Indagine sugli effetti attenuanti della somministrazione di Bacillus cereus sulla colite attraverso la modulazione del microbiota intestinale

Questo protocollo consente di valutare l'effetto regolatore bidirezionale dell'integrazione probiotica sulla salute e di ottenere risultati stabili e riproducibili. È stato stabilito un modello alternativo di colite indotta da DSS utilizzando topi pseudo germ free al fine di evitare alcune limitazioni di laboratorio nell'utilizzo di topi germ free come recettori per i probiotici. Per esplorare gli effetti benefici dei probiotici in questa tecnica, si tratta di un approccio promettente per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento per alleviare i sintomi dei disturbi infiammatori cronici associati.

Per iniziare, prepara un cocktail di antibiotici sciogliendo ampicillina, neomicina solfato, metronidazolo e vancomicina in acqua potabile. Dopo la completa dissoluzione, conservare le soluzioni a quattro gradi Celsius. Metti le soluzioni del cocktail antibiotico in una bottiglia d'acqua.

Assicurati di utilizzare bottiglie marroni o avvolgi le bottiglie con un foglio di alluminio per proteggere le soluzioni antibiotiche dalla luce. Posiziona la bottiglia sopra la gabbia del topo. Per ottenere una soluzione di destrano solfato di sodio al 2,5%, sciogliere 2,5 grammi di DSS in 100 millilitri di acqua distillata.

Sostituire l'acqua potabile con la soluzione DSS al 2,5% nel gruppo di topi modello di colite. Per valutare l'effetto positivo del B cereus sull'alleviamento della colite, assegnare in modo casuale i topi ai seguenti tre gruppi, il gruppo di controllo, il modello di colite indotta da DSS e l'integrazione probiotica di B cereus per topi indotti da DSS. Per esplorare il ruolo del microbiota intestinale nella regolazione degli effetti probiotici di B cereus sulla colite indotta da DSS, assegnare casualmente i topi ai seguenti tre gruppi, ABX/controllo, ABX/DSS e ABX/B cereus più DSS.

Registrare il peso corporeo dei topi come peso basale dopo la somministrazione del cocktail di antibiotici. Trattare immediatamente il maschio C 57 BL sei topi con una soluzione di DSS al 2,5% in acqua potabile per sette giorni. Preparare otto provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri riempite con 900 microlitri di soluzione fisiologica normale sterile.

Pipettare 100 microlitri di B cereus di crescita logaritmica e sciogliere in 900 microlitri di soluzione fisiologica normale sterile. Diluire in serie il B cereus utilizzando delle provette. Piastra 40 microlitri di ciascuna diluizione sulla rispettiva piastra di agar LB etichettata con il rapporto di diluizione.

Ripetere tre volte per ogni rapporto di diluizione. Coltivare le piastre in un incubatore a temperatura costante a 37 gradi Celsius per 16 ore. Selezionare le piastre con circa 20-70 colonie per il conteggio.

Dopo la quantificazione del B cereus, raccogliere un millilitro di terreno di B cereus contenente una volta per 10 fino alla nona CFU e centrifugare a 8.000 g per 10 minuti. Quindi lavare le cellule batteriche due volte con acqua sterile per centrificazione a 8.000 G per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Diluire il B cereus concentrato con soluzione fisiologica sterile a una concentrazione finale di due volte 10-ottava CFU per 200 microlitri.

Pipettare ripetutamente la diluizione su e giù per ottenere una sospensione dispersa di B cereus. Pulire l'esterno dell'ago della sonda gastrica con etanolo al 70% e mantenere la corretta applicazione della dose. Per trattenere i topi, prendili per la coda e afferra saldamente la pelle flaccida della schiena con l'estremità della coda fissata tra le ultime due dita del conduttore.

Mantieni i mouse in posizione verticale. Quindi inserire l'ago della sonda gastrica con attenzione e delicatamente attraverso la bocca nell'esofago. Somministrare la soluzione di B cereus, ritirare delicatamente l'ago e rimettere il topo nella sua gabbia.

Misurare il peso corporeo dei topi ogni giorno e raccogliere immediatamente i campioni di feci in una provetta da centrifuga sterilizzata. Determinare il sangue occulto fecale con la carta del test del sangue occulto nelle feci. Raccogliere 10 milligrammi di campione di feci su un bastoncino applicatore.

Metti il campione sulla scheda di prova e applica una sottile sbavatura sulla carta. Aprire il lembo posteriore e applicare lo sviluppatore sullo striscio. Fissare i topi in posizione supina sul tavolo operatorio e aprire la cavità peritoneale.

Separare chirurgicamente l'intero colon e misurare la lunghezza con un righello. Quindi lavare delicatamente il colon con una siringa da cinque millilitri riempita con PBS pre-raffreddato. Decerare e idratare le sezioni del colon.

Quindi, colora le sezioni del colon con ematossilina ed eosina. Lasciando che due sperimentatori indipendenti valutassero i punteggi istologici del campione al microscopio ottico, la colorazione con ematossilina ed eosina ha rivelato che il tessuto del colon dei topi modello per la colite presentava perdita di cripta, danno alle cellule caliciformi, infiltrazione di cellule infiammatorie e perdita di epitelio. Il trattamento con B cereus ha migliorato il danno istopatologico indotto dal DSS.

I punteggi istopatologici dei topi con colite erano significativamente più alti rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, i punteggi istopatologici nel gruppo B cereus erano significativamente più bassi rispetto ai topi con colite. I topi sono stati assegnati in modo casuale in tre gruppi, la perdita di peso corporeo, i punteggi DAI e i punteggi istopatologici erano più alti e la lunghezza del colon era più corta nel gruppo ABX/DSS rispetto ai topi nel gruppo ABX/controllo.

La perdita di peso corporeo, la lunghezza del colon, i punteggi DAI e i punteggi istopatologici non erano statisticamente diversi tra i gruppi ABX/DSS e ABX/B cereus più DSS. I risultati attuali suggeriscono indirettamente che il microbiota intestinale svolge un ruolo chiave negli effetti positivi del B cereus sulla colite. Uno dei passaggi più importanti è l'utilizzo del Bacillus cereus con il metodo della sonda gastrica per costruire il modello di colite nei topi.

Il trattamento del Bacillus cereus ha eliminato la colite indotta dalla DSS, che ha portato a una base per lo studio di follow-up dei probiotici per il trattamento della colite.