Name: Isolamento dellarteria intrapolmonare e delle cellule muscolari lisce per studiare le risposte vascolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Scopri l'isolamento dell'arteria intrapolmonare e delle cellule muscolari lisce vascolari nel ratto per studiare le risposte vascolari. Questa tecnica di bagno d'organo permette di valutare la vasorilassazione e gli effetti farmacologici in vitro.

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Gli autori desiderano ringraziare il Consiglio Nazionale delle Ricerche della Thailandia, il Centro di eccellenza per l'innovazione in chimica (PERCH-CIC) e la Rete internazionale di ricerca (IRN61W0005) per aver fornito supporto finanziario e il Dipartimento di Fisiologia della Facoltà di Scienze Mediche, Naresuan University, per il supporto delle strutture di ricerca.

Gli esperimenti eseguiti in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Naresuan (NUACUC), numero di protocollo NU-AE620921, per la cura e l'uso di animali per scopi scientifici.
1. Composizione delle soluzioni fisiologiche
<ol><li>Formulare la soluzione di Krebs sciogliendo le sostanze chimiche in acqua distillata per ottenere le concentrazioni finali come segue: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2 e 11 mM glucosio8. Regolare il pH della soluzione a 7,3 con 1 M NaOH e preriscaldare a 37 °C prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la soluzione fredda di Krebs in modo simile a quanto indicato al punto 1.1. da utilizzare come mezzo di isolamento dell'IPA, come descritto nella fase 2.</li>
</ol>2. Isolamento dell'arteria intrapolmonare (IPA)
<ol><li>Anestetizzare ratti Wistar maschi di 8 settimane con un'iniezione intraperitoneale di sodio tiopentale (100 mg/kg)9. Controlla i ratti per la loro reazione agli stimoli dolorosi nel sonno profondo usando una pinza bloccata ai loro piedi, quindi assicurati che i ratti non abbiano una reazione di pull-back del piede prima di eutanasia nel passaggio 2.2.</li>
	<li>Tagliare il torace medio del ratto e il terminale cardiaco con le forbici (dimensione 14 cm). Quindi, individuare la radice del polmone con le forbici (dimensione 14 cm). Raccogliere l'intero polmone tagliando con le forbici e immergerlo nella soluzione fredda di Krebs10,11.</li>
	<li>Tagliare un singolo lobo del polmone con le forbici (dimensione 11 cm) e posizionarlo su una capsula di Petri (dimensioni 9 cm) con il lato mediale / radice del polmone rivolto verso l'alto (Figura 2A, B). Osservare e identificare l'allineamento della vena, dei bronchi e dell'arteria dall'alto verso il basso (Figura 2B).</li>
	<li>Tagliare il bronco longitudinalmente con le forbici (taglia 11 cm). Quindi, utilizzare la pinza (dimensione 11 cm) per afferrare la punta del bronco. Sezionare delicatamente e rimuovere i bronchi e le vene dal polmone. Si noti che l'IPA è sempre anatomicamente allineato sotto il bronco.</li>
	<li>Successivamente, è possibile visualizzare l'IPA principale (Figura 2C). Utilizzare la pinza (dimensione 11 cm) per afferrare la punta dell'IPA e sezionarla con cura dal tessuto polmonare con le forbici (dimensione 11 cm).</li>
	<li>Conservare l'alcool isopropilico isolato in una soluzione fredda di Krebs fino all'installazione del gruppo bagno d'organo (pH 7,3 e temperatura 4 °C)1 1.</li>
</ol>3. Isolamento delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC)
<ol><li>Isolare l'IPA come descritto in precedenza nel passaggio 2. Tagliare longitudinalmente il ramo principale dell'IPA con le forbici (dimensione 11 cm) e tagliarlo a strisce piccole (2 mm) (Figura 3A).</li>
	<li>Immergere le strisce IPA in un mezzo di dissociazione (DM)10,12 contenente 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaH 2 PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM rosso fenolo, 10 mM taurina, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl 2, 11 mM glucosio e 0,16 mM CaCl 2, e regolare il pH a 7,0 con 1 M NaOH. Incubare le strisce per 1 ora a 4 °C in DM contenenti 1 mg/ml di papaina, 0,04% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,4 mM di 1,4-ditiotreitolo (DTT), quindi incubare ulteriormente a 37 °C per 15 minuti. Aggiungere 1 mg/mL di collagenasi di tipo 1A nel DM e incubare ulteriormente a 37 °C per 5 minuti. NOTA: DM è una soluzione utilizzata per preservare la vitalità cellulare. La papaina e la collagenasi di tipo 1A sono enzimi che abbattono le proteine della matrice extracellulare per isolare le singole cellule. BSA è una proteina dell'albumina sierica utilizzata per la stabilizzazione degli enzimi durante lo stoccaggio e le reazioni enzimatiche. Il DTT è un agente riducente utilizzato per stabilizzare e promuovere l'attività degli enzimi durante il processo di isolamento cellulare. La taurina è acido solforico amminico utilizzato per stabilizzare la membrana cellulare e l'integrità cellulare.</li>
	<li>Trasferire i tessuti in DM fresco e disperderli mediante triturazione delicata con una pipetta Pasteur di vetro (Figura 3B). Continuare a triturare fino a quando i VSMC isolati diventano visibili nella soluzione da bagno al microscopio (Figura 3C). NOTA: I VSMC appena isolati possono essere utilizzati per studiare la fisiologia / fisiopatologia vascolare, insieme a varie indagini sperimentali, come la modulazione da parte di agenti farmacologici, l'analisi elettrofisiologica patch-clamp, l'imaging del calcio, ecc. Tuttavia, il presente studio si concentra solo sulla vasorilassazione dell'IPA isolata utilizzando la tecnica del bagno d'organo.</li>
</ol>4. Tecnica del bagno d'organo
<ol><li>Isolare l'IPA come descritto in precedenza nel passaggio 2. Tagliare il ramo principale dell'IPA in anelli di ~ 2 mm di lunghezza (Figura 2D)13.</li>
	<li>Fissare gli anelli IPA nelle camere da bagno degli organi (Figura 4) infilandoli su due fili di acciaio inossidabile del diametro di 40 μm (Figura 2E)11,13,14.</li>
	<li>Collegare fili di acciaio inox montati con anelli IPA ai trasduttori di forza isometrici collegati al dispositivo di acquisizione dati e al sistema informatico installato con l'apposito software fisiologico per la registrazione e l'analisi dei dati, quindi sollevare delicatamente la tensione dell'anello IPA a 1 g11.</li>
	<li>Lasciare che i segmenti del vaso si equilibrino per circa 45 minuti a una tensione di riposo di 1 g. Durante il periodo di equilibrio, assicurarsi che la soluzione di Krebs venga cambiata regolarmente ogni 15 minuti. Dopo questo periodo di equilibrio, testare la vitalità dei vasi misurando la loro vasocostrizione in una soluzione extracellulare K+ (80 mM) ad alta concentrazione contenente 47,4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2 e 11 mM glucosio 10,11.</li>
	<li>Valutare la presenza o l'assenza di endotelio calcolando la risposta di rilassamento all'acetilcolina (1 x 10−5 M) in anelli precontratti con fenilefrina (PE, 1 x 10−5 M) (Si noti che le contrazioni vascolari rimangono stabili per 1 ora dopo l'aggiunta di PE). Considerare gli anelli come endotelio-intatti se quantificano per più del 70% di rilassamento (Figura 5A). Se hanno meno del 10% di rilassamento, considerare gli anelli come denudati con endotelio13 (Figura 5B). Rimuovere meccanicamente l'endotelio strofinando delicatamente all'interno del vaso con un piccolo filo per indurre la denudazione.</li>
	<li>Equilibrare nuovamente gli anelli arteriosi per 30 minuti prima dell'inizio degli esperimenti di prova.</li>
</ol>5. Risposta vasorilassante all'estratto vegetale
<ol><li>Studiare l'effetto rilassante dell'estratto vegetale precontraendo gli anelli IPA con PE (1 x 10−5 M).</li>
	<li>Quindi, aggiungere con cautela l'estratto vegetale (1-1.000 μg / ml) cumulativamente agli anelli intatti dell'endotelio e agli anelli denudati con endotelio per indurre la vasorilassazione (Figura 6A, B) e acquisire una curva di risposta dipendente dalla concentrazione (Figura 6C).</li>
	<li>Assicurarsi che anche l'effetto del dimetilsolfossido (DMSO) utilizzato come solvente sia valutato in modo simile per fungere da controllo negativo (Figura 6C).</li>
</ol>6. Meccanismo di vasorilassamento indotto da estratti vegetali attraverso l'endotelio
<ol><li>Valutare il meccanismo d'azione vasorilassante dell'estratto vegetale attraverso l'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS), la ciclo-ossigenasi (COX)13 e le vie del fattore iperpolarizzante derivato dall'endotelio (EDHF) incubando gli anelli IPA intatti dall'endotelio per 30 minuti con i seguenti inibitori (Figura 7A): 1 x 10−4 M NG-nitro-L-arginina estere metilico (L-NAME, un inibitore di eNOS)9, 1 x 10−5 M indometacina (un inibitore della COX)9, o una combinazione di 1 x 10−7 M apamin (un piccolo calcio-antagonista del potassio attivato) e 1 x 10−7 M caribdotossina (un bloccante dei canali del potassio attivato dal calcio a conduttanza intermedia e grande), prima di indurre contrazioni di IPA con 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Quindi, dopo che le contrazioni a PE si sono stabilizzate, aggiungere concentrazioni cumulative (0,1-1.000 μg / ml) dell'estratto vegetale.</li>
	<li>Presentare gli effetti dell'estratto vegetale come rilassamento percentuale degli anelli IPA in presenza di inibitori rispetto alla risposta degli anelli IPA senza inibitori (Figura 7B-D) e costruire la curva concentrazione-risposta.</li>
</ol>7. Meccanismo di vasorilassamento indotto dall'estratto vegetale attraverso i canali K+ della muscolatura liscia vascolare
<ol><li>Anelli IPA denudati con endotelio pre-incubati per 30 minuti con 1 x 10−3 M 4-amminopiridina (4-AP), un bloccante del canale del potassio voltaggio-dipendente (KV) (Figura 8A), 1 x 10−5 M glibenclamide, un bloccante del canale del potassio sensibile all'ATP (KATP), o 1 x 10−7 M iberiotossina, un bloccante dei canali K+ attivatida Ca 2+ di grande conduttanza (KCa), prima di indurre contrazioni di IPA con 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Quindi, aggiungere concentrazioni cumulative dell'estratto vegetale.</li>
	<li>Presentare gli effetti dell'estratto vegetale come rilassamento percentuale degli anelli IPA con inibitore rispetto agli anelli IPA senza inibitore (Figura 8B-D) e costruire la curva concentrazione-risposta.</li>
</ol>8. Meccanismo di vasorilassamento indotto da estratti vegetali attraverso l'inibizione dell'afflusso extracellulare di calcio (Ca2+) nei VSMC
<ol><li>Anelli IPA denudati con endotelio pre-incubati per 30 minuti in una soluzione di Krebs priva di Ca2+ contenente 1 mM di glicole etilenico-bis (2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA) (Figura 9A).</li>
	<li>Quindi, sostituire la soluzione di bagno con una soluzione Ca2 + libera-80 mM K+ per 10 minuti per depolarizzare i VSMC, che quindi aprono i VOCC (Figura 9A).</li>
	<li>Aggiungere cumulativamente CaCl2 (0,01-10 mM) per indurre vasocostrizione dell'IPA e costruire la curva concentrazione-risposta (Figura 9A).</li>
	<li>Ripetere questo protocollo negli stessi anelli IPA ma pre-incubarli con estratto vegetale o 1 μM di nicardipina (bloccante dei canali Ca 2+ di tipo L) in Ca2+ contenente 80 mM di soluzione K+ per 10 minuti seguita dall'aggiunta cumulativa di CaCl28.</li>
	<li>Infine, confrontare la risposta contrattile con la contrazione massima precedentemente indotta dalle sfide di controllo CaCl2 (Figura 9B).</li>
</ol>9. Meccanismo di vasorilassamento indotto dall'estratto vegetale attraverso l'inibizione del rilascio intracellulare di calcio (Ca2+) dal reticolo sarcoplasmatico (SR)
<ol><li>Esporre anelli IPA denudati con endotelio a una soluzione di 80 mM K+ per circa 5 minuti, depolarizzando i VSMC, aprendo i COVC e infine generando il carico di Ca2+ nell'SR (Figura 10A).</li>
	<li>Sostituire la soluzione di bagno per 10 minuti con una soluzione di Krebs priva di Ca2+ contenente 1 mM di EGTA (Figura 10A).</li>
	<li>Quindi, sfidare gli anelli IPA con 1 x 10−5 M PE, che attiva la via della fosfolipasi C/IP3 , rilasciando infine Ca2+ dall'SR ed evocando una contrazione transitoria dell'IPA (Figura 10A).</li>
	<li>Ripetere lo stesso protocollo per accertare anche le contrazioni transitorie all'EP.</li>
	<li>Sfidare nuovamente gli anelli IPA con una soluzione di 80 mM K+ per circa 5 minuti, quindi sostituire la soluzione da bagno con una soluzione di Krebs priva di Ca2+ contenente 1 mM EGTA con o senza estratto vegetale per 10 minuti.</li>
	<li>Ancora una volta, sfida gli anelli IPA con 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Confrontare le contrazioni IPA indotte da PE tra la condizione con e senza l'estratto vegetale (Figura 10B).</li>
</ol>10. Analisi statistica
<ol><li>Esprimere i risultati come media ± SEM. Confrontare questi valori utilizzando il t-test di Student o analizzare mediante un'analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey-Kramer utilizzando un software statistico adatto. Considera le differenze a p < 0,05 come statisticamente significative. Qui, c'erano n = 6 ratti / protocollo sperimentale. NOTA: La registrazione della vasocostrizione e del vasorilassamento può essere valutata con un apposito software installato sul computer. Ad esempio, la Figura 5A mostra che, quando i vasi sanguigni sono stimolati dal PE che causa la contrazione, questo potrebbe essere osservato dall'aumento della tensione del tracciato originale. Il tracciamento si stabilizzerà in 20-30 minuti, che è considerato una contrazione al 100%. Successivamente, l'ACh stimola i vasi sanguigni, causando rilassamento, che potrebbe essere osservato dalla diminuzione della tensione del tracciato originale. Pertanto, la tensione ridotta viene calcolata come percentuale rispetto alla contrazione del 100%.</li>
</ol>

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<li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Traditional+and+Complementary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li>
<li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243(2019).</li>
<li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167(2000).</li>
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<li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent%2C+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li>
<li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li>
<li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo manoscritto, descriviamo la tecnica per l'isolamento di IPA e VSMC di ratto. Diversi protocolli sperimentali sono stati impiegati per studiare la risposta vascolare dell'IPA in vitro, che possono essere utilizzati per caratterizzare l'effetto farmacologico e le basi meccanicistiche della vasorilassazione dell'IPA indotta dall'estratto vegetale.
Per quanto riguarda l'azione vasodilatatrice endotelio-dipendente dell'estratto vegetale, sono stati impiegati vari bloccanti come L...

La vascolarizzazione polmonare è un sistema vascolare a bassa pressione in cui la funzione principale è quella di fornire sangue deossigenato all'area di scambio di gas dei polmoni. Le arterie polmonari nei polmoni sono disposte in rami paralleli all'albero bronchiale, formando in definitiva una vasta rete di capillari che è continua su diversi alveoli e, infine, si uniscono in venule e vene. Il tono vascolare dell'arteria polmonare è controllato da diversi fattori, che coinvolgono l'interazione tra l'endotelio e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC)1.
In questo studio, ci concentriamo sulla vasorilassazione endotelio-dipendente e indipendente dell'arteria intrapolmonare (IPA). Per quanto riguarda la vasorilassazione endotelio-dipendente, vari meccanismi che si verificano sulla superficie delle cellule endoteliali potrebbero aumentare la concentrazione intracellulare di Ca2+ (ad esempio, l'acetilcolina [ACh] si lega al recettore muscarinico [M3]), portando alla formazione di ossido nitrico (NO), prostaciclina (PGl2) e fattore iperpolarizzante derivato dall'endotelio (EDHF) (Figura 1 ). L'NO è il principale fattore rilassante derivato dall'endotelio sintetizzato dalla L-arginina mediante ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS)2, che poi si dissocia dalle cellule endoteliali ai VSMC (Figura 1) e stimola l'enzima solubile guanylyl cyclase (sGC); questo enzima trasforma la guanosina trifosfato (GTP) in guanosina monofosfato ciclico (cGMP), che attiva la protein chinasi G (PKG) e riduce i livelli citosolici di Ca2+, causando così vasorilassamento (Figura 1). PGl2 è sintetizzato dalle cellule endoteliali attraverso la via della ciclo-ossigenasi (COX) 3,4. Si lega con il recettore della prostaciclina (IP) sui VSMC e stimola l'enzima adenilil ciclasi (AC), che converte quindi l'adenosina trifosfato (ATP) in adenosina monofosfato ciclico (cAMP) (Figura 1)3,4. cAMP attiva la proteina chinasi A (PKA), riducendo i livelli citosolici di Ca2+ e causando vasorilassamento5 (Figura 1). La via EDHF partecipa anche alla vasorilassamento endotelio-dipendente attraverso vari mediatori endoteliali ed eventi elettrici. L'attivazione della via EDHF porta all'iperpolarizzazione dei VSMC, chiudendo così i canali Ca 2+ (COVC) azionati in tensione, riducendo i livelli intracellulari di Ca2+ e inducendo vasorilassamento6. La vasorilassazione endotelio-indipendente avviene direttamente sui VSMC attraverso diversi meccanismi, come la riduzione del livello intracellulare di Ca 2+, l'inibizione della miosina chinasi a catena leggera (MLCK), l'attivazione della fosfatasi della catena leggera della miosina (MLCP) e la riduzione della sensibilità di Ca2+ al macchinario contrattile delle VSMC. In questo studio, ci concentriamo sulla vasorilassamento causato dall'apertura di vari canali K+, il blocco dei COVC e l'inibizione del rilascio di Ca 2+ dal reticolo sarcoplasmatico7, che porta alla riduzione dei livelli intracellulari di Ca 2+, diminuendo così la fosforilazione della catena leggera della miosina VSMC e il legame miosina-actina o la formazione di ponti incrociati, rispettivamente, alla fine con conseguente vasorilassamento.
La tecnica per valutare le misure di vasocostrizione e vasorilassamento nell'IPA isolata è ben consolidata per i roditori, ma i dati variavano a seconda dei protocolli sperimentali. Il presente studio descrive il metodo utilizzato per valutare le reattività vascolari dei preparati IPA di ratto in vitro, che sono stati effettuati in assenza di fattori esterni che modulano la risposta vascolare in vivo, come segnali nervosi, ormoni, citochine, pressione sanguigna, ecc.
Abbiamo impiegato diversi protocolli sperimentali utilizzando l'estratto vegetale come esempio per studiare le reattività vascolari dell'IPA. Vari bloccanti (Figura 1) sono stati utilizzati per identificare i meccanismi di vasorilassamento endotelio-dipendente e indipendente indotto dall'estratto vegetale. Tuttavia, gli stessi protocolli possono essere adattati per valutare le risposte vascolari dell'IPA a qualsiasi farmaco, estratto o fitochimico utilizzato per il trattamento di varie patologie polmonari.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632 CAS NO. 348-12-3</td><td></td></tr><tr><td>4-amminopiridina (4-AP)</td><td>Aldrich Chemical</td><td>A78403 CAS NO. 504-24-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetilcolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625 CAS NO. 60-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Apamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9459 CAS NO. 24345-16-2</td><td></td></tr><tr><td>Bovino albumina sierica (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153 CAS NO. 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Calcio coride</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA960 CAS NO. 1707055184</td><td></td></tr><tr><td>Charybdotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7802 CAS NO. 95751-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891 CAS NO. 9001-12-1</td><td>Da Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>D(+)- Glucosio monoidrato</td><td>Millipore Corporation</td><td>K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 CAS NO. 67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis (2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889 CAS NO. 67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 CAS NO. 60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Pinze 11 cm.</td><td>Pinze Dumoxel</td><td></td><td></td> antiruggine</tr> <tr><td>14 cm.</td><td>Dumoxel-Glibenclamide</td><td></td><td></td> inossidabile</tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6039 CAS NO. 16673-34-0</td><td></td></tr><tr><td>Programma GraphPad Prism</td><td>Versione software 5.0 (San Diego, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375 CAS NO. 7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotossina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5904 CAS NO. 1002546960</td><td>ricombinante da Mesobuthus tamulus</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378 CAS NO. 53-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Labchart Program</td><td>Software versione 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Ajax Finechem</td><td>296 CAS NO. 1506254995</td><td></td></tr><tr><td>Maschi Wistar ratti</td><td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG-nitro-L-arginina metil estere (L-NAME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751 CAS NO. 51298-62-5</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510 CAS NO. 54527-84-3</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'organo 15 mL.</td><td>-</td><td>-</td><td>Ordine specifico da parte dei ricercatori</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762 CAS NO. 9001-73-4</td><td>DaPapaya Latex</td></tr><tr><td>Fenale rosso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5530 CAS NO. 34487-61-1</td><td></td></tr><tr><td>Fenilefrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126 CAS NO. 61-76-7</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Kemaus</td><td>KA383 CAS NO. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogenofosfato di potassio</td><td>Aldrich Chemical</td><td>EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>S+A2:E36odium chloride</td><td>Kemaus</td><td>KA465 CAS NO. 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Forbici 11 cm.</td><td>Forbici in acciaio inox</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Spall 14 cm.</td><td>Fiocco</td><td></td> bicarbonato di sodio inossidabile <td></td></tr><tr><td></td><td>Ajax Finechem</td><td>475 CAS NO. 912466</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogenofosfato di sodio</td><td>Aldrich Chemical</td><td>33,198-8 CAS NO. 7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Ajax Finechem</td><td>482 CAS NO. 1506196602</td><td></td></tr><tr><td>Sodium thiopental</td><td>Anesthal</td><td>JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625 CAS NO. 107-35-7</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath WBU 45</td><td>Memmert</td><td>2766 CAS NO. -</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dell'arteria intrapolmonare e delle cellule muscolari lisce per studiare le risposte vascolari

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

L'arteria intrapolmonare (IPA) e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) isolate dai polmoni di ratto possono essere utilizzate per studiare i meccanismi sottostanti di vasocostrizione e vasorilassamento. Dopo aver isolato IPA e VSMC, le caratteristiche delle risposte vascolari in condizioni fisiologiche e patologiche possono essere valutate in assenza di fattori estrinseci come segnali nervosi, ormoni, citochine, ecc. Pertanto, l'IPA e i VSMC fungono da modelli eccellenti per lo studio della fisiologia / fisiopatologia vascolare, insieme a varie indagini sperimentali, come la modulazione da parte di agenti farmacologici, l'analisi elettrofisiologica patch-clamp, l'imaging del calcio, ecc. Qui, abbiamo usato una tecnica per isolare l'IPA per studiare le risposte vascolari in una configurazione di bagno d'organo. I segmenti di IPA sono stati montati sulla camera da bagno dell'organo tramite fili intraluminali e stimolati da vari agenti farmacologici. I cambiamenti nel tono vascolare IPA (cioè vasocostrizione e vasorilassamento), sono stati registrati utilizzando un trasduttore di forza isometrico e un programma software di analisi dei dati fisiologici. Abbiamo implementato diversi protocolli sperimentali, che possono essere adattati per studiare i meccanismi di vasorilassamento/vasocostrizione per lo studio delle attività farmacologiche di farmaci fitochimici o sintetici. I protocolli possono anche essere utilizzati per valutare il ruolo dei farmaci nella modulazione di varie malattie, tra cui l'ipertensione arteriosa polmonare. Il modello IPA ci permette di studiare la curva concentrazione-risposta, che è cruciale nella valutazione dei parametri farmacodinamici dei farmaci.

Il protocollo nel presente studio è stato sviluppato per determinare le condizioni sperimentali ottimali per misurare i fenomeni fisiologici osservati nelle risposte vascolari di preparati isolati di IPA. Gli esperimenti pilota sono stati eseguiti per descrivere i potenziali risultati che aiutano la comprensione degli effetti vascolari e delle basi meccanicistiche dell'azione vasorilassante dell'estratto vegetale, come segue.
Effetto vasorilassante dell'estratto vegetale Co...

Le risposte vascolari della circolazione polmonare arteriosa possono essere esplorate utilizzando l'arteria intrapolmonare (IPA) e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC). Il presente studio descrive in dettaglio l'isolamento dell'IPA e i protocolli utilizzati per studiare la vasorilassazione in risposta a stimoli fisiologici.

Isolamento dell'arteria intrapolmonare e delle cellule muscolari lisce per studiare le risposte vascolari

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Questo studio descrive l'isolamento dell'arteria intrapolmonare del ratto e delle cellule muscolari lisce vascolari. Sono stati impiegati diversi protocolli sperimentali, come l'uso della tecnica del bagno d'organo per studiare la risposta vascolare dell'arteria intrapolmonare. Le arterie intrapolmonari e le cellule muscolari lisce vascolari sono modelli eccellenti per studiare la fisiologia vascolare e la fisiopatologia.Gli adattamenti di questa tecnica potrebbero valutare le risposte vascolari di qualsiasi farmaco, estratto o fitochimico. Il montaggio dell'anello arterioso intrapolmonare isolato in un bagno d'organo consente l'uso di arterie intrapolmonari isolate per valutare il ruolo di un farmaco nella modulazione di varie malattie, tra cui l'ipertensione polmonare. I protocolli sperimentali sono tecnicamente fattibili, ma i passaggi cruciali sono complicati ed essenziali per il successo, quindi avere una dimostrazione visiva lo rende più facile da capire e seguire.A dimostrare la procedura sarà Kittiwoot To-on, uno studente di master in fisiologia del Laboratorio dell'Unità di Ricerca Cardiovascolare, Dipartimento di Fisiologia, Facoltà di Scienze Mediche, Naresuan University. Inizia tagliando un singolo lobo del polmone con forbici da 11 centimetri e posizionandolo su una piastra di Petri di nove centimetri con il lato mediale, o radice del polmone, rivolto verso l'alto. Osservare e identificare l'allineamento della vena, dei bronchi e dell'arteria dall'alto verso il basso.Tagliare il bronco longitudinalmente con le forbici. Quindi usa la pinza da 11 centimetri per afferrare la punta del bronco. Sezionare delicatamente e rimuovere i bronchi e le vene dal polmone.Utilizzare la pinza per afferrare la punta dell'arteria intrapolmonare e sezionarla attentamente dal tessuto polmonare con le forbici. Mantenere l'arteria intrapolmonare isolata in soluzione fredda di Krebs fino a quando non viene impostato il gruppo del bagno dell'organo. Dopo aver isolato l'arteria intrapolmonare, tagliare longitudinalmente il ramo principale dell'arteria intrapolmonare con le forbici da 11 centimetri e tagliare a strisce di due millimetri.Immergere le strisce dell'arteria intrapolmonare in DM, quindi incubare le strisce per un'ora a quattro gradi Celsius in DM contenenti un milligrammo per millilitro di papaina, 0,04% BSA e 0,4 millimolare DTT. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere un milligrammo per millilitro di collagenasi di tipo IA nel DM e nuovamente incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Trasferire i tessuti in DM fresco e disperderli mediante triturazione delicata con una pipetta Pasteur di vetro. Continuare a triturare fino a quando le cellule muscolari lisce vascolari isolate diventano visibili nella soluzione di bagno al microscopio. Isolare l'arteria intrapolmonare come dimostrato in precedenza e tagliare il ramo principale dell'arteria intrapolmonare in anelli di circa due millimetri di lunghezza.Fissare gli anelli delle arterie intrapolmonari nelle camere da bagno degli organi infilandoli su due fili di acciaio inossidabile di 40 micrometri di diametro. Collegare fili di acciaio inox montati con anelli di arterie intrapolmonari ai trasduttori di forza isometrici collegati al dispositivo di acquisizione dati e al sistema informatico installato con l'idoneo software fisiologico per la registrazione e l'analisi dei dati. Quindi aumentare delicatamente la tensione dell'anello dell'arteria intrapolmonare a un grammo.Lasciare che i segmenti del vaso si bilancino per circa 45 minuti a una tensione di riposo di un grammo. Durante il periodo di equilibrio, assicurarsi che la soluzione di Krebs venga cambiata regolarmente ogni 15 minuti. Dopo l'equilibrazione, testare la vitalità dei vasi misurando la loro vasocostrizione a soluzione di potassio extracellulare elevata.Valutare la presenza o l'assenza di endotelio calcolando la risposta di rilassamento all'acetilcolina in anelli precontratti con PE. Rimuovere meccanicamente l'endotelio strofinando delicatamente l'interno del vaso con un piccolo filo per indurre la denudazione. Quindi equilibrare gli anelli arteriosi per 30 minuti prima dell'inizio degli esperimenti di prova. Studiare l'effetto rilassante dell'estratto vegetale precontraendo gli anelli dell'arteria intrapolmonare con PE. Quindi aggiungere con attenzione da 0,1 a 1000 microgrammi per millilitri di estratto vegetale cumulativamente agli anelli intatti dell'endotelio e agli anelli denudati con endotelio per indurre vasorilassamento e acquisire una curva di risposta dipendente dalla concentrazione.Assicurarsi che anche il DMSO efficace utilizzato come solvente sia valutato in modo simile per fungere da controllo negativo. Valutare il meccanismo d'azione vasorilassante dell'estratto vegetale come menzionato nel testo manoscritto. Quindi, dopo che le contrazioni per stabilizzare il PE, aggiungere concentrazioni cumulative dell'estratto vegetale.Presentare gli effetti dell'estratto vegetale come rilassamento percentuale degli anelli dell'arteria intrapolmonare in presenza di inibitori rispetto alla risposta degli anelli dell'arteria intrapolmonare senza inibitori e costruire la curva di risposta alla concentrazione. Nell'arteria intrapolmonare intatta dell'endotelio, l'estratto vegetale ha suscitato una risposta di vasorilassamento dipendente dalla concentrazione. L'eradicazione dell'endotelio ha ridotto profondamente la vasorilassazione indotta dall'estratto vegetale come riflesso dall'aumento della CE50 di 2,2 volte, l'inibizione di eNOS e EDHF ha evidentemente diminuito la risposta vasorilassante all'estratto vegetale.Ciò ha spostato la curva di risposta alla concentrazione verso destra e aumentato l'EC50 senza alterare i valori E max. Al contrario, l'indometacina non ha mostrato alcun effetto sulla risposta vasorilassante all'estratto vegetale. Negli anelli dell'arteria intrapolmonare denudati dall'endotelio, i bloccanti dei canali del potassio attivati dal calcio hanno diminuito la risposta vasorilassante all'estratto vegetale.Mentre i bloccanti dei canali del potassio voltaggio-dipendenti o sensibili all'ATP non hanno mostrato alcuna deviazione. La preincubazione con l'estratto vegetale ha inibito la contrazione indotta dal cloruro di calcio. Gli anelli dell'arteria intrapolmonare denudati dall'endotelio preincubati con soluzione di Krebs priva di calcio e PE hanno reso una contrazione transitoria.Rispetto al veicolo, gli estratti vegetali hanno ridotto significativamente la contrazione indotta dall'EP. Durante la procedura, è necessario identificare chiaramente la vena, i bronchi e l'arteria nella fase iniziale. Tagliare o danneggiare l'arteria ridurrà la sua lunghezza e influenzerà le risposte vascolari. Questa tecnica può essere adattata per studiare composti che potrebbero servire come prototipi per il trattamento delle malattie vascolari polmonari come l'ipertensione arteriosa polmonare.

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