l'autofluorescenza del campione, un design dell'array di campioni che richiede un volume minimo del campione con preparazione simultanea fino a 20 campioni e l'ottimizzazione delle condizioni di etichettatura e fissazione degli anticorpi. Sono stati sviluppati algoritmi di analisi dei dati per il rilevamento e la quantificazione di proteine fosforilate a singola molecola.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 Tampone</td></tr><tr><td>100 mm Piatto per coltura tissutale</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>Conservazione di piranha in vetro/array 15</td></tr><tr><td>mL provetta</td><td></td><td></td><td></td>conica</tr><tr><td>16% Paraformaldeide acquosa Scienze</td> della <td>microscopia elettronica</td><td>in soluzione 15710</td><td></td></tr><tr><td>Pericolosa provetta</td><td></td><td></td> conica da 50 mL <td>Conservazione in vetro funzionalizzato / riutilizzo KOH</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mM Componente</td><td>tampone per lisi</td>NaCl <td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm Piatto per coltura tissutale</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>8% di glutaraldeide Soluzione acquosa</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>16020</td><td>Acetone pericoloso</td></tr><tr><td>(C3H6O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td>Pericoloso</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante senza animali</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>EGFR anti-umano (dominio esterno) &ndash; Biotina</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Bath-sonicator</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA Kit per il dosaggio delle proteine</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5.000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>sierica bovinaGold Biotechnology</td><td>A-420-1</td><td>Componente tampone di Tyrode</td></tr><tr><td>Imbuto</td><td></td><td></td><td></td>Buchner</tr><tr><td>Bruciatore</td><td></td><td></td><td></td>Bunsen</tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Raschietto cellulare componente tampone di Tyrode</td></tr><tr><td></td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>Pallone filtrante conico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo Coplin</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Contacellule automatizzato Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 24 x 60 #1.5</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera emCCD</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino, Optima</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td>Calore Inattivato</td></tr><tr><td>Fusion 360 Software</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disolfato</td><td>Caisson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale (CH3COOH)</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>Pericoloso</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche in vetro Bacchetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>di<td>agitazione in vetro</td></tr><tr><td>Glucosio (D-(+)-glucosio)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>Tyrode's Buffer</td></tr><tr><td>Component Halt Phosphotasi and Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>Lysis Buffer Component</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>TyrodeComponente tampone di VWR</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td>Perossido di idrogeno pericoloso</td></tr><tr><td>(H2O2) (3%)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (H2O2) (30%)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 ( NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>Componente tampone di lisi</td></tr><tr><td>ImmEdge Penna barriera idrofobica</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F olio da immersione</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>linea</td><td></td><td></td><td></td>di vuoto interna</tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnessio esaidrato (MgCl2-6H2O)</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox e Statistics and Machine Learning Toolbox</td></tr><tr><td>Metanolo (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>Acqua</td></tr> <tr><td></td><td>pericolosa Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di etichettatura degli anticorpi coloranti Mix-n-Stain CF</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>Kit di coniugazione suggerito</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-succinimidil valerato, MW 5.000</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-amminoetil)-3-amminopropiltrimetossisilano</td><td>UCT United Chemical</td><td>A0700</td><td></td></tr><tr><td>Hazardous Nanogrid</td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotina Proteina legante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Azoto (gas compresso)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPU NVIDIA con CUDA</td><td></td><td></td><td>Cerca la compatibilità con https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus iX71</td> Pellicola sigillante <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>The Lab Depot</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 Piastra riscaldante analogica</td><td>Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Recettore fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td> mAb di topo <td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Millipore Sigma</td> Componente tampone <td>di 529552</td><td>Tyrode</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td><td>Filamento</td></tr><tr><td>PLA Premium pericoloso, diametro 1,75 mm</td><td>Raise 3D</td><td>PMS:2035U/RAL:3028</td><td>Intervallo di temperatura di stampa: 205-235 ... Stampante</td></tr><tr><td>3D C Pro2</td><td>Becher</td> Raise 3D <td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 1 L</td> Flaconi di stoccaggio PYREX 100 mL Corning 1395-100 CH3OH/C3H6O riutilizza Becher Pyrex 250 mL Becher Pyrex 4 L Quad-view Immagine <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Splitter</td><td>Fotometrico</td><td>Modello QV2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>RevCount Contatori di celle, vetrini per conteggio celle EVE</td><td>VWR</td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Filtri di emissione Semrock: blu (445/45 nm), verde (525/45 nm), rosso (600/37 nm), rosso lontano (685/40 nm)</td><td>Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td>Controllore sierologico per pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> sierologiche<td>smite pacchetto per l'analisi di singole molecole</td><td>https://github.com/LidkeLab/smite.git</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio pericoloso (NaBH4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>452874</td><td>Tyrode' s Componente tampone</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9625</td><td>Attivazione mediante cicli successivi di calore e pH</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato di sodio (Na3VO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico pericoloso (H2SO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere TetraSpeck</td> pericolose <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>perle multifluorescenti</td></tr> base <tr><td>Tris (Trizma)</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypan colorazione blu, 0,4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

La fosforilazione è una modifica post-traduzionale necessaria che regola la funzione proteica e dirige i risultati della segnalazione cellulare. Gli attuali metodi per misurare la fosforilazione delle proteine non possono preservare l'eterogeneità della fosforilazione tra le singole proteine. Il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato sviluppato per studiare la composizione di complessi macromolecolari tramite immunoprecipitazione di proteine su un coverslip di vetro seguito da imaging a singola molecola. La tecnica attuale è un adattamento di SiMPull che fornisce una robusta quantificazione dello stato di fosforilazione dei recettori di membrana a lunghezza intera a livello di singola molecola. L'imaging di migliaia di singoli recettori in questo modo consente di quantificare i modelli di fosforilazione delle proteine. Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura SiMPull ottimizzata, dalla preparazione del campione all'imaging. L'ottimizzazione della preparazione del vetro e dei protocolli di fissazione degli anticorpi migliora ulteriormente la qualità dei dati. L'attuale protocollo fornisce il codice per l'analisi dei dati a singola molecola che calcola la frazione di recettori fosforilati all'interno di un campione. Mentre questo lavoro si concentra sulla fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il protocollo può essere generalizzato ad altri recettori di membrana e molecole di segnalazione citosolica.

Un cartone animato raffigurante il processo SiMPull è mostrato nella Figura 1A. I coverslip sono funzionalizzati utilizzando NeutrAvidin come ancoraggio per gli anticorpi anti-EGFR biotinilati per catturare EGFR-GFP dai lisati proteici totali. Dopo aver lavato via le proteine non legate, i recettori fosforilati sono etichettati con un anticorpo anti-fosfotirosina (anti-PY)15. La Figura 1B mostra un'immagine dell'array idrofobo, in cui è p...

Il presente protocollo descrive la preparazione del campione e l'analisi dei dati per quantificare la fosforilazione proteica utilizzando un test di pull-down a singola molecola (SiMPull) migliorato.

Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Questo protocollo SiMPull consente una quantificazione della fosforilazione delle proteine migliorando le condizioni di etichettatura e fissazione degli anticorpi, riducendo l'autofluorescenza presente nel canale verde e fornendo robusti algoritmi di analisi a singola molecola. Il vantaggio principale di SiMPull è che ci permette di interrogare lo stato di fosforilazione delle singole proteine intatte. Con questo metodo, possiamo ottenere nuove informazioni che non sono accessibili attraverso tecniche tradizionali, come il western blotting e l'analisi delle specifiche di massa.Abbiamo un team di ricercatori per aiutare a dimostrare il protocollo. In primo luogo, Julian Rojo mostrerà come incidere il piranha sul vetro di copertura. Rachel Grattan mostrerà quindi i passaggi per il rivestimento del vetro di copertura.Ed Elizabeth Bailey mostrerà come disegnare l'array e i campioni di immagine. Per iniziare, il piranha incidere il coperchio scivola agitando delicatamente il becher di reazione ogni cinque minuti per 30 minuti. Neutralizzato la soluzione di piranha aggiungendo gradualmente una base debole.Con un'asta di vetro, trasferire il coperchio inciso in un imbuto Buchner e risciacquare per cinque minuti in acqua doppia distillata. Quindi posizionare il coperchio scivola in un barattolo di vetro Coplin e coprire con metanolo. Sigillare il coperchio con un film sigillante e fare il bagno sonicate per 10 minuti.Dopo la sonicazione, svuotare il metanolo in una bottiglia di vetro. Ripeti questo passaggio con acetone. Risciacquare il coperchio scivola tre volte con acqua doppia distillata nel barattolo Coplin.Scolare l'acqua dagli scivoli di copertura e asciugarli agitando attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen. Posizionare gli slip di copertura in un barattolo coplin asciutto. Quindi aggiungere la soluzione di ammino-silano al barattolo Coplin per eseguire la silanizzazione dell'amminoscivolo di copertura.Coprire e applicare una pellicola sigillante per proteggere dalla luce. Risciacquare il coperchio scivola con metanolo e scartare la soluzione utilizzata. Ancora una volta, risciacquare il coperchio scivola tre volte con acqua doppia distillata per due minuti ciascuno.Tamponare l'umidità in eccesso e asciugare completamente l'aria per 10 minuti. Quindi, disegna l'array di griglie con una penna barriera idrofoba. Contrassegnare un identificatore sulla slitta di copertina per identificare l'orientamento corretto.Dopo che l'inchiostro si asciuga, posizionare il coperchio scivola in una camera umidificata. Sospendere 153 milligrammi di mPEG e 3,9 milligrammi di biotina-PEG in 609 microlitri di bicarbonato di sodio 10 millimolari e vortice. Centrifugare a 10.000 x g da un minuto a temperatura ambiente per rimuovere le bolle.Applicare da 10 a 15 microlitri di questa soluzione per quadrato per coprire completamente l'array senza traboccare. Conservare il coperchio scivola nella camera di umidità al buio per tre o quattro ore a temperatura ambiente. Quindi lavare il coperchio scivola immergendoli per 10 secondi in sequenza in tre bicchieri riempiti con acqua doppia distillata.Rimuovere tutta l'umidità dagli scivoli di copertura utilizzando gas azoto. Conservare il coperchio scivola da una parte all'altra in un tubo conico da 50 millilitri riempito di azoto e sigillare con un film sigillante. Avvolgere il tubo con pellicola sigillante e posizionarlo a meno 20 gradi Celsius.Rimuovere gli array funzionalizzati biotina-PEG dal congelatore ed equilibrarli a temperatura ambiente. Posizionare il coperchio con l'array rivolto verso l'alto su un piatto di coltura tissutale da 100 millimetri rivestito con pellicola sigillante. Incubare ogni quadrato dell'array con 10 milligrammi per millilitro di boroidruro di sodio in PBS per quattro minuti a temperatura ambiente.Lavare tre volte con PBS. Successivamente incubare con 0,2 milligrammi per millilitro di NeutrAvidin in T50 per cinque minuti, seguito da lavaggio tre volte con T50 BSA. Ripetere l'incubazione con due microgrammi per millilitro di anticorpo specifico poi biotinilato in T50 BSA per 10 minuti, seguito da lavaggio.In primo luogo, scongelare mescolare il lisato mediante pipettaggio. Diluire un microlitro del lisato in 100 microlitri di PPI T50 BSA ghiacciato. Incubare il lisato sull'array per 10 minuti, seguito dal lavaggio.Preparare l'anticorpo anti-fostirosina coniugato AF647 in T50 BSA PPI ghiacciato e incubare sull'array per un'ora. Deposita una goccia di petrolio sull'obiettivo. Posiziona la nanogriglia sul palco per l'imaging.Utilizzando la luce bianca trasmessa, concentrarsi sul modello di griglia. Acquisire una serie di 20 immagini della griglia, assicurarsi che i pixel non siano saturi e salvare la serie di immagini come fiduciale. Sfoca la nanogriglia per creare un modello arioso, acquisire una serie di 20 immagini per le calibrazioni del guadagno e salvare l'immagine come guadagno.Quindi acquisire una serie di 20 immagini per l'offset della fotocamera bloccando tutta la luce alla fotocamera e salvare lo sfondo delle immagini. Per acquisire immagini semplici, in primo luogo, pulire l'obiettivo olio e depositare olio aggiuntivo sull'obiettivo. Fissare l'array di slip di copertura sul palco del microscopio.Acquisire immagini per ciascun campione, prima nel canale rosso lontano, seguito da fluorofori a lunghezza d'onda inferiore. Controllare il livello del buffer ogni 30-45 minuti e ricostituire se necessario. Utilizzando questa tecnica, EGFR-GFP è stato catturato da lisati proteici totali.L'autofluorescenza dell'inchiostro idrofobo è stata utilizzata come guida per trovare il piano focale del campione. Le immagini di dati grezzi sono state acquisite con canali spettrali separati sul chip della fotocamera. Una sovrapposizione dei canali verde e rosso lontano è stata ulteriormente esaminata per l'acquisizione dei dati.La registrazione del canale è stata eseguita su immagini acquisite dalla nanogriglia. Una sovrapposizione di immagini fiduciarie mostrava una registrazione incompleta. L'allineamento è stato effettuato applicando una trasformata media ponderata locale sulle coordinate dei canali rosso e verde, che è stata utilizzata per registrare i dati SiMPull successivi.Sono stati inscatolati singoli emettitori sopra il conteggio dei fotoni di sfondo dai canali GFP e AF647 ed è stata eseguita la localizzazione gaussiana per identificare le posizioni. La colocalizzazione di EGFR-GFP in un F647 è stata fatta per identificare i recettori fosforilati. E la percentuale di colocalizzazione è stata utilizzata per determinare la frazione di recettori fosforilati.I rilevamenti di fondo sono stati ridotti quando il vetro inciso piranha è stato trattato con boroidruro di sodio. È stato osservato un robusto legame di EGFR-GFP nel lisato con un legame PY99-AF647 non specifico minimo, mostrando una ritenzione della funzionalizzazione superficiale utilizzando questa tecnica. SiMPull fornisce informazioni sulla fosforilazione delle proteine e può rispondere a una vasta gamma di domande di auto-segnalazione.Questo può migliorare la nostra comprensione della segnalazione sia negli stati normali che in quelli patologici.

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Biochemistry

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